primer premier5引物设计步骤
引物是在PCR反应中用于扩增目标DNA片段的短链寡核苷酸序列。Primer Premier 5是一款常用的引物设计软件，以下是引物设计的一般步骤：
1. 目标序列准备：将目标DNA序列输入到Primer Premier 5软件中。确保序列准确无误，并确定要扩增的目标区域。
2. 引物设计参数设置：根据实验需求和PCR反应条件，设置引物设计的相关参数。包括引物长度、引物的GC含量、引物间的碱基对数目等。
3. 引物设计策略选择：根据需求选择合适的引物设计策略，如末端限制酶切位点、避免引物间的二聚体形成等。
4. 引物设计和评估：软件将自动生成多个候选引物序列，并根据一定的评估标准对其进行评估，包括引物的互补性、引物之间的二聚体形成、GC含量等。
5. 引物的选择和优化：根据评估结果选择一个或多个最合适的引物序列。根据需要，可以对引物进行进一步优化，如修改引物长度、GC含量、碱基组成等。
6. 引物合成和实验验证：根据设计的引物序列进行引物合成，并进行PCR 实验验证引物的扩增效果和特异性。
引物设计是PCR实验中至关重要的步骤，引物的质量和合适性直接影响PCR 反应的效果。Primer Premier 5软件提供了便捷的引物设计工具和功能，可以帮助研究人员高效地设计和评估引物序列。
使用Oligo 6和Primer Premier 5.0等软件设计PCR引物 张新宇 （中国医科院肿瘤研究所，北京100021） 电子邮件: zhangxy@https://www.doczj.com/doc/3819240228.html, 在当今分子生物学研究中，PCR技术已成为使用最多，最广泛的技术之一。而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。在PCR扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。要想扩增出理想的目的片断，一般都得通过正确设计PCR引物。也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片段作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下），引物二聚体带（引物与引物之间形成稳定二聚体）等等。 现在PCR引物设计都通过计算机软件进行。生物信息学发展至今日，具有引物设计功能的软件有很多，其中大部分是免费软件，可直接从网上下载，安装并运行。这类软件大都简单易用，但其引物设计功能一般不很强，通过它们设计的引物常常不尽如人意，而专门进行引物设计的商业版软件功能强大，但使用起来不太容易。本文就这一问题进行探讨。 引物设计的原则 引物设计有几条基本原则： 首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。 围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值(melting temperature)，ΔG值(internal stability)，引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin），错误引发位点（false priming site），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点： 1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延 伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。 2.引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点 的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 3.引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含 量不能相差太大。 4.引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右。 5.ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈 正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG 值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。 6.可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引 发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。7.引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降
Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：
引物设计的原则 引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（p roduct length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(inte rnal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大[2][5]。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest nei ghbor method) [6][7]。 6. ?G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?G 值相对较高的引物。引物的3’端的?G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且
一降钙素基因相关肽(CGRP)是由降钙素Cal/CGRP基因表达，是具有强大的扩张血管作用的生物活性多肽。它不仅改善血流动力学，在全身血压、局部血流灌注等调控中具有重要作用，而且具有拮抗内皮素-1（ET-1）的血管收缩效应，调节T、B淋巴细胞功能，并可能参与了内毒素休克和细胞凋亡的发病机制。降钙素基因相关肽(CGRP)在痛觉的产生、传导和调节等方面可能起着重要作用 二 引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 LEFT PRIMER 108 20 60.02 45.00 7.00 0.00 ACAGCCTGGCTTAGCAAAAA RIGHT PRIMER 272 20 60.04 60.00 3.00 1.00 GGATTACCTCTGGGGCTCTC SEQUENCE SIZE: 698 INCLUDED REGION SIZE: 698 1 TGTGGCACAGATGCTCGTGCCACCTCATTACTTCCTGAAACCACCAGCTTATCGCCCAAC
Primer5.0中文使用说明key 5685 Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计，评估的软件，和Plasmid Premier2.02一起是该公司推出的最新的软件产品。其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif）。这里我们主要介绍其引物设计功能，其他功能的介绍请参看Plasmid Premier2.02。 打开程序首先进入的是序列编辑参看，与Plasmid Premier相比， 其多了一个语音校正的功能，即在输入序列的时候，程序自动将碱基读出，以便 用户进行校正，保证输入的正确和快速。 点击该界面的按钮即可进入到程序的引物设计窗口。 该界面共分为四层，最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各 种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑；右边是观察两个引物在 模板上结合位置的直观图以及对正链还是负链引物进行选择；第二层是显示模板 和引物序列及二者间的配对情况的显示；第三层是显示两个引物的各种参数，包 括给引物的打分，引物以及产物的起始位置、长度、Tm值、GC％消光系数、简 并性；最后一层是给出的有关于引物的二聚体结构、发卡结构、错配情况和引物 间二聚体结构的预测，左边是显示是否存在以上各种对PCR扩增有影响的结构， 右边显示的是这些结构的位置，结构细节和稳定能，利用这些参数可以对引物作 出可靠的评价。
下面是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。 并通过来点击按钮来设置一些搜寻参数： 这些参数包括引物的Tm值，GC比，有简并性碱基，3’端稳定性，引物的稳定性，重复序列，二聚体/发卡结构和与模板及可能的杂质DNA（需要从另外的序列文件中读入）之间的错配情况，这些参数的设定可以根据要求变化，程序本身根据一定的标准分成从极高严谨性到极低严谨性5个档次。该程序对引物的自动搜索过程是采用的排除法，根据用户设定的引物范围和产物长度所规定区域内，所有的符合设定的引物长度的寡核苷酸都被视为可能的引物，然后根据以上各个参数逐步去除不符合条件的寡核苷酸，经过这种层层剔除的筛选，最终找到符合用户所设定标准的引物，如果找不到合适的引物可以逐步降低要求来进行进一步搜寻。 搜寻到引物结果最终显示在下面的窗口中：
primer5说明书2 2008年04月20日星期日上午 04:49 15 可能出现的二级结构按照稳定性大小自动排序最稳定的一种排在最前使用卷动条可以 看到未显示的部分 除了上述功能这一板块还具有激活以下功能的快捷按钮Search Criteria 搜索参数 窗口Search Results 搜索结果如果已经实施过搜索窗口以及Edit Primer 引物编辑 窗口点击按钮可以使相应部分伴随引物对以图形显示 16 Edit Primer 引物编辑窗口 Edit Primer 引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列 在windows系统或Power Mac的Command-X Command-C 及Command-V系统中您可以 使用CTRL-X CTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切拷贝和粘贴删除当前引物序列并从 剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法进行粘贴时Paste 粘贴窗口会激活用以 将引物序列转化为反向互补或反向互补形式您也可以手工键入引物序列一旦引物被编辑 发生变化Analyze 按钮就可以使用点击Analyze 按钮即可分析编辑后的引物您可以修改实际序列或是翻译后的氨基酸残基如果您修改氨基酸残基相应位置可能出现多 义密码子 除了上述的引物性状和二级结构资料具体参阅PRIMER PREMIER窗口的章节该窗口也提供了限制性酶分析功能您可以通过点击Enzyme 按钮通过手动或软件提供的筛 选方案来选择一组限制性酶 您可以使用Prime 按钮来将引物移动到更合适的结合位点通常这项功能可以让您确 认是否有其它比当前位点更稳定更适合的结合位点存在 其他信息如果您希望改变阅读框或使用其它密码子列表请关闭本窗口从主菜单上选 择Function >GeneTank激活GeneTank窗口再选择Translate > Change Parameters打开 Select Codon Table窗口来改变阅读框或选择其它密码子列表然后重新打开本窗口 可选操作 Function > Edit Primer Search Criteria 搜索标准窗口 以下是基本搜索标准的详细信息
生物软件应用论文引物设计软件Premier Primer 5 姓名宋瑞雪__ 学号20107610833
引物设计软件Premier Primer 5 生物信息处理班宋瑞雪20107610833 PCR引物设计引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA 单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。 引物设计的基本原则： 1、引物Tm：引物所对应模板序列的Tm 值最好72℃左右。至少要在55－80℃之间。Tm=2(A+T)+4(C+G)。 2、引物长度：大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18)的引物；若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引物。有人用20～23个核苷酸引物得到40 kb的产物。 3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 4、ΔG(自由能)值：ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度。引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。 5、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠,引物内部不应出现互补序列。 6、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 7、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。 8、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。 以具有解暑止渴、消食止泻之功，为夏令医食兼优的时令佳果的菠萝为例，选取具有OPAE 14标记，长度为1005bp的基因组序列：
2010级动科2班杨教童222010328210151 1.引物设计的原理和步骤 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核苷酸片段，其中在扩增的DNA片断5'端的引物对应于有意链DNA序列，3'端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。 1.引物设计的原则 （1）碱基组成： GC含量应在40%-60%（45%-55% ）之间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等； （2）引物长度： 引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。 （3）重复或自身互补序列：
形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。 （4）上下引物的互补性： 一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。 当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端都不能和其他任何引物互补。 （5）解链温度（Tm 值）： 计算出来的两个引物的Tm 值相差不能大于5 ℃，扩增产物的Tm 值与引物的Tm 值相差不能大于10 ℃；引物的Tm 值一般为50-70℃。 这些特性保证了扩增产物在每一个PCR 循环可有效变性。 （6）3’末端 3’末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A； （7）5’端序列添加限制性酶切位点： 2.用Primer Premier 5.0 软件设计两对引物 （1）在网页上找到要制作引物的一段序列，最好在1000左右，比如：ORIGIN 1 atgaatccaa atcaaaagat aataacaatt ggttctgttt ctctcatcat tgccacaata 61 tgtttcctta tgcaaattgc tatcctagta actactgtaa cattacattt caagcagcat
“实用生物信息技术”课程 小组集体练习、讨论、交流总结报告 班_MS2_ 组_C01_ 次_11_ 讨论时间：2016年11月30日 讨论地点：中国农业科学院教学楼八教 参加人员：王琪周燕于海燕寇俊凤 讨论主题：通过Primer Premier 5软件设计引物 讨论内容：利用Primer Premier 5设计引物，加深对设计引物原则理解。 提取棉花叶总RNA然后用试剂盒反转录成cDNA，用cDNA作为模板扩增基因的CDS区，然后想要转染进感受态细胞中。 比如TPS27基因，首先在NCBI找到它的mRNA序列，然后找到它的CDS序列，全部复制下来，在primer 5.0 中设计引物，第一次自己操作可以多筛选几对引物，尽量避免错配，二聚体，产生错的产物即可。最后在引物的5'端添加酶切位点以及保护碱基。 具体操作 打开Primer Premier 5 File New DNA Sequence 选项AS is- OK 点击primer 按钮，弹出菜单后点击search按钮
选择PCR primer，Pairs 参数，并选择所需PCR产物长度，OK 会弹出搜索结果菜单，点击OK
在搜索出的结果列表里选择TM合适、GC含量高、无各种BUG的引物，点击edit primer，将所得引物复制 而后点击S/A按钮，并继续点击edit primer，复制反向引物，引物设计达成。
得到3' 端GAAGTTCCAAGGTCGTTA5' 端TCGTGGGCAGATTTATGT 然后添加酶切识别序列到引物5' 端。常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI，这里我选择XhoI（一般在构建质粒上有且目标基因本身不被识别就可以） 插入酶切位点后点击Analyz. 发现Tm为64.5 有Dimer 和False Priming因此该对引物不可以。 经过分析酶切位点后没有完全没有BUG的引物，因此选择几个与设计原则背离较小的引物。收获体会： 因为上一次的讨论效率比较慢，导致学习效果不是太理想，所以这次改进了讨论的方式。（1）因本小组成员各自研究方向都涉及，这次主要讨论了大家在以后的课题中都会用到的Primer Premier 5来进行引物的设计。在这次的学习过程中充分用到了自己的分子生物学的知识。通过这样的学习方式，学习快效率比较高。 （2）利用Primer Premier 5来引物的过程中发现，此软件对引物要求较高，不易有比较满意的引物，以后可以尝试Oligo软件。 （3）要深刻理解把握设计引物的原则，多尝试，多设计，一定有一款适合你。 （4）意识小组合作重要性，三人行必有我师焉，不懂就要问，不会就要学。不怕不会就怕不学。这个很重要！！！ 存在问题： （1）在刚开始安装Primer Premier 5的时候出现了问题。 （2）组员对此软件不是很熟悉，但是通过交流，查资料，自己动手操作已解决这个问题。（3）分子生物基础知识还需加强，并加强与实际操作的联系。这样有利于多学科共同巩固学习。 补充 限制性核酸内切酶（restriction endonucleases ），根据结构和功能特性，把限制酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型限制酶的切点不固定，很难形成稳定的、特异性切割末端；Ⅲ型限制酶对DNA 链的识别序列是非对称的，不产生特异性的DNA 片段，故基因工程实验中基本不用Ⅰ型和Ⅲ型限制酶。
引物设计的详细步骤 详细步骤如下： 步骤一：了解引物设计的基本原理 引物设计是指为特定的DNA序列设计一对合适的引物，以便在PCR反应中扩增目标DNA序列。引物是PCR反应的关键组成部分，引物的选择和设计对于PCR扩增的成功率和特异性非常重要。因此，了解引物设计的基本原理对于有效设计合适的引物至关重要。 步骤二：确定PCR反应的目标序列 在设计引物之前，我们需要确定PCR反应的目标序列，即我们需要扩增的DNA区域。这个目标序列可以是已知的基因序列，也可以是未知的区域。确定目标序列后，我们可以继续设计引物。 步骤三：确定引物的一些基本参数 在设计引物之前，我们需要确定一些基本的参数，以便帮助我们选择合适的引物。这些参数包括引物的长度、GC含量、Tm值以及避免二聚体形成等。 引物长度：通常来说，引物的长度应在18-25个核苷酸之间。过长的引物可能导致不特异的扩增产物的形成，而过短的引物则可能导致低扩增效率。 GC含量：引物的GC含量对于引物的稳定性和特异性有影响。在正常情况下，引物的GC含量应在40%-60%之间。 Tm值：引物的Tm值是指引物在PCR反应中的解离温度。Tm值过低可能导致非特异的扩增产物的形成，而Tm值过高则可能导致低扩增效率。
避免二聚体形成：在设计引物时，我们还需要考虑引物之间的互补性 以及避免引物形成二聚体。引物之间的互补性可能导致引物形成二聚体， 从而降低PCR反应的效率和特异性。 步骤四：选择合适的引物设计工具 目前有很多在线引物设计工具可供选择，例如NCBI Primer-BLAST、OligoAnalyzer等。这些工具可以根据输入的目标序列帮助我们快速选择 合适的引物。此外，还可以使用一些商业引物设计软件，如Primer Premier等。 步骤五：进行引物特异性分析 设计好引物后，我们需要进行引物特异性分析，确保引物只扩增目标 序列而不扩增其他非特异性产物。这可以通过BLAST或其他相似性工具来 完成。特异性分析的目的是排除可能存在的非特异性扩增产物，以确保PCR反应的准确性和特异性。 步骤六：合成和测试引物 在确定引物的特异性后，我们可以选择合成引物并进行实验室测试。 在PCR反应中使用合成的引物，检测扩增产物的特异性和效率，并进行优 化调整。 总结： 引物设计是PCR实验中至关重要的一步。通过了解引物设计的基本原理，确定PCR反应的目标序列和一些基本参数，选择合适的引物设计工具，进行引物的特异性分析，最后合成和测试引物，我们可以设计出合适的引物，从而实现对目标DNA序列的扩增。
一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因,找到该基因的mRNA,在CDS选项中，找到编码区所在位置,在下面的origin中,Copy 该编码序列作为软件查询序列的候选对象. 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5,点击File—New—DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内(选择As），此窗口内,序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索"、“引物编辑"以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”,“Pairs”,设定搜索区域和引物长度和产物长度.在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300~500bp。 ③点击OK,软件即开始自动搜索引物，搜索完成后,会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中,显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况: 3'不要出现连续的3个碱基相连的情况,比如GGG或CCC，否则容易引起错配.此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间,GC％应该在45％～55％间,上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好.该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体和错误引发位置.若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构,即这几个按钮都显示为“None”为好.但有时很难找到各个条件都满足的引物,所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能,但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物,然后在菜单栏,选择 File-Print—Current pair,使用PDF虚拟打印机,即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息. 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中,该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框,输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可,而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。 ②Analyze中,第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的T m值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算,会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小些,最好不要超过9。 ③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析,可以选择上游引物或下游引物,分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的,即其Delta G值应该偏低,一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个.Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。 ④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样,Delta G值不要超过4。5kcal/mol,碱基对不要超过3个. Analyze中第四项为Composition and T m，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40%～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个,分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，T m值可以控制在50～70度之间。 第五项为False Priming Sites，即错误引发位点,在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率,一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话,比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究 利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究 引言： PCR (Polymerase Chain Reaction) 是一种广泛应用于分子生物学和基因工程领域的技术，通过引物（primers）的选择和设计，能够扩增特定的DNA片段。PCR引物设计的质量和合理性对PCR扩增的成功与否起着至关重要的作用。PrimerPremier5.0 是一款被广泛使用的引物设计软件，具有许多功能，可以辅助研究人员选择高质量的引物。本文旨在研究和探讨利用PrimerPremier5.0软件进行PCR引物设计的方法和优势。 方法： 1. 引物设计目标： 在PCR实验中，为了获得准确和高效的扩增结果，引物设计时需要考虑以下几个因素： - 引物长度：通常情况下，引物的长度应在18到30个碱基对之间。 - GC含量：GC含量应尽量控制在40%到60%之间，过高或过低都会影响引物的特异性和扩增效率。 - 引物间的互补性：引物之间应避免互补性或三联体结构的形成，以避免非特异性扩增。 - 引物的熔解温度(Tm)：引物的Tm值应接近，以确保特异性扩增。 2. PrimerPremier5.0软件的使用： - 安装并启动PrimerPremier5.0软件。 - 导入所需扩增区域的目标序列。
- 在软件中设置引物的参数，如长度、GC含量和Tm值等。 - 执行引物设计程序，软件会根据设置的参数，自动在目标序列中搜索合适的引物。 结果与讨论： 通过PrimerPremier5.0软件的使用，可以高效地选择到符合 设计要求的引物。软件会根据设定的参数，自动搜索并筛选出多个候选引物。 1. 引物长度：为了确保引物能够与模板DNA进行特异性 结合，通常将引物长度设定在18到30个碱基对之间。经过软件筛选后，可得到一组长度适当的引物。 2. GC含量：合适的GC含量可以提高引物的稳定性和特异性。软件会自动根据设定的GC含量范围，筛选出具有适当GC含量的引物。 3. 引物间的互补性：引物之间的互补性可能导致非特异扩增，软件会进行引物间的互补性检测并提供相应的警告或建议。 4. 引物的Tm值：引物的Tm值与其熔解温度有关，Tm值的相 似性有助于提高PCR反应的特异性。软件会根据设定的Tm值 范围，筛选出Tm值相近的引物。 利用PrimerPremier5.0软件进行引物设计的一个重要优 势是，它可以自动计算引物的各项参数，并提供合适的引物选择与建议。这大大减少了研究人员的工作量，并且能够快速获得高质量的引物设计结果。 结论： PrimerPremier5.0软件是一款功能强大的引物设计软件，通 过它的使用，可以高效地选择到符合需求的PCR引物。合理设计的引物能够提高PCR扩增的特异性和效率，为后续实验的成功提供了坚实的基础。然而，在使用软件进行引物设计时，研
设计跨内含子引物的方法 一、为什么要设计跨内含子的引物 区别或消除gDNA的扩增 二、如何设计 1、在pubmed上找到目标基因的DNA序列以及其内含子和外显子情况 步骤： 打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称，找到符合要求的基因，links到geneback 即可显示出该基因DNA的信息,这是基因组DNA,从mRNA选项中JION后面的是外显子的位置，为了以后的操作，可以把这个DNA序列、外显子和CDS序列的起至位置记下来。 2、在pubmed上找到目标基因的mRNA序列 步骤： 打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称，找到符合要求的基因，点击进入基因页面，即可显示出这个基因的mRNA信息，最后的ORIGIN是CDNA序列，把它记下来。 注：最好能找到以NM或XM开头的序列，以此做为设计引物的模板。 NCBI RefSeq (美国国立生物技术信息中心参考序列库) 是目前世界上最完整和最具有权威性的人类基因组编码mRNA序列数据库。它已收集了大约17,500个经cDNA测序证实的"NM"序列，还有大约10,000个主要由计算机推测产生的"XM"序列。由于一些序列来自异常连接产生的转录物或由计算机推演产生的不正确内含子-外显子剪切，因此该数据库所收集的参考序列一直在不断地被修改中，尽管如此，NCBI RefSeq仍是目前最可信赖的人类基因mRNA 序列数据库。 3、如何设计跨内含子的引物（利用primer 5） 步骤： 1）、在第2步页面右边，点击 real time PCR 一般产物长度为80～150bp，引物长度15~20bp，点击GET primer。 2）、会得到若干条引物，从图中信息即可看出跨内含子的引物，建议只用BLST找到跨内含子的引物在CDNA的定位，然后，用primer 5继续设计引物。此时，需记下跨内含子引物所在2个外显子的位置（确认是否在CDS序列内）。 3）、打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy步
Primer 5.0使用方法 Primer Premier 5.0软件用途 Primer Premier是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件，利用它的高级引物搜索引物数据库，巢式引物设计，引物编辑和分析等功能，可以设计出有高效扩增能力的理想引物，也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。其主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析，DNA基元(motif)查找和同源性分析功能。 Primer 5.0软件基础指南 一. Primer 引物设计 Primer功能板块包括了设计引物的搜索引擎软件，包含了强大的自动搜索法则只需要简单的操作就可以得到合适的引物。Primer Premier也提供了人工控制搜索引擎的方法便于根据您的特殊要求制定标准输出的引物，通过全面的即时分析工具计算出引物的多种参数和二级结构关键参数，如Tm值GC含量和自由能G，还能以图形显示。 为设计用于定点突变的引物，该项功能板块也提供包括即使分析和限制性酶切位点分析的引物编辑工具，您可以通过输入碱基或氨基酸残基来手动修改引物。 您可以分析所有想用到的引物，可以选择事先搜索的引物，或手动添加引物软件。二. Manual Search 手动搜索及引物设计原理如下： 在过去十年中，为获得高效扩增PCR方法得到的很大发展，我们对引物稳定性二级结构和适宜长度的了解，使得我们在保证引物特异性的前体下，大大提高了引物的扩增效率而Primer Premier 软件的搜索法则很好的维持了高效性和特异性之间的平衡。 1.引物长度 引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度，对多数实验适宜引物长度为18到24个碱基，等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建。 library protocol 28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样本的克隆能起到重要作用，长PCR引物能给扩增带来更好的特异性长引物，也允许您通过降退火温度来能提高反应的灵敏度，不过长引物通常更易于形成包括发卡结构，二聚体自身互补等二级结构。理论上在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡。 为设计一条高效引物有几个参数必须考虑Primer Premier搜索所考虑的参数依次如下：2.Tm 融链温度 Primer Premier根据相邻二碱基对作用理论nearest neighbor theory 来计算融链温
primer5使用 引物设计的原则 引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（p roduct length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(inte rnal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大[2][5]。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最