RT –PCR的原理及实验步骤
一、RT –PCR的原理
RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：
(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；
(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；
(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
二、RT-PCR的准备：
1.引物的设计及其原则：
(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:
a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。
d.引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。
e.引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。
f.同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。
g.5’端无严格限制：5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。
根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。
2. 耗材：
实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。
3. 试剂准备：
变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。
4、RNA的提取方法：
RT－PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA 酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。
三、RT－PCR步骤：
1、RNA的提取：
2、cDNA的合成：
逆转录体系的组成：
3、PCR扩增：
50ul PCR体系的组成：
4、PCR反应条件：
5、PCR条件的优化：
PCR条件的优化主要是
①引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下2 ℃变化寻找最佳退火温度。
②此外Mg2＋浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2 mM左右。
③引物和模板的量等。
6、产物的电泳和结果的测定：
根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度），取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳45－60min。成像系统成像分析。
分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖浓度
四、需注意的问题：
1. 注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：氯仿、溴化乙锭（EB）、酚、异硫氰酸胍、紫外线等。
2. 注意避免试剂污染。
3. 始终注意避免RNA酶的污染。
RT –PCR的原理及实验步骤 一、RT –PCR的原理 RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： (1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； (2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA； (3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 二、RT-PCR的准备： 1.引物的设计及其原则： (1)引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 (2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括: a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。 b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。 c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。 d.引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 e.引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。 f.同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。 g.5’端无严格限制：5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。 2. 耗材： 实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。 3. 试剂准备： 变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。 4、RNA的提取方法：
概念 RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。 逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-P CR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。） RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative P CR)。 实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内D NA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。 real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。 real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）” [编辑本段] PCR技术相关试剂 A液：变性液 B液：醋酸钠溶液 C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1） D液：异丙醇 E液：75％乙醇 F液：DEPC处理的灭菌去离子水 G液：RNA酶抑制剂 H液：反转录反应液 I液：反转录酶 J液：PCR反应液
半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5 2 分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = RNA 浓度= ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × μg/μl = μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围到。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度??成分 ??MOPS，pH ??乙酸钠 ??EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 ②准备RNA样品
RTPCR的原理实验步骤及应用 概述 逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction， 简称RT-PCR），是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测和定量分析RNA 分子在细胞中的表达水平。本文将介绍RT-PCR的原理、实验步骤及应用。 原理 RTPCR利用逆转录酶（Reverse Transcriptase，简称RT）将RNA模板逆转录 为cDNA（complementary DNA），然后通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）对cDNA进行扩增，最终得到大量的目标DNA片段。RT-PCR的基本原理如下： 1.逆转录：反转录酶RT利用RNA模板合成与之互补的cDNA。在逆转 录过程中，需要引入一条逆转录引物（反向互补RNA链）作为反转录的起始点。 2.PCR扩增：将逆转录合成的cDNA作为模板，引入一对特异性引物， 通过PCR反应进行DNA扩增。PCR反应分为三个步骤：变性、退火和扩增。 3.变性：将反应温度升高至95°C，使DNA双链变性为两条单链。 4.退火：将反应温度降低至特异性引物的退火温度，使引物与模板序列 互相结合。 5.扩增：将反应温度升高至适合DNA聚合酶的活性温度，使DNA聚 合酶逆反应合成DNA。 通过多轮的PCR反应，可以扩增出大量的目标DNA片段，其数量呈指数级增长。 实验步骤 1. 样品处理 首先需要从待检测的样品中提取总RNA，常用的提取方法有酚氯仿法和柱式纯 化法。提取得到的总RNA需要通过比色法或者用分光光度计进行测量，确保样品 的质量和浓度。
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链 2、 Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 试验前注意： 1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 引物合成
RT-PCR实验方法简介 RT-PCR定义： 是指对组织或细胞的总RNA进行抽提，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。 RT-PCR流程简介 一、抽提RNA： 1、防止RNA酶污染180℃的高温下干烤6hr以上；0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗；去污剂洗涤，双蒸水冲洗；溶液皆用0.1% DEPC水配置，试剂应为新开封或RNA专用；操作人员戴手套；器械专用。 2、材料的准备 组织及细胞最好为新鲜的，或者在－70℃条件下保存半年以下；尽量避免材料的冻融。 3、确认RNA的质量 检测RNA溶液的吸光度：OD260/OD280=1.8－2.0 RNA的电泳图谱：28S和18S条带明亮、清晰、指条带边缘清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。 二、反转录： 单管一步法: 反转录和PCR反应在一个管子中完成，得到的全部cDNA产物都一起经PCR 扩增，灵敏度更高，但是容易相互干扰。 两步法: 反转录和P CR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如前者高。 三、PCR： 1、参照基因PCR 参照基因一般选择看家基因（长表达、高表达量的基因），常用18S、β－acti
n、bubulin、GAPDH，其中ACTIN最为普遍； 参照基因与目的基因在同一个管子内进行PCR反应的情况下，称之为内参； 参照基因与目的基因在不同管子内反应成为外参； 由于内参可能与目的基因竞争模板及酶，或造成其它干扰，外参的应用较为普遍。 2、目的基因PCR 典型的引物18到24个核苷长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。 RT-PCR实例： 1、实验材料：拟南芥野生型Ws及突变体m1、m2花序 2、实验目的：分析m1、m2与野生型花序中G1基因的表达的差异 3、实验步骤：设计ACTIN及G1基因的引物；分别抽取野生型Ws及突变体m 1、m2花序RNA，DNase I处理，以尽量去除基因组DNA；电泳检测，估计R NA总量；取1ug左右的RNA进行反转录； 取反转录好的cDNA总量的1/10（10ul反转录体积则取1ul），稀释10倍（稀释至10ul），取1/10（1ul）为模板，用ACTIN引物、普通PCR体系、20－2 5个循环、以基因组DNA为对照（因为引物跨内含子，所以基因组DNA扩增出的条带大小与cDNA扩增出的条带大小不同，以去除残留的基因组DNA的影响）做PCR； 取等量产物电泳，根据电泳条带的亮度调整模板量（如m1的亮度为Ws的2倍，则下次PCR时m1的模板为0.5ul），直到电泳亮度基本一致，可认为此时所取的不同体积的野生型Ws及突变体m1、m2模板里RNA的含量基本相同。 以G1基因引物，按调好的模板体积做PCR，电泳。 根据电泳条带的亮度比较野生型Ws及突变体m1、m2中G1基因的表达差异。
rtpcr的常用方法 一、RT-PCR的基本原理 1. 逆转录反应（Reverse Transcription, RT）：RT-PCR的第一步是将RNA转录成互补的DNA，这一步叫做逆转录反应。逆转录反应通过引入RNA逆转录酶（Reverse Transcriptase）和随机引物（Random Primers），将RNA模板转录成cDNA（反转录DNA）。 2. 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）：逆转录完成后，所得的cDNA经过稀释和变性等预处理后，使用DNA聚合酶（DNA Polymerase）和两个特异性引物，通过多轮的循环反应来扩增目标DNA区域。 二、RT-PCR的基本步骤 1.RNA提取和纯化：从样品中提取并纯化RNA，以保证所得的RNA具有较高的纯度和完整性。 2.反转录反应：将RNA转录成cDNA，这一步可通过两种方式进行：使用随机引物、dNTPs、逆转录酶等直接反转录，或通过特异性引物（即RT引物）进行引物延伸。 3. PCR扩增反应：将逆转录所得的cDNA作为模板，使用特异性引物和DNA聚合酶进行DNA扩增。PCR的循环条件通常是：变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）。 4.电泳分析：将PCR产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过对比分子量标准品，判断扩增产物的大小。 三、RT-PCR的优点和局限性
1.优点 (1)可以从一个RNA样本中扩增目标序列，从而可以检测低丰度的mRNA。 (2)推导出目标基因的相对表达量和定量结果。 (3)能够对基因表达的动态变化进行实时监测。 (4)扩增模板的选择性强，通过控制引物的设计，能够选择性地扩增特定的目标。 2.局限性 (1)需要对RNA进行提取和纯化，这一步骤可能会引入一定程度的变异，影响结果。 (2)逆转录过程中可能发生评性引物引起的“板块效应”，导致不同通量的逆转录效率不同。 (3)PCR扩增反应中可能存在引物的离子竞争、温度过高等问题，导致PCR产物的比例发生倾斜，从而影响结果的准确性。 (4)PCR反应的重复性受到实验操作的影响，需谨慎进行实验设计及技术控制。 四、RT-PCR的常见改进方法 1. 实时荧光定量RT-PCR（Real-Time PCR）：引入了荧光探针，可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，实现对产物积累的即时检测，从而准确测量初始目标的数量。
逆转录-聚合酶链（RT-PCR）实验的具体步骤及方法 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。 一、总RNA的提取 见总RNA的提取相关内容。 二、cDNA第一链的合成 目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。 1．在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 ul。在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心； 2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min； 3．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5 min；
4．加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min； 5．于70℃加热15 min以终止反应； 6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。 三、PCR 1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul； 2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 ul。轻轻混匀，离心； 3．设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照； 4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
RTPCR具体步骤 RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种用于检测和测量特定RNA分子 在样本或样本中的表达水平的实验技术。下面是RT-PCR的具体步骤： 1.提取RNA：首先从样本（可以是细胞或组织）中提取RNA。这可以 通过商业RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿提取法来完成。提取的RNA可 能含有DNA杂质，因此可以使用DNA酶I来去除DNA。 2.逆转录反应：将提取的RNA转录成互补的DNA（cDNA）的过程称为 逆转录。逆转录反应的目的是将RNA转录成cDNA，并将其中的信息保存 下来，以便后续PCR反应中进行扩增。逆转录反应通常在逆转录酶（例如 M-MLV反转录酶）和随后使用的引物的存在下进行。需要引物来诱导逆转 录酶在RNA模板上合成第一链cDNA。 3.PCR反应：PCR是一种将特定DNA片段扩增到大量可检测水平的技术。在RT-PCR中，PCR反应用于扩增从RNA转录的cDNA片段。PCR反应 需要一对引物，这对引物应是特异性的，可以选择性地放大感兴趣的RNA 分子。PCR反应通常包含DNA模板，引物，dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和DNA聚合酶。PCR反应包括一系列循环，每个循环都包括一定的时间和 温度在一定的时间内。 4.聚合酶链反应：在PCR反应中，DNA聚合酶在每一个循环中以DNA 末端为模板合成互补的DNA链。每个循环包括退火，延伸和变性步骤。在 退火步骤中，引物结合到DNA模板上。在延伸步骤中，DNA聚合酶合成新 的DNA链，并以它们作为模板进一步合成更多的DNA链。在变性步骤中，PCR反应的温度被升高以分离DNA链。
5.检测与分析：PCR反应产生的扩增产物可以通过凝胶电泳或其他检测方法进行分析。凝胶电泳可以分离不同大小的DNA片段，并且扩增产物的相对量可以通过定量PCR（qPCR）进行测量。qPCR使用荧光信号来检测PCR产物的积累，并通过与标准曲线相比较来确定特定的RNA分子在样本中的表达水平。 6.数据分析：通过分析PCR产物的相对量，可以根据比较样品之间的扩增产物浓度来确定特定RNA分子在样本中的表达水平。这种数据分析可以在基因表达实验中提供有关基因表达模式和相对定量的有用信息。 总而言之，RT-PCR是一种用于检测和测量RNA在样本中的表达水平的实验技术。通过逆转录反应和PCR反应，RNA可以转录成cDNA并进行扩增。最后，通过分析产物，可以确定RNA的相对表达水平并获得有关基因表达的信息。
RT-PCR 一知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； 2、RNase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. 4、引物的设计及其原则： 引物的特异性决定PCR反应特异性。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。 b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm 值减去5～10度。 c、3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。 d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。 f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。 g、5’端无严格限制：5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。
RT-PCR实验原理与步骤 【实验原理】 RT-PCR 是以RNA 为模板经逆转录反应（Reverse Transcription，RT）产生cDNA 第一链，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。 【实验仪器】 1. 恒温金属浴 2. PCR 扩增仪 【试剂及配制】 RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0 试剂包括： 1. AMV 反转录酶XL (5 U/ul) 2. 10×反转录反应缓冲液 3. RNAase 抑制剂(40 U/ul) 4. 随机引物9 mers (50 pmol/ul) 5. RNAase Free dH2O 6. TaKaRa Ex TaqTM HS (5 U/ul) 7. 5×PCR 反应缓冲液 8. dNTP Mixture (各10 mM) 【实验步骤】 1. 反转录反应 1）按下列组成配制反转录反应液 MgCl2 2ul 2. PCR 反应 1）按下列组成配制PCR 反应液 2）把此反应液加入到第一阶段反转录结束后的PCR 反应管中，轻轻混匀； 3）按以下条件进行PCR 反应：94 ℃ 2 min，94℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72℃ 4 min、30 cycles，72℃ 5 min。 4）琼脂糖凝胶电泳检测结果。 【注意事项】 1. PCR 条件设定 退火温度可根据实际情况适当地提高或降低（50℃～60℃）。延伸时间因目的序 列长度不同而不同。cDNA 量较少时，循环次数可增加为40～50 次。 2. 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix），然 后再分装到每个反应管中。 3. 使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
逆转录PCR RT-PCR和逆转录PCR是同义词，已合并。 RT-PCR 为反转录PCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 目录 1mode逆转录PCR 2实时PCR 3RT-PCR技术相关试剂 4PCR各步骤的目的 1 4.1 预变性 1 4. 2 三种循环 1 4.3 延伸时间原因 1 4.4 PCR引物的选择 1 4.5 注意事项 1mode逆转录PCR 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。 RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。 RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 2实时PCR 实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅
rt-qpcr是一种结合了逆转录和实时荧光定量PCR技术的方法，用于对RNA分子进行定量检测。其原理主要包括三个方面：逆转录、PCR 扩增和实时荧光定量检测。 1. 逆转录 rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA，这是通过逆转录酶（Reverse Transcriptase）催化的反应来实现的。逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA，为后续的PCR扩增提供模板。 2. PCR扩增 在cDNA合成完成后，接下来是PCR扩增反应。PCR扩增需要引物（primers）来选择性地扩增目标基因的片段。在PCR过程中，引物与模板结合，逐渐扩增出大量目标片段，这些片段即为实验所关注的RNA分子的转录产物。 3. 实时荧光定量检测 在PCR扩增过程中，可以加入SYBR Green等实时荧光染料，以实现实时监测PCR反应过程中产生的DNA片段数量。这种实时荧光检测技术可以实现对PCR反应的动态观察，并能够定量分析反应体系中的DNA含量。
rt-qpcr实验步骤主要包括样品准备、逆转录、PCR扩增和荧光定量检测，以下为详细步骤： 1. 样品准备 首先需要准备待检测的RNA样品，其中包括目标RNA分子的提取、 纯化和定量等工作。样品的处理质量将直接影响后续实验结果的准确 性和可靠性。 2. 逆转录 将RNA样品与逆转录酶、随机引物和dNTPs等混合物一起进行逆转 录反应。逆转录过程一般包括以下步骤：首先将RNA与随机引物混合，然后加入dNTPs和逆转录酶，进行逆转录反应。 3. PCR扩增 在逆转录完成后，将逆转录得到的cDNA作为模板，与特定引物和PCR Master Mix（包括酶、缓冲液和dNTPs等）进行PCR扩增反应。PCR扩增条件需要根据引物的特性和目标片段的长度进行优化，以保 证扩增反应的特异性和准确性。 4. 荧光定量检测 在PCR扩增过程中，引入实时荧光染料（如SYBR Green）或探针
R T-P C R的实验原理与操作步骤(总 4页) --本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可-- --内页可以根据需求调整合适字体及大小--
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 (一) 反转录酶的选择 1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。 (二) 合成cDNA引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA 在数量和复杂性方面均要小。 3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR 扩增。生物科研二、实验耗材与试剂 1．RNA提取" target="_blank" >RNA取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
实验四逆转录PCR (RT-PCR) 【实验目的】 1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。 2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。 【实验原理】 聚合酶链式反应〔PCR〕过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA〔complement DNA〕合成〔即RNA的反转录〔RT，reversetranscription〕〕，同cDNA的PCR 结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的基本原理〔图〕。首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成cDNA，即总RNA中的mRNA 在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA 〔cDNA〕；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸〔dNTP〕为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。 在RT时，有3种引物可选择〔表4.1) 。用1〕和2〕方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用3〕方法，先要去:// 查它的序列，并用oligo 等软件设计引物。 RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。在两步法RT-PCR中，每一步都在最正确条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法RT-PCR具有其它优点〔表〕，cDNA合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度，最低可以到达总RNA，因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特异性引物(GSP)起始cDNA的合成。 由图不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA 样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。 基因特异性引物〔GSP〕对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA 3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。 已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需有适
手足口病RT－PCR检测标准操作程序 （试用） （2008年5月22日第1版，2008年5月29日修改） 内部标准编号： 检测项目：肠道病毒EV71、CA16，其他肠道病毒 检测方法：RT－PCR PCR仪器：Bio－Rad iCycler 1.检测原理 根据已知肠道病毒5’－UTR区基因序列及EV71、CA16的VP1－VP3基因序列，设计特异性引物（PE、EV71、CA16），通过Nested RT－PCR扩增基因片段，检测标本中是否存在肠道病毒EV71、CA16和其他肠道病毒。所用引物序列、扩增产物大小和配制如下： 引物核酸序列(5’–3’)产物长度加DEPC水量(uL) （1 OD配制25 uM） PE2 TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C 116 bp 156 PE1 ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC 180 EV71-S GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC 226 bp 196 EV71-A ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC 208 CA16-S ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC 208 bp 220 CA16-A TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG 208 2.应用的范围
检测血清、血浆、粪便、咽拭、疱疹液、脑脊液等标本中肠道病毒EV71型和CA16型病毒基因片段。 3.标本处理 3.1 粪便标本处理： 3.1.1将1.5ml Eppendorf管上标记标本号; 3.1.2每一管中加入900ul生理盐水、100ul 氯仿; 3.1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约0.1g约绿豆大小，加入标记好的离心管中，剩 余原始标本最好留在原容器中并冻存于- 20℃。 3.1.4 确保拧紧离心管，用机械振荡器剧烈振荡20min。 3.1.51500g* （约3500转）离心20分钟。 3.1.6 将每一份标本上清吸入新1.5ml Eppendorf管中。 注意：若上清不清澈，应再用氯仿处理一次。以上标本处理方法适用于从患者排泄物、呕吐物（均简称样品）中提取病毒RNA。 3.2咽拭子标本处理 咽拭子要在保存液中充分搅动（40下左右）或用机械振荡器剧烈振荡5~10min，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后10000rpm 离心20min或4℃静置10min，取上清吸入2个有外螺旋盖的标记好的冻存管中。 注意：以上标本处理方法适用于从疱疹液拭子、肛拭子（均简称样品）中提取病毒RNA。脑脊液、血清标本不需要处理可直接用于RNA提取。 3.3 提取病毒RNA模板 应用RNA提取试剂盒（TianGEN公司产品，Cat. No：DP315-R）方法 试剂准备：
哺乳动物细胞总RNA 的提取、电泳（定量） 反转录-聚合酶钱式反应（RT-PCR ） D7A 的琼脂糖凝胶电泳 一、 实验目的 学习并掌握总RNA 的分离提取，检测质量以及定虽的方法。 二、 实验原理 细菌的总RNA 主要由rRNA.tRNA 及mRNA 组成，其中rRNA 含量最多（占80%、85%）。在pH6.0 微酸环境下，RNA 相对稳定，織性环境下，易分解。 RNA 酶极为稳定且广泛存在于细胞外，环境中存在大t RNA 酶，极易降解RNA,因而在RNA 提取及 相关分析实验中，如何避免RNA 酶的污染及抑制源和外源性RNA 活性，是实验成败的关键。 RNA 的产虽取决于组织或细胞的来源，但是，通常每毫克组织可获得C7 y g RNA,每10“细 胞可获 得5~10ug RNA,提取的RNA AQA 缈比值一般为1・8辽・0。 在RNA 相关实验过程中，须树立RNase-free 思想：1）样品新鲜,保存得当，以强变性剂， 防止源性RNase ； 2）人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯:3）空气中 灰尘和细菌含 RNase,应建立干净的操作环境； 实验介绍如何使用TRIzol 来分离总RNAo TRIzol 是一种酸性苯阱提取试剂，含有去垢剂， 和使RNase 失活的异硫氤酸服，它能在破碎和溶解细胞时保持RNA 的完整性，防止RNA 降解。（注 意：TRIzol 具有强烈腐蚀作用，小心操作。） 三、 实验材料、试剂与器材 U 细胞（5x lO'IIela ） 2、 DEPC 水溶液,PBS, TAE 3、 氣仿，异丙醇，乙醇均为分析纯 4、 TRIzol 试剂购自 Invitrogen 5、 烧杯（1000, 500, 100, 50ml 若干人量筒（1000, 500, 250, 50, 20 ml 若干），玻璃 棒，药勺，试剂 瓶，三角瓶。枪头（ 1000、200、20ul ）,离心管（0. 2ml. 0. 5ml PCR 管.1.5ml 、 2nd 、7ml 离心管）,枪头盒。 实验一 实验二 实验三 实验一 哺乳动物细胞总RNA 的提取.电泳
逆转录pcr rt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。逆转录pcr，或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。在rt-pcr 中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。 由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。 rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。（检测基因表达的方法，参见northern blot法。） rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。 实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。 real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。 real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种rt pcr 的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）” rt-pcr技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于mrna引物 amv（m-mlv）：逆转录酶 dntp：脱氧核苷酸 rnase：rna酶抑制剂 pcr buffer：rt-pcr缓冲液 mgcl2：2价镁离子 pcr各步骤的目的