感受态BL21、BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS
BL21没有T7 RNA聚合酶基因, 因此不能表达T7启动子控制的目的基因, 但是可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。
BL21(DE3)是λDE3溶原菌，带有T7 RNA聚合酶，可用于表达T7启动子控制的目的基因，也可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。
BL21（DE3）pLysS含有pLysS质粒，一种与pET共存的表达T7裂解酶的质粒，可以减少目的基因的本底表达，提供更严紧的控制。
真核原核启动子
原核：
几个常用的启动子和诱导调控表达系统
1.最早应用于的表达系统的是Lac乳糖操纵子，由启动子lacP + 操纵基因lacO + 结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。
https://www.doczj.com/doc/2e18426649.html,cUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI 的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO 上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
3.tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
4.trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。
5.在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
6.IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI
的温度敏感突变体，30℃下抑制转录，42℃开始发挥作用。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物的稳定。
7.以λ噬菌体转录启动子PL、PR 构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30℃下阻遏启动子转录，42℃下解除抑制开始转录。同样的，PL、PR表达载体需要以cI857(ts)作为表达菌株，现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR 启动子的转录。比如Invitrogen的PL表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的cI基因
溶源化到宿主菌染色体上，通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子，抑制cI基因的表达，从而解除强大的PL启动子的抑制。
8.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。1.噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。2.另一种策略是用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7 RNA 聚合酶表达的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成。此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7 RNA 聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。由于T7 RNA 聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平；之二是采用带有T7 lac 启动子的载体——在紧邻T7 启动子的下游有一段lacI操纵子序列编码表达lac 阻遏蛋白(lacI)，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 启动子并抑制其表达，也作用于载体T7 lac 启动子，以阻断任何T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLacI工转化也是同样的原理。如果这还不够，更为严谨调控手段还有——在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA 聚合酶的基因——T7溶菌酶基因，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。通过几种不同方法来巧妙调控T7聚合酶合成，T7启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达系统。
真核：
真核表达系统的研究进展
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体 (一般为质粒)转化细
菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
1．酵母表达系统
最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0x1)，在该基因的启动子(PAXOI)作用下，外源基因得以表达。PAXOI是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOx1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAXOI可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达,将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为 E.coli／Pichia Pastoris的穿梭载体，其中含有E.coli复制起点和筛选标志，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量扩增.目前，将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。利用PAXOI表达外源蛋白时,一般需很长时间才能达到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使得实验操作过程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多种。利用三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子代替 PAXOI，不需要甲醇诱导。培养过程中无需更换碳源，操作更为简便，可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。
2．昆虫细胞表达系统
杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)作为表达载体。在AcNPV感染昆虫细胞的后期，核多角体基因可编码产生多角体蛋白，该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体。核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力，故常被用来构建杆状病毒传递质粒。克隆入外源基因的传递质粒与野生型 AcNPV共转染昆虫细胞后可发生同源重组，重组后多角体基因被破坏，因而在感染细胞中不能形成包涵体，利用这一特点可挑选出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低，且载体构建时间长，一般需要4～6周。此外，昆虫细胞不能表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。
在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解，胞质内的物质释放出来，与目的蛋白混在一起，从而使蛋白的纯化工作变得很困难，另外水解酶的释放会降解重组蛋白。为了克服以上这些困难，科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒ie-1 基因启动子表达外源蛋白，但效果都不明显。Farrel等介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统，该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列：(1) Bombyx mori的肌动蛋白基因启动子；（2）Bombyx mori的核型多角体病毒(BmNPV)的立早基因ie-1(编码俄IE-1蛋白，该蛋白是种转录激活因子，可在体外激活肌动蛋白基因启动子)；(3) BmNPV的同源重复序列3(HR3)可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。三者协同作用，可使转录活性提高
1000倍以上，从而大大地提高外源蛋白的表达水平。另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒(HyNPV)被应用于昆虫细胞表达系统的构建，该病毒由AcNPV及 Bni'qP 发展而来。
一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分为非分泌性。为了解决这个问题将Hsp70(热休克蛋白70)与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平，这是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能被分泌至胞外。如果到达内质网前，前体多肽就伸展开来，暴露出疏水残基，残基间的相互作用可引起多肽的凝聚，这对最终的表达水平有很大影响。而Hsp70是一种分子伴侣，能够与新翻译的多肽结合，抑制前体肽的凝聚使前体肽顺利到达内质网进行加工，从而提高蛋白的分泌水平。
最近，人们又构建了杆状病毒-S2表达系统，该系统能将重组杆状病毒转染果蝇S2细胞，以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫细胞(如 sf9、sf21)中复制，不能在其他昆虫细胞(如果蝇细胞)中复制，然而目前研究表明在一定条件下，杆状病毒也能感染果蝇细胞。在果蝇细胞中，杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发生作用。杆状病毒-S2表达系统的表达载体利用的是果蝇启动子如Hsp70启动子、肌动蛋白5C启动子、金属硫蛋白基因启动子等，其中，Hsp70启动子的作用最强。重组杆状病毒感染S2细胞后不会引起宿主细胞的裂解，且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似，因此，杆状病毒-S2系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全，表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。
3．哺乳动物细胞表达系统
由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法：一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞，二是通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。外源基因的体外表达一般采用质粒表达载体，如将重组质粒导入CHO 细胞可建立高效稳定的表达系统，而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。目前，病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具，在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相当大(约187kb)，利用它作为载体可同时插入几种外源基因，从而构建多价疫苗。另外，逆转录病毒感染效率高，某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因，但要注意的是逆转录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险性。
由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高，即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒，将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌。另一种方法是通过CrelaxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都插入laxP 位点，然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞，通过Cre介导两个laxP位点之间的DNA发生重组，可获得重组腺病毒，这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。最近，人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。由于杆状病毒是昆虫病毒，在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表达，而且载体的构建容易，因而利用杆状病毒进行基因转移为我们提供了很好的途径。
利用哺乳动物细胞表达外源基因时，大多数情况下不需要诱导，但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导，这样可避免表达产物产生早期就对细胞产生影响。哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导，还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子。但这些系统存在一些共同的缺陷，如诱导表达特异性差；当系统处于关闭
状态时表达有泄漏诱导剂本身有毒性，常对细胞造成损伤等。
为此，Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系统，该系统由调节质粒和反应质粒组成。调节质粒中具有编码转录激活因子(fIA)的序列，在没有四环素或强力毒素存在的情况下 tTA可引起下游目的基因表达。随后Gossen等又对tTA的氨基酸序列进行了改造，构建了受四环素正调节的Tet-on基因表达系统，该系统在没有四环素的情况下启动子不被激活，而在加入四环素或强力毒素后目的基因高效表达。四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性强的优点。
外源蛋白的表达会对哺乳动物细胞产生不利影响，因此利用哺乳动物细胞表达外源基因时，一个主要问题便是外源基因不能持久稳定地表达。Mielke等构建了一种能够在哺乳动物中稳定表达异二聚体蛋白的载体系统，在这个系统中，编码抗体重链和轻链的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被转录成三顺反子mRNA。内部的顺反子通过内核糖体进入位点(IREs)介导进行翻译，通过持续选择压力，无需繁琐的筛选过程，便可获得持久、稳定表达抗体分子的重组体。
哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、SP2／0、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。
利用基因工程技术表达外源蛋白。其产量还不高，难以满足大规模的实际应用。通过转基因动物或转基因植物技术可从动物的乳汁或植物的叶组织中很方便地获得大量较纯的生物活性物质，但目前这项技术还不很成熟，有待进一步研究。
4．结语
总之，各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。Van der GeId等利用不同的表达系统表达了蛋白激酶_3(PR30)，并对它们的抗原性进行了比较，结果发现，在哺乳动物细胞中表达的PR3具有与抗 PR3抗体结合的所有表位，在昆虫细胞中表达的 PR3具有大部分表位，而在甲醇酵母中表达的 PR3只具有少数几个表位。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需表达的蛋白质性质、实验条件、生产成本、表达水平、安全性等，权衡利弊后再选择相应的表达系统。
原核生物基因组和真核生物基因组的区别： 1、真核生物基因组指一个物种的单倍体染色体组(1n)所含有的一整套基因。还包括叶绿体、线粒体的基因组。 原核生物一般只有一个环状的DNA分子，其上所含有的基因为一个基因组。 2、原核生物的染色体分子量较小，基因组含有大量单一顺序 （unique-sequences），DNA仅有少量的重复顺序和基因。 真核生物基因组存在大量的非编码序列。包括： .内含子和外显子、.基因家族和假基因、重复DNA序列。真核生物的基因组的重复顺序不但大量，而且存在复杂谱系。 3、原核生物的细胞中除了主染色体以外，还含有各种质粒和转座因子。质粒常为双链环状DNA，可独立复制，有的既可以游离于细胞质中，也可以整合到染色体上。转座因子一般都是整合在基因组中。 真核生物除了核染色体以外，还存在细胞器DNA，如线粒体和叶绿体的DNA，为双链环状，可自主复制。有的真核细胞中也存在质粒，如酵母和植物。 4、原核生物的DNA位于细胞的中央，称为类核（nucleoid）。 真核生物有细胞核，DNA序列压缩为染色体存在于细胞核中。 5、真核基因组都是由DNA序列组成，原核基因组还有可能由RNA组成，如RNA病毒。 原核生物和真核生物区别（从细胞结构、基因组结构和遗传过程分析）主要差别 由真核细胞构成的生物。包括原生生物界、真菌界、植物界和动物界。真核细胞与原核细胞的主要区别是：
【从细胞结构】 1.真核细胞具有由染色体、核仁、核液、双层核膜等构成的细胞核；原核细胞无核膜、核仁，故无真正的细胞核，仅有由核酸集中组成的拟核 2.真核细胞有内质网、高尔基体、溶酶体、液泡等细胞器，原核细胞没有。 真核细胞有发达的微管系统，其鞭毛（纤毛）、中心粒、纺锤体等都与微管有关，原核生物则否。 3.真核细胞有由肌动、肌球蛋白等构成的微纤维系统，后者与胞质环流、吞噬作用等密切相关；而原核生物却没有这种系统，因而也没有胞质环流和吞噬作用。 真核细胞的核糖体为80S型，原核生物的为70S型，两者在化学组成和形态结构上都有明显的区别。 4.原核细胞功能上与线粒体相当的结构是质膜和由质膜内褶形成的结构，但后者既没有自己特有的基因组，也没有自己特有的合成系统。真核生物的植物含有叶绿体，它们亦为双层膜所包裹，也有自己特有的基因组和合成系统。与光合磷 酸化相关的电子传递系统位于由叶绿体的内膜内褶形成的片层上。原核生物中的蓝细菌和光合细菌，虽然也具有进行光合作用的膜结构，称之为类囊体，散布于细胞质中，未被双层膜包裹，不形成叶绿体。 【从基因组结构】 1.真核生物中除某些低等类群（如甲藻等）的细胞以外，染色体上都有5种或4种组蛋白与DNA结合，形成核小体；而在原核生物则无。 2.真核生物中除某些低等类群（如甲藻等）的细胞以外，染色体上都有5种或4种组蛋白与DNA结合，形成核小体；而在原核生物则无。 3.真核细胞含有的线粒体，为双层被膜所包裹，有自己特有的基因组、核酸合成系统与蛋白质合成系统，其内膜上有与氧化磷酸化相关的电子传递链
真核启动子 EF1a 常规表达用 mRNA 人延长因子1α来源 的强哺乳动物表达启动子 组成型 表达水平十分稳定，与细胞类型无关 PGK1 (人/小鼠) 常规表达用 mRNA 磷酸甘油酸酯激酶 基因来源的哺乳动物启动子 组成型 广泛表达,但可能因细胞类型而异。由于甲基化或脱乙酰作用，倾向于抵抗启动子下调。 human beta actin 常规表达用 mRNA β-肌动蛋白基因来 源的哺乳动物启动子 组成型 无处不在，鸡的启动子常用与启动子杂交 TRE 常规表达用 mRNA 四环素响应元件启动子 被四环素或 者类似物诱导 通常有本底表达 Ac5 常规表达用 mRNA 果蝇Actin 5c 基因 来源的强昆虫启动子 组成型 果蝇表达系统的常用启动子
CaMKIIa 光遗传学 基因表达 mRNA Ca2+/钙调蛋白依赖 的蛋白激酶II 启动 子 特异的 用于中枢神经系统/神经元表达。受到 钙和钙调蛋白调节。 TEF1 常规表达 用 mRNA 酵母转录延伸因子 启动子 组成型与哺乳动物的EF1a 启动子类似 ADH1 常规表达 用 mRNA 乙醇脱氢酶I的酵母 启动子 被乙醇抑制 全长版本很强，促进高表达。截短启 动子是组成型的，表达较低。 Ubi 常规表达 用 mRNA 玉米泛素基因的植 物启动子 组成型在植物中促进高表达 U6 小RNA 表达 shRNA 来源于人U6小核启 动子 组成型小鼠U6也使用,但效率略差。 常用的原核表达系统启动子
T7lac 高水 平基 因表 达 T7噬菌体来 源的启动子 加上lac操 纵子 几乎没有本底表 达，需要T7 RNA 聚合酶，受到lac 操纵子的控制， 可以被IPTG诱 导。 常用与pET载体，受到lac操纵子的严格调控 araBAD 常规 表达 用 阿拉伯糖代 谢操纵子的 启动子 阿拉伯糖诱导 弱，常用与pBAD载体。适合于快速调控和低的本底表达 lac 常规 表达 用 Lac操纵子 来源的启动 子 可以被IPTG或 者乳糖诱导 在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细 胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非 诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达， 能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为 Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上 通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的 诱导调控。 pL 高水 平基 因表 达 Lambda噬 菌体来源的 启动子 温度调节通常和温度敏感的cI857 抑制子搭配使用
原核生物和真核生物基因组的比较（我好想比较过了，是不是？） 原核生物和真核生物DNA复制的特点： 原核：一般只有一个复制起点，即一个复制子，复制子较长，复制起始点oriC含有3个13bp 的串联重复保守序列，复制起始之后在OriC上形式两个复制叉沿着整个基因组双向等速移动，并且形成θ形中间产物，两个复制叉在距离起点180°处汇合，在快速生长时，一个复制起点上可以形成多个复制叉，可以连续开始新的DNA复制； 真核：有多处复制起点，复制子相对较小，复制叉的移动速度较慢，由于有多个复制起点，所以后随链是以半不连续的方式复制的，在染色体全部完成复制之前，各个起始点上的DNA 的复制不能再开始。 原核生物和真核生物DNA转录的特点： 相同点：都是以DNA双链中的反义链为模板，在RNA聚合酶催化下，以4种核糖核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则，各核苷酸间以磷酸二酯键相连，不需要引物的参与，按5’- 3’方向合成 不同点：真核生物RNA聚合酶必须借助辅助蛋白才能与启动子结合；原核生物中一种RNA 聚合酶几乎负责所有mRNA、rRNA、tRNA的合成，真核生物有3类RNA聚合酶：I负责rRNA 合成，II负责hnRNA（前体mRNA）合成，III负责tRNA合成；原核生物基因启动区范围较小，而真核生物的启动区范围较大。 真核生物和原核生物mRNA的特征比较（这个也总结过了吧） 真核生物和原核生物在基因结构、转录和翻译方面的总体差异： （1）真核细胞中，一条mRNA链只能翻译出一条多肽链，原核生物则以多基因操纵子形式存在； （2）真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白结合，只有一小部分DNA是裸露的； （3）高等真核细胞DNA中很大一部分不转录，存在很多重复序列，而且基因内部还存在不被翻译的内含子； （4）真核生物能够有序根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能根据需要改变基因的拷贝数，原核生物中则非常少见； （5）原核生物转录的调节区很小，而真核生物基因转录的调节区则大得多； （6）真核生物RNA在细胞核中合成，需要通过核膜进入细胞质才能被翻译，原核生物中不存在这样严格的空间间隔； （7）真核生物的基因只用经过复杂的成熟和剪接过程才能被顺利翻译为蛋白质。 原核生物和真核生物细胞的比较： 相同点：都有细胞膜，都含有核糖体合成蛋白，都含有细胞质基质作为生理生化反应的场所，都以DNA作为遗传物质，都遵循碱基互补配对原则以半保留复制方式进行DNA复制； 不同点：（1）真核细胞有核膜包被的细胞核，原核细胞只有核区、没有核膜包被的细胞核；（2）真核细胞含有以高尔基体、内质网为代表的细胞内膜系统，原核细胞则没有；（3）真核细胞DNA与组蛋白及非组蛋白结合为染色质，原核细胞DNA则是裸露的DNA分子；（4）原核生物DNA一般边转录边翻译，而真核生物mRNA则需要先转录然后转运至细胞质基质中再进行翻译
真核启动子 EF1a 常规表 达用 mRNA 人延长因子1α来 源的强哺乳动物表达启动子 组成型 表达水平十分稳定，与细胞类型无关 PGK1 (人/小鼠) 常规表 达用 mRNA 磷酸甘油酸酯激酶 基因来源的哺乳动物启动子 组成型 广泛表达,但可能因细胞类型而异。由于甲基化或脱乙酰作用，倾向于抵抗启动子下调。 human beta actin 常规表 达用 mRNA β-肌动蛋白基因来 源的哺乳动物启动子 组成型 无处不在，鸡的启动子常用与启动子 杂交 TRE 常规表 达用 mRNA 四环素响应元件启 动子 被四环素或 者类似物诱导 通常有本底表达
Ac5 常规表 达用mRNA 果蝇Actin 5c 基因 来源的强昆虫启动 子 组成型果蝇表达系统的常用启动子 CaMKIIa 光遗传 学基因 表达 mRNA Ca2+/钙调蛋白依赖 的蛋白激酶 II 启 动子 特异的 用于中枢神经系统/神经元表达。受 到钙和钙调蛋白调节。 TEF1 常规表 达用mRNA 酵母转录延伸因子 启动子 组成型与哺乳动物的EF1a 启动子类似 ADH1 常规表 达用mRNA 乙醇脱氢酶I的酵 母启动子 被乙醇抑制 全长版本很强，促进高表达。截短启 动子是组成型的，表达较低。 Ubi 常规表 达用mRNA 玉米泛素基因的植 物启动子 组成型在植物中促进高表达
U6 小RNA 表达 shRNA 来源于人U6小核启 动子 组成型 小鼠U6也使用,但效率略差。 常用的原核表达系统启动子 T7lac 高水平基因表达 T7噬菌体来源的启动子加上lac 操纵子 几乎没有本底 表达，需要T7 RNA 聚合酶，受 到lac 操纵子的控制，可以被 IPTG 诱导。 常用与pET 载体，受到lac 操纵子的严格调控 Sp6 体外 转录/ 常规 表达 Sp6噬菌体来源的启动子 组成型, 需要SP6 RNA 聚合 酶 当用于体外转录的时候，专路方向有可能是正向的也可能是 反向的，取决于启动子相对于目的基因的方向 araBAD 常规 表达 用 阿拉伯糖代谢操纵 子的启动子 阿拉伯糖诱导 弱，常用与pBAD 载体。适合于快速调控和低的本底表达
真核生物启动子预测相关数据库资源概述 刘玉瑛1,张江丽2(1.首都师范大学生命科学学院,北京100037;2.廊坊师范学院生命科学学院,河北廊坊065000) 摘要启动子是基因表达调控的重要元件,深入研究启动子的结构和功能,是理解基因转录调控机制和表达模式的关键。随着生物技术和计算机技术的高速发展,应用生物信息学技术对启动子进行预测和分析的方法得到了很大发展。对目前常用的真核生物启动子预测相关数据库和软件资源作了简单介绍。 关键词真核生物;启动子;数据库;预测 中图分类号Q24文献标识码A文章编号0517-6611(2007)24-07418-02 The Databases o f Eukaryo tic Promoters and Related So ftw are Resources LIU Yu2ying et al(Co lleg e of Life Science,Capital N ormal U niv ersity,B eijin g100037) Abstract Eu kary o tic pro mo ters are i mp ortan t elemen ts in reg ulatio n o f the e xpres si on.T o stud y the structu re and functio n o f a p ro m oter deeply,i t is the key to kno w ho w the gene reg ulates its transcri pti on an d starts its exp ression.With the fast d evelo pmen t o f bio log ical and co m puter techno lo gy,sig nifican t ac hiev ements h av e been made in co mp utatio nal predictio n o n Eu kary o tic pro mo ters.In thi s paper mai nly in tro duces the pro g ress made in the datab ases o f predictin g E ukaryo tic p ro mo ters as w ell as the related so ftw are reso urces w as in tro duced. Key w ords Wikipedia;Pro m oter;D atab ase;Predicti on 作为基因表达所必需的重要序列信号和基因转录水平上一种重要的调控元件,真核生物的启动子一直是现代分子生物学的研究热点。用实验的方法分析和鉴定启动子是多年以来进行启动子研究的主要途径。近年来,随着人类基因组测序的完成和根据实验获得的对启动子的序列特征与结构功能的认识,利用生物信息学的方法,通过计算机模拟和计算来预测基因启动子的相关信息获得越来越多的应用。笔者对目前常用的几个启动子预测数据库和相关软件资源作一简单介绍。 1真核生物启动子的基本结构 真核生物的启动子有3种类型,分别由R NA聚合酶?、ò和ó进行转录。典型的真核生物启动子由核心启动子、上游元件和应答元件构成。 核心启动子包括起始子和基本启动子。其中起始子是DN A解链并起始转录的位点。基本启动子序列为中心在-25~-30的7bp保守区,其碱基频率为:T85A97T93A85A2 63A83A50,通常被称为T A T A框或Goldberg2Ho gne ss框,具有选择正确的起始位点,保证精确起始的功能。同时,T A T A框还能影响转录速率。如兔的珠蛋白基因中T A T A框的保守序列A T AAA A人工突变为A TG T AA时,转录效率会下降80%。 上游元件主要包括C AA T框和GC框两种,均具有增强转录活性的功能。其中,C AA T框的保守序列是GGC T2 C A A TC T,一般位于上游-75紧靠-80,与其相互作用的因子有C TF家族的成员C P1、C P2和核因子NF21等;GC框的保守序列是G TGGGC G GG GC AA T,常以多拷贝形式存在-90处,识别该序列的转录激活因子为Sp1。两种上游元件同时存在或者只存在其中之一,但并非所有真核基因的启动子都存在上游启动子元件,有些植物细胞中几乎不存在C AA T框。 应答元件通常位于基因上游,能被转录因子识别和结合,从而调控基因的专一性表达。如热激应答元件、激素应答元件、c A M P应答元件、金属应答元件、糖皮质激素应答元 作者简介刘玉瑛(1982-),女,北京人,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学。 收稿日期2007204223件和血清应答元件等。应答元件含有短重复序列,不同基因中应答元件的拷贝数相近。 2真核生物启动子预测相关数据库资源 2.1EPD(Eukaryotic promote r database)[1]EP D数据库(http://w w w.e pd.isb2sib.ch/或者f tp://f tp.e pd.isb2sib.c h/ pub/da taba se s/epd)是一个针对真核R NA聚合酶II型启动子的非冗余数据库。现有启动子序列数据1500多个,按层次组织。关于启动子的描述信息直接摘自科学文献。该数据库中所有的启动子均经过一系列实验证实,如:是否为真核R NA聚合酶ò型启动子、是否在高等真核生物中有生物学活性、是否与数据库中的其他启动子有同源性等。同时,EPD 与其他的相关数据库如EM B L、S WI S S2P RO T、TRA NS FAC等,实现了数据的交叉链接。在其最新版本(第76版)中,EPD 将收集的启动子分为6大类:植物启动子、线虫启动子、拟南芥启动子、软体动物启动子、棘皮类动物启动子和脊椎动物启动子,共2997个条目,其中人类启动子有1871个,约占总数的62%。EPD数据库是目前唯一一个源自实验数据的真核生物启动子数据库,是常用的预测软件测评的手段之一。 2.2PLAC E(Plant cis2ac ting regulatory DNA elements)[2] P LAC E数据库(http://w ww.dna.af frc.go.jp/htdoc s/PL AC E/, F TP服务器为ftp://ftp.dna.a ff rc.go.jp/)是从已发表文献中搜集植物顺式作用元件资料而建立的模体数据库(mo tif data base),始于1991年。目前服务器位于日本农林渔业部。P LAC E数据库中只囊括维管植物的信息,其他与植物顺式作用元件同源的非植物模体也同时被收录。并且所收录信息根据实验最新进展随时得到更新。同时,PL AC E数据库中还包括了对每个模体的描述和在PubM ed中的相关文献编号,以及在DDB J/E MB L/GenB ank的核酸序列数据库的登录号,点击后可阅读相关文献摘要等信息。登陆PL AC E数据库界面,用户可通过关键词、S RS关键词或者同源序列查询顺式作用元件的信息。关键词可以是模体名称、涉及的诱导子或者植物激素、胁迫类型、该基因表达的组织或者器官、原始文献的作者、模体序列、植物种属等。查询结果显示位点(模体)名称、位置、序列和PL ACE登录号,同时,也可以用F AS T A 格式批量上传序列信息。 安徽农业科学,J ou rnal o f Anh ui Ag ri.Sci.2007,35(24):7418-7419责任编辑孙红忠责任校对李洪
“螺旋讲堂”2008 年第十一课----“基因启动子分析基本流程”
“螺旋讲堂”2008年第十一课----“基因启动子分析基本流程”
螺旋 亲爱的螺友们，大家好！欢迎光临螺旋讲堂，很高兴有机会和大家相聚螺旋网，让 我们一同在讨论中学习，在交流中成长！ 分子生物学发展迅猛，新方法新技术新发现层出不穷，但是我想,我们的基础研究从 某种意义上来说，可以简单的分为两大部分，一个是基因的表达，另一个是基因的功能。当 然，这个基因的概念现在已经不仅仅是指编码蛋白的 DNA 序列了。 我们这期主要探讨基因的表达。而转录调控在基因表达中占有很重要的地位。基因 的转录调控机制非常复杂，这些理论有机会我们再详细探讨，这里就不多介绍了，我们主要 谈一下对于一个新的基因，如何开始他的转录调控研究，第一步到底该怎么做呢？ 这里提供一些简单的入门级别的方法，希望对大家有用。相信还有更多更好更实用 的方法，也希望螺友们能够拿出来和大家分享，共同进步！ 本次讲座共分为五个部分主要是讲第一部分,因为这个一般的文献和书籍都很少有 详细说明.
一：克隆目的基因基本启动子序列 我们都知道， 基因的基本启动子一般是在基因转录起始位点上游， 当一个基因在没有 确定其转录起始位点的时候，我们假定 NCBI 上提交的序列就是他的完整转录本，那么他的 第一个碱基就是他的转录起始位点。而基因的基本启动子一般就是在转录起始位点的上游 2000bp 左右和下游200bp 左右，当然,这个是一般情况,具体问题还要具体分析.尤其现在发 现一般的基因都是有几个转录起始位点的. 我们通过该基因 mRNA 序列和基因组序列 BLAST， 就能够在染色体上找到这段基因 组序列。我这里用 human 的 AGGF1基因做个例子给大家具体演示一下.
https://www.doczj.com/doc/2e18426649.html,
真核生物的特征 原核细胞功能上与线粒体相当的结构是质膜和由质膜内褶形成的结构，但后者既没有自己特有的基因组，也没有自己特有的合成系统。 真核生物的植物含有叶绿体，它们亦为双层膜所包裹，也有自己特有的基因组和合成系统。与光合磷酸化相关的电子传递系统位于由叶绿体的内膜内褶形成的片层上。原核生物中的蓝细菌和光合细菌，虽然也具有进行光合作用的膜结构，称之为类囊体，散布于细胞质中，未被双层膜包裹，不形成叶绿体。 原核生物的特点 ①核质与细胞质之间无核膜因而无成形的细胞核（拟核或类核）； ②遗传物质是一条不与组蛋白结合的环状双螺旋脱氧核糖核酸（DNA）丝，不构成染色体（有的原核生物在其主基因组外还有更小的能进出细胞的质粒DNA）； ③以简单二分裂方式繁殖，无有丝分裂或减数分裂; ④没有性行为，有的种类有时有通过接合、转化或转导，将部分基因组从一个细胞传递到另一个细胞的准性行为（见细菌接合）； ⑤没有由肌球、肌动蛋白构成的微纤维系统，故细胞质不能流动，也没有形成伪足、吞噬作用等现象； ⑥鞭毛并非由微管构成，更无“9+2”的结构，仅由几条螺旋或平行的蛋白质丝构成； ⑦细胞质内仅有核糖体而没有线粒体、高尔基器、内质网、溶酶体、液泡和质体（植物）、中心粒(低等植物和动物)等细胞器； ⑧细胞内的单位膜系统除蓝细菌另有类囊体外一般都由细胞膜内褶而成，其中有氧化磷酸化的电子传递链（蓝细菌在类囊体内进行光合作用，其他光合细菌在细胞膜内褶的膜系统上进行光合作用；化能营养细菌则在细胞膜系统上进行能量代谢）； ⑨在蛋白质合成过程中起重要作用的核糖体散在于细胞质内，核糖体的沉降系数为70S;
⑩大部分原核生物有成分和结构独特的细胞壁等等。总之原核生物的细胞结构要比真核生物的细胞结构简单得多。 真核细胞与原核细胞的区别 真核细胞与原核细胞的主要区别是： ①真核细胞具有由染色体、核仁、核液、双层核膜等构成的细胞核；原核细胞无核膜、核仁，故无真正的细胞核，仅有由核酸集中组成的拟核。 ②真核细胞的转录在细胞核中进行，蛋白质的合成在细胞质中进行，而原核细胞的转录与蛋白质的合成交联在一起进行。 ③真核细胞有内质网、高尔基体、溶酶体、液泡等细胞器，原核细胞没有。 ④真核生物中除某些低等类群（如甲藻等）的细胞以外，染色体上都有5种或4种组蛋白与DNA 结合，形成核小体；而在原核生物则无。 ⑤真核细胞在细胞周期中有专门的DNA复制期（S期）；原核细胞则没有，其DNA复制常是连续进行的。 ⑥真核细胞的有丝分裂是原核细胞所没有的。 ⑦真核细胞有发达的微管系统，其鞭毛（纤毛）、中心粒、纺锤体等都与微管有关，原核生物则否。 ⑧真核细胞有由肌动、肌球蛋白等构成的微纤维系统，后者与胞质环流、吞噬作用等密切相关；而原核生物却没有这种系统，因而也没有胞质环流和吞噬作用。 ⑨真核细胞的核糖体为80S型，原核生物的为70S型，两者在化学组成和形态结构上都有明显的区别。 ⑩真核细胞含有的线粒体，为双层被膜所包裹，有自己特有的基因组、核酸合成系统与蛋白质合成系统，其内膜上有与氧化磷酸化相关的电子传递链。 11真核生物细胞较大，一般10~100纳米，原核生物细胞较小，大约1~10纳米。
原核生物和真核生物的主要区别 人教版高一必修一生物 一、协作学习任务设计 1、展示原核生物和真核生物的图片或者视频 生物体可以分为非细胞结构和细胞结构。科学家又根据细胞内有无以核膜为界限的细胞核，将细胞分为两类，原核细胞和真核细胞。 提出问题：原核生物和真核生物的主要区别在哪？ 二、教师进行指导，并提供资源 （一）回顾并总结原核生物、真核生物在细胞结构上的特点以及主要类群 （二）原核细胞和真核细胞的结构特点进行比较 （三）在认识和比较的基础上，探讨原核细胞和真核细胞之间的相关性及其发展史。 学习资源 1、教材 2、生物进化史课本 三、开展协作学习 学生之间进行分组，组内进行收集资料，讨论、总结。 四、开展学习活动 五、小组内部进行分工，可以按照老师的指导进行收集资料、进行总结。 原核生物的结构特点： 1、细胞大小：支原体是原核生物中最小的生物体。 2、细胞壁：肽聚糖（糖类与蛋白质结合而成的化合物），不含纤维素。 3、细胞膜：与真核细胞的相似。 4、细胞质：只有核糖体，无其他复杂的细胞器。 5、拟核：有丝状DNA分子，分布于细胞质的一定区域，没有核膜。 原核生物的主要类群： 蓝藻，含有（藻蓝素）和（叶绿素），可进行光合作用。 细菌，（球菌、杆菌、螺旋菌、和乳酸菌） 放线菌，（链霉菌） 支原体，衣原体，立克次氏体 真核生物的结构特点： 1.生物膜结构：以生物膜为基础而形成的膜性结构和细胞器 2.细胞骨架结构：包括细胞质骨架和核骨架 3.细胞质溶胶：为均质半透明液体，是代谢反应进行的场所 4：细胞核:遗传信息储存、表达的部位 真核生物的主要类群： 动物 植物 真菌（青霉菌，酵母菌，蘑菇）
感受态BL21、BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS BL21没有T7 RNA聚合酶基因, 因此不能表达T7启动子控制的目的基因, 但是可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。 BL21(DE3)是λDE3溶原菌，带有T7 RNA聚合酶，可用于表达T7启动子控制的目的基因，也可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。 BL21（DE3）pLysS含有pLysS质粒，一种与pET共存的表达T7裂解酶的质粒，可以减少目的基因的本底表达，提供更严紧的控制。 真核原核启动子 原核： 几个常用的启动子和诱导调控表达系统 1.最早应用于的表达系统的是Lac乳糖操纵子，由启动子lacP + 操纵基因lacO + 结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。 https://www.doczj.com/doc/2e18426649.html,cUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI 的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO 上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。 3.tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。 4.trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。 5.在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。 6.IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI 的温度敏感突变体，30℃下抑制转录，42℃开始发挥作用。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物的稳定。 7.以λ噬菌体转录启动子PL、PR 构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30℃下阻遏启动子转录，42℃下解除抑制开始转录。同样的，PL、PR表达载体需要以cI857(ts)作为表达菌株，现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR 启动子的转录。比如Invitrogen的PL表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的cI基因
从DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译3个方面，叙述真核生物和原核生物的异同。 一、真核生物和原核生物的不同点 A、真核生物和原核生物复制的不同点： 1.真核生物DNA的合成只是在细胞周期的S期进行，而原核生物则在整个细胞生长过程中都可进行DNA合成 2.原核生物DNA的复制是单起点的，而真核生物染色体的复制则为多起点的。真核生物中前导链的合成并不像原核生物那样是连续的，而是以半连续的方式，由一个复制起点控制一个复制子的合成，最后由连接酶将其连接成一条完整的新链。 3.真核生物DNA的合成所需的RNA引物及后随链上合成的冈崎片段的长度比原核生物要短。 4.原核生物中有DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种聚合酶，并有DNA聚合酶Ⅲ同时控制两条链的合成。真核生物中有α、β、γ、ε、δ五种聚合酶。聚合酶α、δ是DNA 合成的主要酶，分别控制不连续的后随链以及前导链的生成。聚合酶β可能与DNA修复有关，聚合酶γ则是线粒体中发现的唯一一种DNA聚合酶. 5.染色体端体的复制不同。原核生物的染色体大多数为环状，而真核生物染色体为线状。末端有特殊DNA序列组成的结构成为端体。 B、真核生物和原核生物转录的不同点： 1.真核生物的转录在细胞核内进行，原核生物则在拟核区进行。 2.真核生物mRNA分子一般只编码一个基因，原核生物的一个mRNA分子通常含多个基因。 3.真核生物有三种不同的RNA聚合酶催化RNA合成，而在原核生物中只有一种RNA聚合酶催化所有RNA 的合成。 4.真核生物的RNA聚合酶不能独立转录RNA，三种聚合酶都必须在蛋白质转录因子的协助下才能进行RNA的转录，其RNA聚合酶对转录启动子的识别也比原核生物要复杂得多。原核生物的RNA聚合酶可以直接起始转录合成RNA。 C、真核生物和原核生物翻译的不同点： 1.氨基酸的活化：原核起始氨基酸是甲酰甲硫氨酸，真核是从生成甲硫氨酰-tRNAi开始的。 2.翻译的起始：原核的起始tRNA是fMet-tRNA(fMet上角标），30s小亚基首先与mRNA
启动子概述 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。启动子是一段位于结构基因5’-端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，并具有转录起始的特异性。基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物。启动子分三类：启动子Ⅰ、启动子Ⅱ、启动子Ⅲ.只有启动子Ⅱ指导mRNA的转录。真核生物启动子Ⅱ由两大部分组成：上游元件(upstream element)和启动子核心(core promoter)。上游元件与转录的效率有关；启动子核心包括3部分：TATA 盒、起始子(initinator)及下游元件(downstream element)。TATA盒为转录调控因子包括各种调节蛋白的结合区，与转录起始位点的精确选择及转录有关，起始子是转录起始所必须，下游元件作用尚不清楚。原核生物启动子区范围较小，包括TATAAT区(Pribnow区)及其上游的TTGACA区。 启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合位点的DNA序列，位于基因上游。启动子具有如下特征： 1序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常含有几个保守的序列框，序列框中碱基的变化会导致转录启动活性的改变。 2方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件，有单向启动子和双向启动子两类。 3位置特性。启动子一般位于所启动转录基因的上游或基因内的前端。处于基因的下4种属特异性。原核生物的不同种、属，真核生物的不同组织都具有不同类型的启动 没有启动子，基因就不能转录。原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。启动子区域：（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游5—10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T， 故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。（2）—35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称—35区，一般由10个碱基组成。 质粒设计时都需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子两大类，后者包括CMV，SV40，T7,pMC1，PGK启动子等。一下介绍几个常见的启动子。 （1）U6启动子 U6是二型启动子，一般发现是启动小片段，不带PolyA尾的序列。由Ⅲ类RNA聚合酶启动子U6启动子转录产生shRNA，经剪切后产生成熟siRNA，产生干扰效果。这一类 启动子在腺病毒和慢病毒干扰载体的构建中应用很多。U6更多的是用在shRNA的启动，来达到敲低一个基因的作用。
真核启动子 EF1a 常规 表达用 mRNA 人延长因子 1α来源的强哺乳动物表达启动子 组成型 表达水平十分稳定，与细胞类型无关 PGK1(人/小鼠) 常规 表达用 mRNA 磷酸甘油酸 酯激酶基因来源的哺乳动物启动子 组成型 广泛表达,但可能因细胞类型而异。由于甲基化或脱乙酰作用，倾向于抵抗启动子下调。
humanbetaactin 常规 表达 用 mRNA β-肌动蛋白 基因来源的 哺乳动物启 动子 组成型 无处不在，鸡的启动子 常用与启动子杂交 TRE 常规 表达 用 mRNA 四环素响应 元件启动子 被四环 素或者 类似物 诱导 通常有本底表达 Ac5 常规 表达 用 mRNA 果蝇Actin5c 基因来源的 强昆虫启动 子 组成型 果蝇表达系统的常用 启动子
CaMKIIa 光遗 传学 基因 表达 mRNA Ca2+/钙调 蛋白依赖的 蛋白激酶II启 动子 特异的 用于中枢神经系统/神 经元表达。受到钙和钙 调蛋白调节。 TEF1 常规 表达 用 mRNA 酵母转录延 伸因子启动 子 组成型 与哺乳动物的EF1a启 动子类似 ADH1 常规mRNA 乙醇脱氢酶I被乙醇全长版本很强，促进高
表达用 的酵母启动子 抑制 表达。截短启动子是组成型的，表达较低。 Ubi 常规 表达用 mRNA 玉米泛素基 因的植物启 动子 组成型 在植物中促进高表达 U6 小 RNA 表达 shRNA 来源于人U6小核启动子 组成型 小鼠U6也使用,但效率略差。 常用的原核表达系统启动子
T7lac 高 水 平 基 因 表 达 T7噬菌体 来源的启动 子加上lac 操纵子 几乎没有本底表 达，需要T7RNA 聚合酶，受到lac 操纵子的控制， 可以被IPTG诱 导。 常用与pET载体，受到lac操纵子的严 格调控
1、UCSC （1）网址：https://www.doczj.com/doc/2e18426649.html,/cgi-bin/hgNear 在Genome里选择物种，比如human，search里输入你的基因名PTEN，点击Go （2）出现新的页面，看到“Known Gene Names”下面的PTEN了吧，点它 （3）又回到了和（1）类似的页面，此时，点击sequence （4）出现一个新的页面，选中promoter，同时可以输入数值修改具体的序列区域，比如Promoter including 2000 bases upstream and 100 downstream，即表示启动子-2000～＋100区域 （5）点击“get sequence”，出现页面中最上面的序列“>uc001kfb.1 (promoter 2000 100) PTEN - phosphatase and tensin homolog”就是你要的人PTEN启动子-2000～＋100区域的序列了 2、Ensembl （1）网址：https://www.doczj.com/doc/2e18426649.html,/index.html 在“Search Ensembl“标题下search后的下拉框中选中物种名homo sapiens（人），for框中输入基因名PTEN，点击Go （2）出现的新页面中比较乱，但不要管它，直接寻找“Ensembl protein coding gene ”字样的，对，也就是第二个，点击它 （3）新出现的页面也很乱，不过依然不用管它，看到左侧有点肉色（实在不知道怎么描述了）的那些选项了吗，对，就是“Your Ensembl”下面那一堆，在里面找“Genomic sequence”，点它 （4）现在的界面就一目了然了，在“5' Flanking sequence”中输入数值确定启动子长度（默认为600），比如1000，点击update； （5）出现的序列中，标为红色的就是基因的外显子，红色之间黑色的序列就是内含子，而第一个红色自然就是第一外显子了，那么从开始的碱基一直到第一个红色的碱基间自然就是启动子-1000~+1的序列啦 这样，你不仅查到了启动子，连它的外显子、内含子序列也全部搞定了
常见真核启动子及原核 启动子特点 集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-
真核 启动子 EF1a 常规 表达用 mRNA 人延长因子 1α来源的强哺乳动物表达启动子 组成型? 表达水平十分稳定， 与细胞类型无关 PGK1(人/小鼠) 常规 表达用 mRNA 磷酸甘油酸 酯激酶基因 来源的哺乳 动物启动子 组成型? 广泛表达,但可能因 细胞类型而异。由于 甲基化或脱乙酰作 用，倾向于抵抗启动 子下调。 humanbetaactin 常规 表达用 mRNA β-肌动蛋白基因来源的哺乳动物启动子 组成型? 无处不在，鸡的启动 子常用与启动子杂交
TRE 常规 表达 用 mRNA 四环素响应 元件启动子 被四环 素或者 类似物 诱导 通常有本底表达 Ac5常规 表达 用 mRNA 果蝇Actin5c 基因来源的 强昆虫启动 子 组成型? 果蝇表达系统的常用 启动子 CaMKIIa 光遗 传学 基因 表达 mRNA? Ca2+/钙调蛋 白依赖的蛋 白激酶II启 动子 特异的 用于中枢神经系统/ 神经元表达。受到钙 和钙调蛋白调节。 GAL1,10常规 表达 用 mRNA 酵母双向启 动子 被半乳 糖诱 导，被 葡萄糖 抑制 可以单独使用或一起 使用。受GAL4和 GAL80调节。 TEF1常规 表达 用 mRNA 酵母转录延 伸因子启动 子 组成型? 与哺乳动物的EF1a 启动子类似
ADH1常规 表达 用 mRNA 乙醇脱氢酶I 的酵母启动 子 被乙醇 抑制 全长版本很强，促进 高表达。截短启动子 是组成型的，表达较 低。 Ubi 常规 表达 用 mRNA 玉米泛素基 因的植物启 动子 组成型?在植物中促进高表达 U6小 RNA 表达 shRNA 来源于人U6 小核启动子 组成型? 小鼠U6也使用,但效 率略差。 常用的原核表达系统启动子 T7lac 高水 平基 因表 达 T7噬菌体 来源的启 动子加上 lac操纵 子 几乎没有本底 表达，需要 T7RNA聚合 酶，受到lac 操纵子的控 制，可以被 常用与pET载体，受到lac操纵子 的严格调控
基因是由成千上万个核苷酸对组成。组成基因的核苷酸序列可以分为不同区段。在基因表达的过程中，不同区段所起的作用不同。在遗传学上通常将能编码蛋白质的基因称为结构基因。任何一个基因都包括非编码区和编码区。能够转录为相应信使RNA，进而指导蛋白质合成(也就是能编码蛋白质）的区段叫做编码区。不能转录为信使RNA、不能编码蛋白质的区段叫做非编码区。非编码区位于编码区前后，同属于一个基因，控制基因的表达和强弱。 原核生物的基因 非编码区虽然不能编码蛋白质，但对遗传信息的表达是不可缺少的，因为在它上面由调控遗传信息表达的核苷酸序列，该序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子、终止子属于非编码区。因为回文序列的特殊排列，大多都位于非编码区。 原核基因的编码区全部编码蛋白质，真核生物的结构基因是断裂的基因。一个断裂基因能够含有若干段编码序列，可以编码蛋白质的序列称为外显子。在两个外显子之间被一段不编码的间隔序列隔开，这些间隔序列称为内含子。非编码区在每个断裂基因的第一个和最后一个外显子的外侧，有人称其为侧翼序列。在侧翼序列上有一系列调控序列。 真核细胞的基因中编码区特点:间隔的、不连续的。包括：外显子和内含子（位于编码区中的非编码序列）。
通常把基因转录起点前面即5’端的序列称为上游(upstream)，起点后面即3’端的序列称为下游(downstream)。并把起点的位置记为十1，下游的核苷酸依次记为+2，+3，……，上游方向依次记为-1，-2，-3，……。 非编码区的调控序列主要有以下几种结构： ①在5′端转录起始点上游约20～30个核苷酸的地方，有TATA框(TATA box)。TATA框是一个短的核苷酸序列，其碱基顺序为TATAATAAT。TATA框是启动子（见下）中的一个顺序，它是RNA聚合酶的重要的接触点，能够使酶准确地识别转录的起始点并开始转录。当TATA框中的碱基顺序有所改变时，mRNA 的转录就会从不正常的位置开始。 ②在5′端转录起始点上游约70～80个核苷酸的地方，有CAAT框(CAAT box)。CAAT框是启动子中另一个短的核苷酸序列，其碱基顺序为GGCTCAATCT。CAAT框是RNA聚合酶的另一个结合点，它的作用还不很肯定，但一般认为它控制着转录的起始频率，而不影响转录的起始点。当这段顺序被改变后，mRNA 的形成量会明显减少。 ③在5′端转录起始点上游约100个核苷酸以远的位置，有些顺序可以起到增强转录活性的作用，它能使转录活性增强上百倍，因此被称为增强子。当这些顺序不存在时，可大大降低转录水平。研究表明，增强子通常有组织特异性，这是因为不同细胞核有不同的特异因子与增强子结合，从而对不同组织、器官的基因表达有不同的调控作用。例如，人类胰岛素基因5′末端上游约250个核苷酸处有一组织特异性增强子，在胰岛素β细胞中有一种特异性蛋白因子，可以作用于这个区域以增强胰岛素基因的转录。在其他组织细胞中没有这种蛋白因子，所以也就没有此作用。这就是为什么胰岛素基因只有在胰岛素β细胞中才能很好表达的重要原因。 ④在3′端终止密码的下游有一个核苷酸顺序为AATAAA，这一顺序可能对mRNA的加尾(mRNA尾部添加多聚A)有重要作用。这个顺序的下游是一个反向重复顺序。这个顺序经转录后可形成一个发卡结构。发卡结构阻碍了RNA聚合酶的移动。发卡结构末尾的一串U与转录模板DNA中的一串A之间，因形成的氢键结合力较弱，使mRNA与DNA杂交部分的结合不稳定，mRNA就会从模板上脱落下来，同时，RNA聚合酶也从DNA上解离下来，转录终止。AATAAA顺序和它下游的反向重复顺序合称为终止子（见下），是转录终止的信号。 启动子和终止子： 启动子（promoter）位于编码区上游的非编码区中。真核生物启动子包括下列几种不同顺序，能促进转录过程： （1）帽子位点：转录的起始位点。 （2）TATA框（TATA box）：又称Hogness框，类似于原核生物的Pribnow框，决定了转录起点的选择。 其一致顺序为TATAATAAT。约在基因转录起始点上游约-30-50bp处，基本上由A-T碱基对组成，为RNA 聚合酶的结合处之一，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能开始转录。 （2）CAAT框（CAAT box）：其一致顺序为GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区，位于转录起始点上游约-80-100bp处，可能也是RNA聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。 （3）GC框（GC box）：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由GGCGGG组成，转录因子Sp1能识别GC框并且与之结合，其N端有激活转录的作用。所以，GC框是一个转录调节区，有激活转录的功能。 （4）增强子（enhancer）：又称远上游序列（far upstream sequence）。一般都在-1OO以上。增强子的作用主要是对依赖于TATA框的转录和不依赖TATA框的转录都有增强效应，但对前者增强效应高。增强子是通过启动子来增加转录的。有效的增强子可以位于基因的5’端，也可位于基因的3’端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显，一般能使基因转录频率增加10～200倍，有的甚至可以高达上千倍。