大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。 具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 （二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。证
肠道菌群研究的主要方法 长期以来，为了研究肠道菌群的成员及其功能，科学家们建立和发展了众多技术 手段。经典的微生物学研究方法主要通过对细菌进行纯培养，然后在不同的培养条件下对细菌的生理活性进行研究。而随着分子生物学技术的飞速发展，在对环境中的复 杂微生物群落进行研究时，科学家们越来越多地运用不依赖于培养的方法，全面分析 各种微生物在环境中的活动和对环境的影响。 基于分离培养的方法 在肠道微生物学研究中，科学家们通常使用一定的选择性液体或固体培养基，对 粪便或肠道粘膜、肠道内容物等样本进行培养和富集，并对培养得到的细菌种类进行分析。根据肠道细菌的特性，对肠道菌进行培养通常需要在厌氧的条件下进行，严格 的厌氧和培养基的选择对于肠道菌的分离和生长非常重要。但是，局限于纯培养的方法具有很多不足之处。首先，体外培养体系难以模拟微生物在肠道中自然生长繁殖的条件，因此绝大多数的肠道微生物都还不能通过纯培养的方法得到分离；其次，仅仅依靠形态学和生理生化检测也不能对菌株进行准确的鉴定。因此，在研究肠道菌群结构和功能的研究中，研究者们通常结合分离培养方法和分子生物学方法，对感兴趣的细菌种类进行研究。 二．分子生态学研究方法 分子生态学方法通常以环境中各种微生物的基因组核酸（DNA 或RNA）为研究 对象。在以肠道菌群为对象的分子生态学研究中，研究者们最常使用核糖体小亚基 RNA 基因（细菌中的16S r RNA 基因）的全部或部分序列作为分子标签来代表物种，以基 因序列的多样性代表物种的多样性，从而对菌群的组成结构进行分析。细菌16S r RNA 基因具有广泛性、进化变异小、具备高保守区和高变区（V 区）等特点，同时序列还具有信息 量巨大且更新迅速的公开数据库，如Database Project（RDP）、SILVA 、Greengenes 等等，研究者们可以方便地将自己研究中的16S r RNA基因序列与数据库进行比对，确定细菌的分类地位。类似的，为了对肠道菌群中具有特定功能的类群进行检测，研究者们也建立了以功能基因片段为分子标签的分析方法。 常用的分子生态学分析方法分为两大类：基于DNA 指纹图谱的分析方法和基于DNA 测序技术的分析方法。除此之外，可用于实时定量的荧光定量PCR（Real time quantitative PCR）和荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）也是常用的分析手段。DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的结构差异。最常用的DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）和末端片段长度多态性（Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP）等。 不同于指纹图谱技术，DNA 测序技术的目的在于通过直接获取序列核酸信息的方法， 对群落中各物种的进化地位作出判断。基于单克隆质粒、转化细胞构建和桑格（Sanger）双脱氧法测序的16S r RNA 基因克隆文库长期以来广泛用于研究群落中微生物组成的方法，已被多次应用于人体肠道菌群的多样性分析，并获得了在物种检测深度和物种鉴定水平上均远远优于DNA 指纹图谱技术的结果 肠道菌群与健康相关研究中的应用
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表
注：+，表示阳性；—，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确
肠道菌群粪便涂片检查—用于菌群失调的诊断和防治 理论和基础 一、粪便直接涂片的优缺点： 1、优点： ①设备简单 ②操作简单 ③时间短 ④形象直观，直接了解粪便菌群的“像”，熟练者对诊断菌群失调有较高的准确性。 2、缺点： ①检验者必须有一定的经验，否则易判断错误 ②主要是定性检查，确定分度较困难。 二、操作技术： 1、涂片将新鲜大便直接涂抹在洁净的玻片上，粪便不可稀释以防细菌变形。标本务求新鲜，涂片厚薄适宜。 2、外观肉眼检查外观颜色、形状（若含有膜状物的大便应补做艰难梭菌培养）。 3、镜检染色技术是诊断准确成功的关键，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌要对比鲜明。镜检时应将涂片视野全面观览，切不可看几个视野就计数或报告。 三、检查方法：
1、细菌总数：观察菌群涂片首先要总览细菌总数。了解涂片上细菌的数量是增多还是减少，有无优势菌或真菌。细菌总数过多的情况较少见或不易引起重视。菌群失调时细菌总数多在正常、减少或消失。 细菌总数评定标准 每油镜视野细菌数评价 ＜10显著减少 11—100明显减少 101—500略微减少 501—5000正常 ＞5000增多 2、观察革兰氏阳性、阴性杆菌及球菌的比率改变 革兰氏阳性杆菌：革兰氏阴性杆菌：革兰氏阳性球菌：革兰氏阴性球菌（包括球菌/杆菌）比率反映了粪便菌群的质素，它一般不受粪便稀释或浓缩的影响，所以较细菌总数有更大的意义，更能反映菌群的本质和预后。 选定有代表性视野中的部分区域作细菌分类计数，需要数100—200个细菌以求得比例。不同年龄的人的比例都不一样，一般杆菌与球菌比例约为75：25。 各年龄组细菌比率平均值的正常参考值（%） 年龄革兰氏阳性杆菌革兰氏阴性杆菌革兰氏阳性球菌革兰氏阴性球菌 1d30.7—61.538.5—60.90—2.20—0.01 2d60.0—71.634.8—36.93.0—3.50—0.01 3d66.9—82.716.0—31.41.3—1.60—0.05 4d79.2—86.212.4—19.21.4—1.70—0.1 5d85.5—87.511.0—12.81.4—1.70.08—0.4 6d—7d75.4—90.17.2—20.81.3—2.90.1—0.6
大肠菌群检测方法 进入无菌室步骤 1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。 2．关灯后0?5小时后放可进入。 3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套 实验步骤 1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成） 2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。 3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml） 4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml） 5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液 7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml） 8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。） 10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中） 11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成 －2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成 －3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样 12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面） 13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。 14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准） 15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。16，清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。
大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。 1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3 操作步骤 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL 灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
肠道菌群细菌的鉴定 一、实验目的 1.掌握革兰染色法。 2.掌握IMViC试验。 二、仪器与试剂 玻片，接种环，生理盐水，酒精灯，结晶紫溶液，卢戈氏染液，石炭酸-复红溶液，沙黄液，光学显微镜，二甲基氨基苯甲醛试剂，葡萄糖蛋白胨水培养基，甲基红试剂（甲基红0.02g，95%酒精60mL，蒸馏水40mL），6%α-萘酚酒精溶液，40% KOH，铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源的培养基，层析滤纸，正丁醇，甲酸，1.5%乳酸，1.5%乙酸溶液，3%溴甲酚蓝酒精溶液，层析缸，需氧血琼脂平板，厌氧血琼脂平板，七叶苷培养基，胆汁七叶苷培养基，65g/L NaCl血清肉汤，PYR试剂，DNA琼脂平板，1 mol/L盐酸，MRS培养基，X-Gal。 三、实验步骤 1.革兰染色法 （1）涂片：取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握培养皿，右手持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取培养细菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。 （2）干燥：目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然 干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。 （3）固定：手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3秒，以玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。 （4）初染：将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色1~3分钟，用流水缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染液）直至无颜色流下为止。 （5）媒染：加卢戈氏染液4~5滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒净。 （6）脱色：在95%酒精缸中脱色约3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。 （7）复染： 用稀释石炭酸-复红（或沙黄液）复染半分钟后按上法冲洗。 （8）光学显微镜下观察细菌染色情况
肠道菌群粪便涂片检查—用于菌群失调的诊断和防治理论和基础 一、粪便直接涂片的优缺点： 1、优点：①设备简单②操作简单③时间短④形象直观，直接了解粪便菌群的“像”，熟练者对诊断菌群失调有较高的准确性。 2、缺点：①检验者必须有一定的经验，否则易判断错误②主要是定性检查，确定分度较困难。 二、操作技术： 1、涂片将新鲜大便直接涂抹在洁净的玻片上，粪便不可稀释以防细菌变形。标本务求新鲜，涂片厚薄适宜。 2、外观肉眼检查外观颜色、形状（若含有膜状物的大便应补做艰难梭菌培养）。 3、镜检染色技术是诊断准确成功的关键，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌要对比鲜明。镜检时应将涂片视野全面观览，切不可看几个视野就计数或报告。 三、检查方法： 1、细菌总数：观察菌群涂片首先要总览细菌总数。了解涂片上细菌的数量是增多还是减少，有无优势菌或真菌。细菌总数过多的情况较少见或不易引起重视。菌群失调时细菌总数多在正常、减少或消失。 细菌总数评定标准 每油镜视野细菌数评价 ＜10显著减少 11—100明显减少 101—500略微减少 501—5000正常 ＞5000增多 2、观察革兰氏阳性、阴性杆菌及球菌的比率改变 革兰氏阳性杆菌：革兰氏阴性杆菌：革兰氏阳性球菌：革兰氏阴性球菌（包括球菌/杆菌）比率反映了粪便菌群的质素，它一般不受粪便稀释或浓缩的影响，所以较细菌总数有更大的意义，更能反映菌群的本质和预后。 选定有代表性视野中的部分区域作细菌分类计数，需要数100—200个细菌以求得比例。不同年龄的人的比例都不一样，一般杆菌与球菌比例约为75：25。 各年龄组细菌比率平均值的正常参考值（%） 年龄革兰氏阳性杆菌革兰氏阴性杆菌革兰氏阳性球菌革兰氏阴性球菌 1d30.7—61.538.5—60.90—2.20—0.01 2d60.0—71.634.8—36.93.0—3.50—0.01 3d66.9—82.716.0—31.41.3—1.60—0.05 4d79.2—86.212.4—19.21.4—1.70—0.1
大肠菌群的定义 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠杆菌的定义 大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。 卫生学意义 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。 大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。 大肠杆菌的生物学特性 基本形态：
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。 培养特性： 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。 大肠菌群及大肠杆菌测定 ——MPN法检验流程（FDA BAM） 1、检样50g+450ml稀释液 2、适当十倍稀释样品 3、选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL。在35℃下，培养24 ± 2h ~48 ± 2h。 4、（1）没有产气管→报告阴性 （2）有产气管：①接种BGLB肉汤管→查MPN表报告结果（大肠菌群） ②接种EC肉汤→在44.5±0.5 ℃ （水浴培养）24 ± 2h ~48 ± 2h。 →产气管接种EMB平板（35℃、18~24h），从EMB平板上挑取5个可疑菌 转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气 →查MPN表报告结果（大肠菌群）。 大肠菌群测定——MPN法检验几点说明 MPN检索表： MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。 初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。 2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。
三级学科微生物学及检验项目编号码_______________ 项目——导师制实验报告 实验名称: 肠道菌群分离培养、鉴定及药敏分析 学生姓名: 曾正勇 年级: 2013医检1班 专业: 医学检验学 指导教师: 王健教授 实验日期: 2015年11月4日 安徽理工大学医学院 二O一五年十一月
一、实验概述 细菌:广义的细菌即为原核生物。是指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区（nuclear region)（或拟核）的裸露DNA的原始单细胞生物，包括真细菌（eubacteria）和古生菌（archaea）两大类群。人们通常所说的即为狭义的细菌，狭义的细菌为原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生物，是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。 肠道菌群是肠道菌群，人体肠道的正常微生物，如双歧杆菌，乳酸杆菌等能合成多种人体生长发育必须的维生素，如B族维生素（维生素B1、B2、B6、B12），维生素K，烟酸、泛酸等，还能利用蛋白质残渣合成必需氨基酸，如天冬门氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和苏氨酸等，并参与糖类和蛋白质的代谢，同时还能促进铁、镁、锌等矿物元素的吸收。这些营养物质对人类的健康有着重要作用，一旦缺少会引起多种疾病。人体肠道内寄生着10万亿个细菌，它们能影响体重和消化能力、抵御感染和自体免疫疾病的患病风险，还能控制人体对癌症治疗药物的反应.根据可培养细菌的数量分类在肠道菌群中，可以培养到的细菌有400余种，依据其数量多少可以分为主要(优势)菌群(predominant mieroflora)和次要菌群(sub—dominant microflora)。 ①主要(优势)菌群：指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，一般在10～10cfu/g以上，包括类杆菌属、优杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属等专性厌氧菌，通常属于原籍菌群。优势菌群是对宿主发挥生理功能的菌群，在很大程度上影响着整个菌群的功能，决定着菌群对宿主的生理病理意义。 ②次要菌群：数量在10～10cfu/g以下，主要为需氧菌或兼性厌氧菌，如大肠杆菌和链球菌等，流动性大，有潜在致病性，大部分属于外籍菌群或过路菌群。乳杆菌在数量上归为次要菌群，在回肠中含量较高，但是其具有较为重要的功能，因此在功能上归属于优势菌群。 优势菌群与微生境的特征密切相关，以厌氧菌为主的优势菌群，一般生存在清除速率较低、营养丰富的微生境，如结肠，所以菌群密集度和多样性高；而兼性或需氧菌群一般生活在清除速率高的微生境，如小肠近端，其菌群密集度和菌群多样性较低，由于菌群密集度低，很难称得上是“优势菌群”；在酸性微生境中，耐酸、产酸的细菌成为优势菌群。微生境的改变，可使菌群中的优势菌群发生替换，如便秘时大便优势菌群主要是革兰阴性厌氧菌，慢性腹泻时常见革兰阳性杆菌为优势菌群，而在严重急性腹泻时大便中的优势菌群为致病性细菌或某些兼性/需氧细菌。在肠道中，尽管专性厌氧菌是主要菌群，占据优势，但这些菌群又依赖于需氧菌或兼性厌氧菌等次要菌群的存在，因为后者在增殖过程中消耗氧气，保证前者的生长条件。一个生理性组合的肠道菌群是有益的，而病理性组合的肠道菌群是有害的。 人体肠道内的微生物中，超过99%都是细菌，存活着数量大约有100兆个，有500～1000个不同的种类。这些数目庞大的细菌大致可以分为三个大类：有益菌、有害菌和中性菌。
肠道菌群对动物免疫的影响及机理 在动物体内环境中通常有一层微生物或微生物层，在正常情况下即动物处于健康状态时，并未表现异常或致病现象，称这一层微生物为正常菌群或固有菌群和原籍菌群。这些菌群是动物机体内环境中不可缺少的组成部分，对动物宿主是有益无害的。肠道菌群形成一个庞大而复杂的微生态系统，有重要的生理意义。包括抵御病原体侵袭、刺激机体免疫器官的成熟、激活免疫系统及参与合 成多种维生素、调节物质代谢等作用。 1、菌群屏障作用 动物的先天性或非特异性免疫应答，亦即机体免疫系统识别和排除各种异物，主要依靠机体的屏障作用，包括正常菌群、机体的皮肤黏膜、补体等体液因子抑菌、杀菌、溶菌等作用、吞噬细胞的吞噬作用等。从现代的研究不难看出，正常菌群在机体的屏障作用中是极为重要的一个方面。 2、影响黏膜免疫 研究发现双歧杆菌抑制其他肠道菌的效果与诱生一种抗菌物质——分泌型球蛋白（SIgA）有关。有人研究证明乳酸杆菌粘附形成的空间占位，是防止其他菌对组织附着的一个重要的保护性机制。嗜酸性乳杆菌可以在肠黏膜免疫中发挥重要的免疫监视功能。口服干酪乳杆菌能增强宿主的黏膜的免疫反应，促进肠道分泌免疫球蛋白(SIgA)，即使饲喂低剂量的干酪乳杆菌也能引起SIgA的分泌。 3、促进免疫器官的生长发育 益生菌能促进机体的免疫器官的生长发育、成熟，增加T、B淋巴细胞的数量，胸腺淋巴细胞免疫球蛋白含量增多，启动免疫应答。有关研究表明，实验组免疫器官内的淋巴密度密集，数量增多以及浆细胞的数量增多，中枢免疫器官的
淋巴细胞和上皮网状细胞数量增多，这标志免疫器官内部淋巴细胞的发育情况和免疫功能的成熟程度，从而向外周免疫器官脾脏、盲肠扁桃体以及全身各处免疫组织源源不断的输送T、B淋巴细胞。 4、激活免疫因子 益生菌能明显的激活巨噬细胞活性及细胞因子介导素的分泌，增强免疫功能，提高宿主的抗病能力。这些因子在某些情况下，可以代替免疫调节剂，因为它们不仅能刺激造血活性，而且也能增强成熟细胞的功能，细菌细胞表面结合的细胞因子对细菌调节机体一系列免疫反应是非常重要的。 5、干预细胞免疫 干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌可激活巨噬细胞功能，刺激产生免疫应答。还通过巨噬细胞和T细胞、NK细胞活性的增强来增强人体的免疫；巨噬细胞、NK细胞、T细胞的活化，有益于增强周围血管和局部淋巴结中淋巴细胞的免疫，T辅助细胞、NK细胞的增加，可使抑制性T细胞减少。乳酸菌能干预细胞免疫。乳酸菌、双歧杆菌能阻断许多微生物的入侵和粘附（位组抑制）。 6、和疫苗混合使用提高抗体水平 有研究表明，在ND疫苗接种前后饲用益生素，可提高鸡血清中抗NDV血凝抑制抗菌体，延长抗体的高峰期。 7、具有免疫佐剂活性 Himanen等（1993）研究枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸（LTA）和肽聚糖磷壁酸复合物的生物活性时，发现两者均具有很强的免疫佐剂活性作用。地衣芽孢杆菌的免疫促进作用是机体经口服芽孢杆菌后，在肠道淋巴组织集合的抗原结合位点上直接作为免疫佐剂，或者通过调整宿主体内的微生物群，尤其是双歧杆菌菌群起主导作用，间接的发挥免疫佐剂的作用，提高机体的局部或全身防御功能。
大肠菌群检测方法(中文翻译)
3 定义和简介 3.1 定义 所有的大肠菌群均是发酵乳糖，革兰氏阴性，无牙孢的杆菌。官方的对大肠菌群的定义可能以培养温度（30、32、35、37）不同作评价；或以确定是否发酵乳糖产气作为定义的一个特征.大多数ISO和其他官方标准是利用发酵乳糖产气作为一个定义特征。而在ISO 4832 中则利用了在VRBL上的菌落大小作为其唯一的定义特征。 鉴于这些定义的不同，建议实验室根据相关定义用相应的适当方法。 ●国际标准：样品分析是否符合国际交易规范 ●官方主市场调整定义：样品分析是否符合地方标准 ●一般定义：样品分析是否符合一般规范。 任何必要方法的调改必须通过市场实验室质量确认中心和雀巢研究中心食品安全微生物组的协助。 以下为一些官方定义例子： *ISO 4831大肠菌群是通过其在选择性肉汤上的生长和发酵乳糖产气能力来定义*AOAC INTERNATIONAL, APHA/FDA定义大肠菌是指发酵乳糖产酸产气（T=32或35度）革兰氏阴性杆菌 *ISO 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37℃) 3．1．1 液体培养基中 ISO 4831 大肠菌群是根据其在选择性肉汤中生长能力和发酵乳糖产气情况来定义.(T=30或35或37℃) AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。（T=32或35℃） 由LI第一章概述，大肠菌群是指发酵乳糖气微生物群。 3．1．2 固体培养基中 IOS 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37℃) AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。基于以上定义可知大肠菌群在VRBL培养基上会形成5mm以上直径的红色菌落且在确认试验中发酵乳糖产气 由LI第二章概述，大肠菌群是指在VRBL琼脂培养基上会形成特征性菌落且在确认试验中发酵乳糖产气微生物群。 3．2 简注 BGLB：亮绿乳糖胆盐培养基肉汤 LST：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 MPN：最可能数 VRBL：紫红胆汁琼脂 4 安全防范 大肠菌群不表现为无害，注意实验室的良好操作。 5 参考资料 5．1 LIs中提到的及其它心要文件 LI-00．700 LI-00．702
大肠菌群检测方法 中文翻译
3 定义和简介 3.1 定义 所有的大肠菌群均是发酵乳糖，革兰氏阴性，无牙孢的杆菌。官方的对大肠菌群的定义可能以培养温度（30、32、35、37）不同作评价；或以确定是否发酵乳糖产气作为定义的一个特征.大多数ISO和其它官方标准是利用发酵乳糖产气作为一个定义特征。而在ISO 4832 中则利用了在VRBL上的菌落大小作为其唯一的定义特征。 鉴于这些定义的不同，建议实验室根据相关定义用相应的适当方法。 ●国际标准：样品分析是否符合国际交易规范 ●官方主市场调整定义：样品分析是否符合地方标准 ●一般定义：样品分析是否符合一般规范。 任何必要方法的调改必须经过市场实验室质量确认中心和雀巢研究中心食品安全微生物组的协助。 以下为一些官方定义例子： *ISO 4831大肠菌群是经过其在选择性肉汤上的生长和发酵乳糖产气能力来定义 *AOAC INTERNATIONAL, APHA/FDA定义大肠菌是指发酵乳糖产酸产气（T=32或35度）革兰氏阴性杆菌 *ISO 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37℃)
3．1．1 液体培养基中 ISO 4831 大肠菌群是根据其在选择性肉汤中生长能力和发酵乳糖产气情况来定义.(T=30或35或37℃) AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。（T=32或35℃） 由LI第一章概述，大肠菌群是指发酵乳糖气微生物群。 3．1．2 固体培养基中 IOS 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37℃) AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。基于以上定义可知大肠菌群在VRBL培养基上会形成5mm以上直径的红色菌落且在确认试验中发酵乳糖产气 由LI第二章概述，大肠菌群是指在VRBL琼脂培养基上会形成特征性菌落且在确认试验中发酵乳糖产气微生物群。 3．2 简注 BGLB：亮绿乳糖胆盐培养基肉汤 LST：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 MPN：最可能数 VRBL：紫红胆汁琼脂 4 安全防范 大肠菌群不表现为无害，注意实验室的良好操作。 5 参考资料
大肠杆菌和大肠菌群计数方法 Enumeration of Escherichia coli and the coliform 章节内容： ?传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法 ?LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌 （除双壳类软体动物制品外） ?瓶装水检测方法 ?贝类和贝类肉制品检测方法 ?柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法 ?大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法 ?参考文件 大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich 发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。 大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。 1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。与已知的非产气致病菌容易区别开来。 因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂。于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。 虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大肠菌群。粪大肠菌群的检测，除水、贝类、贝类养殖水在44.5℃进行，其他所有食品都在45.5℃进行。粪大肠菌群包含绝大部执蟪Ω司? 克雷伯氏菌也作为粪大肠菌群,但克雷伯氏菌的检出被认为与粪便污染并无关系。因此,大肠杆菌又被作为一个重要指标。快速鉴定大肠杆菌的新方法采用，使检测大肠杆菌相对容易了。
大肠菌群测定方法 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工 作中。 二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MP N表，报告每100ml（g）大肠菌群的M PN值。 具体操作参见《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 （二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48± 2h，观察是否产气。证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。具体操作参见SN0169-92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》三、说明：
游泳池水中大肠菌群检验方法 一、大肠菌群多管发酵法测定 1定义 大肠菌群（coliform bacteria）系指一群在36±1℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2 仪器 见《公共场茶具的大肠菌群测定方法》。 3培养基和试剂 3.1乳糖蛋白胨培养液 3.1.1成分：蛋白胨 10g 牛肉膏 2g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6%（V/V）溴甲酚紫乙醇溶液 1mL 蒸馏水 1000mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。 3.1.2配法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调pH到]7.2～7.4。再加入1ml 1.6%溴甲酚指示剂，充分混匀，分装到含有倒管的试管中，115℃高压灭菌15min。 3.2伊红美兰琼脂 见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。 3.3革兰氏染色液 风《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。 3.4染色法 见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。 4推测性试验 4.1在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100ml。 4.2在10支装有5ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10ml。 4.3轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。 4.4观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。 5证实试验 5.1平板分离 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置 36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。 5.2复发酵试验 挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于 36±1℃培养箱中，培养24h。 5.3凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的最大可能数（MPN）检索表得出1000ml水样中总大肠菌群的MPN值。