摘自《消毒技术规范》2002版（中华人民卫生部）第25-27页
2.1.1.3 活菌培养计数技术
2.1.1.
3.1 适用范围
测定细菌悬液、菌片、采样液等样本中含有活菌的数量。
2.1.1.
3.2 试验器材
（1）刻度吸管（1.0ml 、5.0ml ）。
（2）稀释液：见附录A 。
（3）营养琼脂培养基：见附录A 。
（4）电动混合器
2.1.1.
3.3 操作程序
本规范要求在杀菌试验中的活菌培养计数统一使用倾注法。其操作程序如下。
（1）对菌悬液可直接进行培养计数。对菌片、采样棉拭与小型固体样本等，应将其上的细菌洗下成为菌悬液后进行培养计数。洗菌时，一般以稀释液为洗液。具体方法如下: 取含 5.0ml 稀释液无菌试管，对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。而后，用电动混合器混合20s （或在手掌上用力振敲 80 次），将菌洗下形成菌悬液。以上操作应严格按无菌要求进行。
（2）将试管按需要数量分组排列于试管架上， 每管加入 4.5ml 稀释液。各组由左向右，逐管标上 10-1、10-2、10-3......等。
（3）将菌悬液样本在用电动混合器混合20s （或在手掌上用力振敲 80次），随即吸取 0.5ml 加至 10-1 管内。
（4）将 10-1 管依前法用电动混合器混合20s （或在手掌上用力振敲 80次），混匀，再吸取出0.5ml 加入10-2 管内。如此类推，直至最后一管。必要时，还可作某稀释度的1:1或1:4稀释。
（5）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 15cfu ～300cfu 者为宜），吸取其中混合均匀的悬液 1.0ml 加于无菌平皿内。每一稀释度接种 3个平皿。一般需接种2个～3个不同稀释度。平皿加样前，应先按组编号，以免弄混。
（6）将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15ml ～20ml 。
（7）将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放于台上。待琼脂凝固后，翻转平皿，使底向上，置37℃温箱内培养。
（8）每日观察细菌生长情况。培养至规定时间（细菌繁殖体为 48h ，白色念珠菌与细菌芽孢为 72h ），计数最终结果的菌落数。
（9）对菌片和采样棉拭洗液的活菌培养计数，先按各试验要求处理（如去除残留消毒剂等），而后取其最终样液按上法进行培养计数。
（10）计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu ～300cfu 的平板为准，每个稀释度 3 个平板生长菌落数全合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合上述标准，则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果。但对黑曲霉菌活菌计数及杀灭试验时，平板菌落数应在15cfu ～100cfu 之间。
对估计菌量极少的样本（如消毒处理后样本），在培养计数时可不作稀释，即使平板菌落数未达15时，亦可用其计算最终结果。
将求得的平均菌落值，再乘以稀释倍数，即得每毫升原样液中的菌量。菌量单位为cfu 。
2.1.1.
3.4 活菌计数中技术操作误差的测定
试验者在活菌计数中因技术操作而引起的菌落数误差率（平板间、稀释度间）不宜超过10%。对误差率的自检，可按以下公式计算。
（1）平板间误差率计算公式：
%100?=平板间菌落平均数
平板间菌落数平均差平板间误差率
平板数的绝对值之和各平板菌落数平板间菌落平均数平板间菌落数平均差)(-=
平板数
各平板菌落数之和平板间菌落平均数=
（2）稀释度间误差率计算公式：
%100?=
稀释度间菌落平均数
稀释度间菌落数平均差稀释度间菌落数误差率 稀释度数
的绝对值之和各稀释度菌落数稀释度间菌落平均数稀释度间菌落平均差)(=
稀释度数
和各稀释度平均菌落数之稀释度间菌落平均数=
2.1.1.
3.5 注意事项 （1）严格无菌操作，防止污染。
（2）认真检查试验器材有无破损（要特别注意试管底的裂痕和破洞），以防丢失样本和污染环境。
（3）注意菌液的均匀分散。
（4）稀释或取液时要准确，尽量减少吸管使用中产生的误差。
（5）每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管，以减少误差。
（6）样液接种于平皿后应尽快倾注营养琼脂培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果的准确性。
（7）倾注时琼脂培养基温度不得超过45℃，以防损伤细菌或真菌。倾注和摇动时，动作应尽量平稳，以利细菌分散均匀，便于计数菌落。勿使培养基外溢，以免影响结果的准确性和造成环境的污染。
（8）为提高试验成功率，最好先用浊度计对原菌液含菌量做出估计，尽可能在首次试验时所取的有限稀释范围内（2个～3个 稀释度）即有长菌在 15cfu ～300cfu 之间的平板。
（9）结果计算时，必须弄清稀释倍数，以免计算错误。
GB 4789.15－2010
食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数
福建省疾病预防控制中心 马群飞
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食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数
National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of moulds and yeasts
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霉菌和酵母的基本特性
相对于低等的细菌来说，霉菌 和酵母生长缓慢，竞争能力较弱， 故霉菌和酵母常在不利于细菌生长 繁殖的环境中形成优势菌群。由于 霉菌和酵母的细胞较大，新陈代谢 能力强，故10２～10４个酵母即可引 起一克食物的变质，而细菌则需要 100倍于此数的细胞。
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食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数
National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of moulds and yeasts
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微生物的显微直接计数法 令狐采学 一、实验目的 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。 二、实验原理 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（PetrofHausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图211），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为 0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以：1mm3体积应含有小方格数为 1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数 K=4×106 。 因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d） 三、实验器材 1．活材料：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）斜面或培养液。 2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片 （22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。四、实验方法 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到102），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
芽孢杆菌活菌数及芽孢数检测方法 1主题内容与适用范围 本方法规定了芽孢杆菌总数的测定方法； 本方法适用于测定微生物制剂中芽孢杆菌总数。 2方法提要 芽孢杆菌总数是指水样在一定条件下培养后(培养基成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等)所得1mL水样所含菌落的总数。按本方法规定所得结果只包含一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的芽孢杆菌菌落总数。 3 培养基与试剂 3.1 营养琼脂成分 蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂20g，水1000mL。 3.2 制法: 将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.2，分装于玻璃容器中(如用国产含杂质较多的琼脂时，应先过滤)，经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。 3.3生理盐水的制备：按总体积的0.9%称量NaCl并混合均匀，然后用移液枪或移液管吸取9ml生理盐水加入到试管中，并在121℃灭菌20min备用。 4 仪器
高压蒸汽灭菌器，干热灭菌箱，培养箱，36±1℃，电炉，天平，冰箱，pH计，灭菌试管，平皿(直经9cm)、刻度吸管等。 5活菌计数方法 5.1 取固体样品5.0g，溶于95mL蒸馏水(此时稀释20倍)，加入适量已灭菌玻璃珠，于200rpm摇床中振荡20min。 5.2 用移液枪从锥形瓶取1ml样品液至装有9ml无菌水的试管中，逐步稀释至适当梯度。 5.3 吸取0.2mL适当稀释梯度的菌液放入对应平板中，用已灭菌的涂布棒来回涂匀。 5.4 涂匀的平板置于30℃培养箱中培养20~30h，待长出清晰可见的菌落，进行计数。 6菌落计数及报告方法 作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿一半，而其余一半中菌落数发布又很均匀，则可将此平皿计数后乘2 以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。 7 不同稀释度的选择及计数方法
1目的 规范食品中霉菌和酵母菌测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中霉菌和酵母菌（moulds and yeasts）的计数方法。本标准适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数。 3责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 4内容 4.1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 4.1.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。 4.1.2 恒温培养箱：28 ℃±1 ℃。 4.1.3 均质器。 4.1.4 恒温振荡器。 4.1.5 显微镜：10×～100×。 4.1.6 电子天平：感量0.1 g。 4.1.7 无菌锥形瓶:容量500 mL、250 mL。 4.1.8 无菌广口瓶：500 mL。 4.1.9 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)。
4.1.10 无菌平皿：直径90 mm。 4.1.11 无菌试管: 10 mm×75 mm。 4.1.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。 4.2 培养基和试剂 4.2.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录A 中A.1。 4.2.2 孟加拉红培养基：见附录A 中A.2。 4.3检验程序 霉菌和酵母计数的检验程序见图1。
图1 霉菌和酵母计数的检验程序4.4操作步骤 4.4.1 样品的稀释
4.4.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL 灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀液。 4.4.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 4.4.1.3 取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中, 另换一支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。 4.4.1.4 按 5.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。 4.4.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1 mL样品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照。 4.4.1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 4.4.2 培养 待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。 4.4.3 菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colonyforming units，CFU）表示。
微生物的显微直接计数法 一、实验目的 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。 二、实验原理 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3 所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106。 因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d） 三、实验器材 1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。 2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。 四、实验方法 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。 5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
GB 4789.15-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数 录入时间:2010-4-28 9:02:54 来源：国家卫生部 本标准自实施之日起代替 GB/T 4789.15-2003《食品卫生微生物学检验霉菌和酵母计数》。 本标准与 GB/T 4789.15-2003 相比，主要修改如下： ——修改了范围； ——修改了检验程序和操作步骤； ——修改了培养基和试剂； ——修改了设备和材料； ——修改了附录。 本标准的附录 A为规范性附录，附录 B 为资料性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ——GB 4789.15-1984、GB 4789.15-1994、GB/T 4789.15-2003。 1 范围 本标准规定了食品中霉菌和酵母菌（moulds and yeasts）的计数方法。 本标准适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：2℃～5℃。 2.2 恒温培养箱：28℃±1℃。 2.3 均质器。 2.4 恒温振荡器。 2.5 显微镜：10×～100×。 2.6 电子天平：感量 0.1 g。 2.7 无菌锥形瓶:容量 500 mL、250 mL。
2.8 无菌广口瓶：500 mL。 2.9 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)。 2.10 无菌平皿：直径 90 mm。 2.11 无菌试管: 10 mm×75 mm。 2.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。 3 培养基和试剂 3.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录 A 中 A.1。 3.2 孟加拉红培养基：见附录 A 中 A.2。 4 检验程序 霉菌和酵母计数的检验程序见图1。
山东大学实验报告2017年11月27日 ________________________________________ _________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物大小与数量的测定姓名：丁志康 一、目的要求 1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 2.增强微生物细胞大小的感性认识。 3. 明确血细胞计数板计数的原理。 4. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理 一）微生物大小的测定 1.微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物 大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测 微尺和镜台测微尺。 2.镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格每 格长0.01mm（即10μm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于 矫正目镜测微尺每格的相对长度。 3.目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有 等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以 测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大 倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺 测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放 大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物 细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 4.球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直 径约为0.8μm，枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3μm。 二）微生物数量的测定 1.微生物数量的测定有多种方法，本次试验中使用显微镜直接计数法。显微镜直接 计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻 片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前 国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。 后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间 的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（除 了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法， 此法一般用于牛乳的细菌学检查。)显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操
细菌计数试验方案 1 菌种 葡萄球菌菌株（分离奶牛乳房炎奶样），由本实验室筛选保藏． 2 培养基 平板培养基：普通营养琼脂． 液体培养基：普通肉汤． 3 仪器和器具 分光光度计；摇床；试管；移液器；青霉素瓶． 4 方法 4.1 接种： 将菌接种于平板培养基上,37℃培养24 h后，在试管中加入10ml液体培养基选取平板培养单个菌落2－3个进行接种，接种后37℃、震摇培养． 4.2 离心： 将液体培养的细菌部分无菌分装离心管，3000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用生理盐水/PBS重悬，适当调整浓度，进行OD值测定；另外一部分液体培养细菌进行活菌计数用。4.3 菌体最适吸收波长测定： 以生理盐水/PBS做对照调零，取适当稀释浓度菌液，对其进行Uv波长（300-900nm）扫描测定OD值(表1)，据此确定其最大光吸收波长并用于以后各步OD值的测定． 表1 细菌不同波长扫描的光吸收值 波长/nm 300 350 400 450 460 470 480 490 500 550 600 OD值 4.4 菌体生长曲线测定： 取盛有10mL普通肉汤的试管13个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、22、24h。用移液器分别准确吸取20μL菌液加入已编号的13个试管中，于37℃下振荡培养。然后分别按对应时间将试管取出，立即按上述步骤离心，进行OD值测定，同时进行作平板计数。(表2) 4.4.1 平板计数： 将每一时间菌液再梯度稀释(根据菌种而定，一般至lO-4、lO-5、lO-6、lO-7)，分别吸取0．5
mL涂平板(三个平行)，取平均数进行活菌的准确计数。 4.4.2 OD值测定： 将生理盐水/PBS倾倒入比色杯中，选用最适吸收波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用生理盐水/PBS适当稀释后测定，使其OD值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。 表2 生长曲线光吸收测定值 时间(h) 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20 22 24 OD值 活菌数 4.4.3 绘制曲线找出细菌的生长繁殖的4个时期：迟缓期，对数期，稳定期，衰亡期。 4.5 利用OD值估测细菌活菌数： 根据菌体生长曲线，找出菌体对数生长期，测定在对数生长期细菌活菌数。选对数期OD值在0.9-1之间的菌液作为原菌液样品，将此液分别作1：1.0、1：1.2、1：1.4、1：1.6、1：1.8、1：2.0六个稀释度稀释，分别测定其OD值，与此同时分别将此六个稀释度的菌液进行准确的细菌平板计数．记录OD值和相应的计数结果。（表3） 表3 细菌或菌数与OD值关系 稀释度生理盐水1：1.0 1:1.2 1:1.4 1:1.6 1:1.8 1:2.0 OD值 活菌数 根据比耳定律，溶液的浓度过高或过低，均能影响测量结果的准确性，固此选择OD值在0.2—1之间的范围确保结果回归方程r均大于0.95．从而证明了在此光度的范围内，细菌菌液的吸光度与细菌活菌数之间呈强相关性。
一、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。 二、适用范围：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。 三、责任者：质量标准分析方法验证小组。 四、正文： 1、验证申请 2、验证立项申请表 3、验证方案 4、验证方案的批复 5、验证报告 6、验证报告的审批 7、验证证书
细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请。我公司细菌、霉菌及酵母菌计数方法严格按照《中华人民共和国兽药典》2005年版质量标准分析方法验证指导原则进行，今拟对细菌、霉菌及酵母菌计数方法进行验证。请予以批准！ 附：细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证小组成员名单 组长： 成员： 申报单位：质量标准分析方法验证小组 申报日期：年月日
验证申请批复
细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案 一、概述： 1、名称：微生物限度检查法细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证报告。 2、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。 3、验证判断标准：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ 4、验证人员： 质保部：负责对验证结果进行评价。 化验室：负责验证情况的检测和监督。 总经理：负责对验证结果进行评价。 5、验证日期： 二、验证 1、验证依据：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ微生物限度检查法。 按供试液的制备和细菌霉菌及酵母菌计数所规定的薄膜过滤法及其有关要求进行。 2、内容： （1）菌液所用的菌株传代次数为3 代，接种大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，培养24小时， 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为60cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7天，加入5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌沙布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数60cfu的孢子悬液。 （2）验证方法验证试验进行了3次独立的平行试验。 A、试验组供试液（Ⅰ）纯化水1ml（Ⅱ）药品名称（1：100）10g，取供试液
实验六细菌计数法 菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 目录 菌落总数介绍 检验方法 说明（一）样品的处理和稀释： （二）倾注培养 （三）计数和报告 菌落总数介绍 菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 检验方法 菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。检验方法参见：GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》 说明 （一）样品的处理和稀释： 1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。2．无菌操作：操作中
霉菌和酵母菌介绍及检测方法 一、霉菌和酵母菌介绍： 霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。 霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。 二、检验方法： 霉菌和酵母的计数方法，与菌落总数的测定方法基本相似。主要步骤为：将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法。 具体检测标准参见： GB4789.15-94，《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物检验霉菌和酵母计数》三、说明： 1．样品的处理。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。 2．样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差，在连续递增稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。在稀释过程中，为了使霉菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。 3．培养基的选择：在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基。 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA作平板计数时，必项加入抗菌素以抑制细菌。 孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。 高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。 4．倾注培养。每个样品应选择3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45℃，立即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来放温箱培养。大多数霉菌和酵母在25－30℃的情况下生长良好，因此培养温度25~28℃。培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。 5．菌落计数及报告：选取菌落数10~150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平
操作步骤 l．编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 2．稀释用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5ml 至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10- 1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。……其余依次类推。放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。 3.取样用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。 4．倒平板．尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。 5．计数培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5。一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。 由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。 平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。五、实验报告1．结果2．将培养后菌落计数结果填入下表2．思考题(1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板? (2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么? (3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。(4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里? (5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果?
霉菌和酵母菌检测 1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1.1 冰箱：2℃～5℃。 1.2 恒温培养箱：28℃±1℃。 1.3 均质器。 1.4 恒温振荡器。 1.5 显微镜：10×～100×。 1.6 电子天平：感量0.1g。 1.7 无菌锥形瓶:容量500ml、250ml。 1.8 无菌广口瓶：500ml。 1.9 无菌吸管：1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。 1.10 无菌平皿：直径90mm。 1.11 无菌试管：10mm×75mm。 1.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。 2 培养基和试剂 2.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录A中A.1。 2.2 孟加拉红培养基：见附录A中A.2。 3 操作方法 3.1 试验前准备 3.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。 3.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。 3.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。 3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。 3.2 样品稀释液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备样品稀释液。样品稀释液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。样品稀释液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 3.2.1 固体和半固体样品 称取25g样品至盛有225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225ml无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。 3.2.2 液体样品 以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 3.3 霉菌和酵母菌计数 3.3.1 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。 3.3.2 按3.3.1操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml 无菌吸管或吸头。 3.3.3 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 3.3.4 及时将15ml～20ml冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基或孟加拉红培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 3.4 培养 待琼脂凝固后，将平板翻转，28℃±1℃培养5d，观察并记录。 3.5 菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示。选取菌落数在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。 3.6 结果与报告
1、计数器测定法： 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。 2、电子计数器计数法: 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。 3、活细胞计数法 常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。 广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。 4、比浊法 比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。 此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。 5、测定细胞重量法 此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。 此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。 6、测定细胞总氮量或总碳量 氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。 7、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU） 这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例，简单介绍其操作： （1）.取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。 （2）.在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管 （3）.于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml. 一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物，用CCU法比较合适。
霉菌与酵母菌计数方法 1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例) 白色念珠菌(0)代 ↓ 传代培养 ↓ 实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养 基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天 ↓ 计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃, 培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu ↓ 计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温 度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基 1.１菌种 试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。 1。2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株) 取白色念珠菌得新鲜培养物 ↓ 用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液 取黑曲霉得新鲜培养物 ↓ 加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无 菌氯化钠溶液,将孢子洗脱 ↓ 采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内 ↓ 用含0。05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。９%无菌氯 化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液 菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、
1。３阴性对照 为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、 2、培养基适用性检查 按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板 ↓ 置表１规定条件下培养 ↓ 每一试验菌株平行制备2管或2个平皿 ↓ 同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验 ↓ 被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。5-2范围内,且菌落形态大小应与对照培养基上得菌落一致;被检液体培养基管与对照培养基管比较,试验 菌应生长良好 3计数方法适用性试验 供试液制备:水不溶性非油脂类供试品 ↓ 取供试品,用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液,或pH7。2磷酸盐缓冲液,或胰酪大豆胨 液体培养基 ↓ 制备成１:10供试液。 ↓ 若需要,调节供试液ｐH值至6~8。必要时,用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释、 ⒉接种与稀释 所加菌液得体积应不超过供试液体积得1％、为确认供试品中得微生物能被充分检出,首先应选择最低稀释级得供试液进行计数方法适用性试验。
实验四微生物平板菌落计数法 一、实验目的 学习并掌握平板菌落计数的基本原理和方法。 二、实验原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低，为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。 三、实验器材 1 ．菌种：酵母菌。 2 ．培养基：YEB培养基。 3 ．仪器或其他用具： 1ml 无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5ml 无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。 四、实验步骤 1 ．编号 取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-4、 10-5、 10-6（稀释度）各 2 套，另取 6 支盛有 4.5ml 无菌水的试管，依次标是 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6。 2 ．稀释 用 1ml 无菌吸管吸取 1ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放0.5ml 至 10-1的试管中，此即为 10 倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。