研究真核生物启动子结构与功能的方法
研究启动子结构与功能的方法主要有缺失、点突变和足迹法。在分析得到了启动子的功能序列后，还要弄清与之结合的蛋白质及两者间的相互作用。在研究真核生物启动子的结构与功能时，常采用下列方法。
（1）卵细胞系统（oocyte system）该方法是将DNA直接注射人爪蟾卵细胞的细胞核，分析和观察RNA的转录情况。该方法的局限性在于试验条件受卵细胞内条件的限制。可以用来分析：DNA片段的特性，不能用于分析蛋白质因子与DNA间的结合。
（2）转染系统（transfection system）将外源DNA导人转染的细胞并使之表达。表达可分为瞬时表达（transient expression）和整合表达（integrant expression）。由于转录是在细胞内完成的，可以看成是一种体内试验系统。但外源基因又不是细胞所固有的，和细胞固有基因的表达尚有差别。使用多种宿主细胞，可提高该系统的应用价值。（4）转基因系统（transgenic system）转基因系统将外源基因整合人动物的生殖细胞，使外源基因在部分或全部组织中表达。该系统和转染系统有一些相同的局限性，即外源基因常以多拷贝存在，整合的位置也和内源性基因不同。
（4）体外转录系统（in vitro system）体外转录系统是一种经典的方法。它应用体外转录的方法，结合缺失突变和点突变，来筛选哪些序列是启动子的功能所必需的，哪些序列对启动子的功能有影响，以及
哪些辅助因子对启动子或启动子中的某一片段有何种作用。
启动子研究的第一步是确定启动子的位置及长度。主要方法是用缺失试验来确定启动子的上游边界，即当缺失影响转录始时，说明该处就是启动子的上游边界；用缺失试验结合重组试验来确定下游边界。确定了启动子的位置后，可采用点突变来研究每个碱基在启动子中所起的作用。
研究蛋白质辅助因子与DNA（启动子）的相互作用可采用DNase、足迹法、凝胶阻滞法和硫酸二甲酯方法等。
关于转录调控或基因启动子的研究方法很多,除了较常用的报告基因(Luciferase), CHip, EMSA, pull-down外,还有结合芯片的方法.下面重点介绍五种:
1.Protein Arrays(蛋白芯片)
What they are:固定的转录因子阵列,利用标记的基因序列或蛋白质进行探索.
What to use them for:用于发现和证实转录因子的结合位点或蛋白-蛋白相互作用.
Pros(优点):能提供一种在广泛的因子中检测与特定序列结合的因子.
Cons(缺点):可能会错失一些同源因子和一些转录后的变化.
Things to keep in mind:蛋白分析提供了一种在DNA片段中筛选潜在的结合位点的方法.
但这种方法缺乏柔韧性,因此只局限于广泛的已研究的因子. Available Kits:
panomics: TF protein array I for DNA-protein Interactions
Active Motif: TransArray
2.Microsphere Assays(液相芯片)
What they are:一些微磁珠的集合在一起,每个能与唯一的因子结合位点耦联.
What to use them for:筛选转录因子的表达.
Pros(优点):提供一种广泛相对无偏见的的一次筛选手段,理论上,一次能检测100种不同转录因子.
Cons(缺点):需要特定的硬件设施(如luminex reader),不能完全的解释哪一种蛋白与哪一种蛋白结合.
Things to keep in mind:像RNAse保护试验一样,磁珠系统能定量转录因子保护寡核苷酸不被消化的能力.
来自匹兹堡大学医学中心luminex core facility主任Anna Lokshin就表示:这种微粒方法得到意想不到的
结果,因为它不会受到假说和初步数据的影响","通常你会在自己的知识领域里寻找,但是各自的知识领域
是受到限制的.
Available Kits:
Invitrogen: biosource 3-plex transcription factor assays
Marligen Biosciences: Multiplex transcription factor profiling Kit
3.Chromatin Immunoprecipitation(染色质免疫沉淀分析)
What they are:来自天然染色质的蛋白质-DNA交联复合物的免疫沉淀,通过pcr或微阵列来分析.
What to use them for:证实细胞内蛋白质-DNA天然结合的细节.
Pros(优点):是能体内进行的唯一分析方法,能详细解释蛋白容量的变化.
Cons(缺点):需要一种目的转录因子的抗体.同时ChIP相对EMSA来说,更为复杂和困难.
Things to keep in mind:不能说明白一种特定结合是否是功能性的,因此,我们需要利用转录活性分析
方法.ChIP很有用,但是需要与其他技术合用来解决整个难题. Available Kits:
Active Motif: ChIP-IT
Upstate: EZ ChIP
4.Oligonucleotide Arrays(寡核苷酸芯片)
What they are:固定的寡核苷酸结合位点阵列,一般用于探测核提取物核研发某种蛋白抗体.
What to use them for:筛选转录因子的表达物.
Pros(优点):提供一种相对广泛,无偏见的的一次筛选手段.
Cons(缺点):定性分析,需要进行研究的转录因子对象的抗体.
Things to keep in mind:不同的实验中存在着差异.
Available Kits:
Panomics: protein/DNA Combo Array
ArrayIt Transcription Factor Microarrays
5.Elisa-based assays
What they are:基于酶联免疫反应的转录因子结合分析.
What to use them for:定量转录因子的浓度
Pros(优点):快速,定量和高通量的特点
Cons(缺点):需要目的转录因子的一种抗体才能进行试验
Things to keep in mind:可以比传统的EMSA分析容纳更多的蛋白,并且能将信号放大,具有半定量的特点
Available Kits:
Clontech: TransFactor STAT3 Colorimetric Kit
Panomics: HIF ELISA kit
Active Motif:TransAM CREB Kit
高中生物知识结构网络 第一单元生命的物质基础和结构基础 （细胞中的化合物、细胞的结构和功能、细胞增殖、分化、癌变和衰老、生物膜系统和细胞工程）1.1化学元素与生物体的关系 1.2生物体中化学元素的组成特点 1.3生物界与非生物界的统一性和差异性
1.4细胞中的化合物一览表 1.5蛋白质的相关计算 设 构成蛋白质的氨基酸个数m ， 构成蛋白质的肽链条数为n ， 构成蛋白质的氨基酸的平均相对分子质量为a ， 蛋白质中的肽键个数为x ， 蛋白质的相对分子质量为y ， 控制蛋白质的基因的最少碱基对数为r ， 则 肽键数＝脱去的水分子数，为 n m x -= ……………………………………① 蛋白质的相对分子质量 x ma y 18-= …………………………………………② 或者 x a r y 183 -= …………………………………………③
1.6蛋白质的组成层次 1.7核酸的基本组成单位 1.8生物大分子的组成特点及多样性的原因
1.9生物组织中还原性糖、脂肪、蛋白质和DNA的鉴定 1.10选择透过性膜的特点 1.11细胞膜的物质交换功能 1.12线粒体和叶绿体共同点 1、具有双层膜结构 2、进行能量转换 3、含遗传物质——DNA 4、能独立地控制性状 5、决定细胞质遗传 6、内含核糖体 7、有相对独立的转录翻译系统 8、能自我分裂增殖 水 被选择的离子和小分子 其它离子、小分子和大分子 亲脂小分子 高浓度——→低浓度 不消耗细胞能量（A TP） 离子、不亲脂小分子 低浓度——→高浓度 需载体蛋白运载 消耗细胞能量（ATP）
1.13真核生物细胞器的比较 1.14细胞有丝分裂中核内DNA、染色体和染色单体变化规律 注：设间期染色体数目为2N个，未复制时DNA含量为2a。 1.15理化因素对细胞周期的影响 注：＋表示有影响 1.16细胞分裂异常（或特殊形式分裂）的类型及结果
真核启动子 EF1a 常规表达用 mRNA 人延长因子1α来源 的强哺乳动物表达启动子 组成型 表达水平十分稳定，与细胞类型无关 PGK1 (人/小鼠) 常规表达用 mRNA 磷酸甘油酸酯激酶 基因来源的哺乳动物启动子 组成型 广泛表达,但可能因细胞类型而异。由于甲基化或脱乙酰作用，倾向于抵抗启动子下调。 human beta actin 常规表达用 mRNA β-肌动蛋白基因来 源的哺乳动物启动子 组成型 无处不在，鸡的启动子常用与启动子杂交 TRE 常规表达用 mRNA 四环素响应元件启动子 被四环素或 者类似物诱导 通常有本底表达 Ac5 常规表达用 mRNA 果蝇Actin 5c 基因 来源的强昆虫启动子 组成型 果蝇表达系统的常用启动子
CaMKIIa 光遗传学 基因表达 mRNA Ca2+/钙调蛋白依赖 的蛋白激酶II 启动 子 特异的 用于中枢神经系统/神经元表达。受到 钙和钙调蛋白调节。 TEF1 常规表达 用 mRNA 酵母转录延伸因子 启动子 组成型与哺乳动物的EF1a 启动子类似 ADH1 常规表达 用 mRNA 乙醇脱氢酶I的酵母 启动子 被乙醇抑制 全长版本很强，促进高表达。截短启 动子是组成型的，表达较低。 Ubi 常规表达 用 mRNA 玉米泛素基因的植 物启动子 组成型在植物中促进高表达 U6 小RNA 表达 shRNA 来源于人U6小核启 动子 组成型小鼠U6也使用,但效率略差。 常用的原核表达系统启动子
T7lac 高水 平基 因表 达 T7噬菌体来 源的启动子 加上lac操 纵子 几乎没有本底表 达，需要T7 RNA 聚合酶，受到lac 操纵子的控制， 可以被IPTG诱 导。 常用与pET载体，受到lac操纵子的严格调控 araBAD 常规 表达 用 阿拉伯糖代 谢操纵子的 启动子 阿拉伯糖诱导 弱，常用与pBAD载体。适合于快速调控和低的本底表达 lac 常规 表达 用 Lac操纵子 来源的启动 子 可以被IPTG或 者乳糖诱导 在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细 胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非 诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达， 能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为 Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上 通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的 诱导调控。 pL 高水 平基 因表 达 Lambda噬 菌体来源的 启动子 温度调节通常和温度敏感的cI857 抑制子搭配使用
第2章探索生命 第1节生物学研究的基本方法 一、教材分析 生物学是一门自然科学，研究的是一些科学事实。在各种科学事实间建立合理的联系，寻找事实产生的原因，提出解释事实的各种假说和理论。生物科学的发展就是人类不断研究的过程，研究过程要用到不同的方法，要让学生不断学会研究方法很重要，所以，通过这节课的学习，让学生初步学会简单的生物学研究方法，提高学生的能力，为以后学习生物学打好基础，也为社会进步带来新的希望。 二、教学目标 知识与技能目标：能说出实验法的基本步骤。 过程与方法目标：通过提出假设和设计实验方案，尝试科学探究的一般方法；通过材料获取和处理信息，培养学生收集材料的能力和分析处理信息的能力。 情感态度与价值观目标：在讨论中，体验用实验法进行科学探究的过程，逐渐形成严谨、实事求是的科学态度；在小组活动中，学会交流与表达，学会与他人合作。 三、教学重难点 教学重点:实验法研究的一般步骤 教学难点：在教师的指导下，以小组为单位，学生自己进行分析、处理、归纳信息，设计实验方案。 教法：通过媒体展示，提高课堂容量、拓宽学生知识面，同时采用观察、思考、阅读、探究方法等相结合。 教具：多媒体课件 四、教学过程 内容设计意图 导入教师 活动我们现在学的生物教材是属于生物学，生物学是一门不断研究 的学科，也是一门自然科学，既然是一门自然学科，那么在研 究的过程中就要遵循自然规律，要遵循自然规律进行研究，就 应该首先掌握研究的基本方法，引入课题 激发学生的兴趣引入主题 一、 生物学研究的基本方法教师 活动 提问：同生们平时在生活中遇到问题是怎么解决的， 用到哪些方法？ 联系生活实际激发学生的求知 欲 学生 活动 思考、结合生活实际回答问题培养学生的语言表达能力 教师 活动 多媒体展示：科学家们的研究的基本方法：观察、 调查、分类、实验等，引出实验法最重要 整体感知，培养学生的观察能 力 二、过度 思考 既然实验法是最重要的，那么实验法研究的基本步骤是什么 呢？ 设置悬念引入思考 教师 活动 引出：本节课要以“实验法研究的示例：响尾蛇是如何跟踪它 放走的猎物”为例来了解实验法研究的基本步骤 多媒体展示：不同种响尾蛇的图片和有关响尾蛇的文字介绍 感知认识 学生 活动 认真观察、阅读信息，加强对响尾蛇的了解 感知认识，拓展学生的视野教师 活动 展示图片：播放响尾蛇捕捉老鼠的视频，并对视频内容作解释 直观形象，激发学生兴趣 学生 活动 认真观察、迅速获取信息培养学生的观察能力和获取信 息的能力 教师 活动 提问学生：通过观察录像，叫学生说出自己感兴趣的问题 引导学生发现问题 学生 活动 学生主动起来说出自己感兴趣的问题落实学生自主学习，培养学生 的创新能力 教师对学生提出的问题作出客观评价，指出在众多问题中，本节课统一学生的思想，引导学生共 - 1 -
Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信
真核启动子 EF1a 常规表 达用 mRNA 人延长因子1α来 源的强哺乳动物表达启动子 组成型 表达水平十分稳定，与细胞类型无关 PGK1 (人/小鼠) 常规表 达用 mRNA 磷酸甘油酸酯激酶 基因来源的哺乳动物启动子 组成型 广泛表达,但可能因细胞类型而异。由于甲基化或脱乙酰作用，倾向于抵抗启动子下调。 human beta actin 常规表 达用 mRNA β-肌动蛋白基因来 源的哺乳动物启动子 组成型 无处不在，鸡的启动子常用与启动子 杂交 TRE 常规表 达用 mRNA 四环素响应元件启 动子 被四环素或 者类似物诱导 通常有本底表达
Ac5 常规表 达用mRNA 果蝇Actin 5c 基因 来源的强昆虫启动 子 组成型果蝇表达系统的常用启动子 CaMKIIa 光遗传 学基因 表达 mRNA Ca2+/钙调蛋白依赖 的蛋白激酶 II 启 动子 特异的 用于中枢神经系统/神经元表达。受 到钙和钙调蛋白调节。 TEF1 常规表 达用mRNA 酵母转录延伸因子 启动子 组成型与哺乳动物的EF1a 启动子类似 ADH1 常规表 达用mRNA 乙醇脱氢酶I的酵 母启动子 被乙醇抑制 全长版本很强，促进高表达。截短启 动子是组成型的，表达较低。 Ubi 常规表 达用mRNA 玉米泛素基因的植 物启动子 组成型在植物中促进高表达
U6 小RNA 表达 shRNA 来源于人U6小核启 动子 组成型 小鼠U6也使用,但效率略差。 常用的原核表达系统启动子 T7lac 高水平基因表达 T7噬菌体来源的启动子加上lac 操纵子 几乎没有本底 表达，需要T7 RNA 聚合酶，受 到lac 操纵子的控制，可以被 IPTG 诱导。 常用与pET 载体，受到lac 操纵子的严格调控 Sp6 体外 转录/ 常规 表达 Sp6噬菌体来源的启动子 组成型, 需要SP6 RNA 聚合 酶 当用于体外转录的时候，专路方向有可能是正向的也可能是 反向的，取决于启动子相对于目的基因的方向 araBAD 常规 表达 用 阿拉伯糖代谢操纵 子的启动子 阿拉伯糖诱导 弱，常用与pBAD 载体。适合于快速调控和低的本底表达
高中生物知识结构网络图 第一单元 生命的物质基础和结构基础 （细胞中的化合物、细胞的结构和功能、细胞增殖、分化、癌变和衰老、生物膜系统和细胞工程） 1.1化学元素与生物体的关系 1.2生物体中化学元素的组成特点 1.3生物界与非生物界的统一性和差异性 1.4细胞中的化合物一览表
1.5蛋白质的相关计算 设 构成蛋白质的氨基酸个数m ， 构成蛋白质的肽链条数为n ， 构成蛋白质的氨基酸的平均相对分子质量为a ， 蛋白质中的肽键个数为x ， 蛋白质的相对分子质量为y ， 控制蛋白质的基因的最少碱基对数为r ， 则 肽键数＝脱去的水分子数，为 n m x -= …………………………………① 蛋白质的相对分子质量 x ma y 18-= ………………………………………②
或者x a r y18 3 - =………………………………………③1.6蛋白质的组成层次 1.7核酸的基本组成单位 1.8生物大分子的组成特点及多样性的原因
1.9生物组织中还原性糖、脂肪、蛋白质和DNA的鉴定 1.10选择透过性膜的特点 1.11 水 被选择的离子和小分子 其它离子、小分子和大分子 亲脂小分子 高浓度——→低浓度 不消耗细胞能量（ATP） 离子、不亲脂小分子 低浓度——→高浓度 需载体蛋白运载 消耗细胞能量（ATP）
1.12线粒体和叶绿体共同点 1、具有双层膜结构 2、进行能量转换 3、含遗传物质——DNA 4、能独立地控制性状 5、内含核糖体 6、有相对独立的转录翻译系统 7、能自我分裂增殖 1.13真核生物细胞器的比较 1.14细胞有丝分裂中核内DNA、染色体和染色单体变化规律
真核生物启动子预测相关数据库资源概述 刘玉瑛1,张江丽2(1.首都师范大学生命科学学院,北京100037;2.廊坊师范学院生命科学学院,河北廊坊065000) 摘要启动子是基因表达调控的重要元件,深入研究启动子的结构和功能,是理解基因转录调控机制和表达模式的关键。随着生物技术和计算机技术的高速发展,应用生物信息学技术对启动子进行预测和分析的方法得到了很大发展。对目前常用的真核生物启动子预测相关数据库和软件资源作了简单介绍。 关键词真核生物;启动子;数据库;预测 中图分类号Q24文献标识码A文章编号0517-6611(2007)24-07418-02 The Databases o f Eukaryo tic Promoters and Related So ftw are Resources LIU Yu2ying et al(Co lleg e of Life Science,Capital N ormal U niv ersity,B eijin g100037) Abstract Eu kary o tic pro mo ters are i mp ortan t elemen ts in reg ulatio n o f the e xpres si on.T o stud y the structu re and functio n o f a p ro m oter deeply,i t is the key to kno w ho w the gene reg ulates its transcri pti on an d starts its exp ression.With the fast d evelo pmen t o f bio log ical and co m puter techno lo gy,sig nifican t ac hiev ements h av e been made in co mp utatio nal predictio n o n Eu kary o tic pro mo ters.In thi s paper mai nly in tro duces the pro g ress made in the datab ases o f predictin g E ukaryo tic p ro mo ters as w ell as the related so ftw are reso urces w as in tro duced. Key w ords Wikipedia;Pro m oter;D atab ase;Predicti on 作为基因表达所必需的重要序列信号和基因转录水平上一种重要的调控元件,真核生物的启动子一直是现代分子生物学的研究热点。用实验的方法分析和鉴定启动子是多年以来进行启动子研究的主要途径。近年来,随着人类基因组测序的完成和根据实验获得的对启动子的序列特征与结构功能的认识,利用生物信息学的方法,通过计算机模拟和计算来预测基因启动子的相关信息获得越来越多的应用。笔者对目前常用的几个启动子预测数据库和相关软件资源作一简单介绍。 1真核生物启动子的基本结构 真核生物的启动子有3种类型,分别由R NA聚合酶?、ò和ó进行转录。典型的真核生物启动子由核心启动子、上游元件和应答元件构成。 核心启动子包括起始子和基本启动子。其中起始子是DN A解链并起始转录的位点。基本启动子序列为中心在-25~-30的7bp保守区,其碱基频率为:T85A97T93A85A2 63A83A50,通常被称为T A T A框或Goldberg2Ho gne ss框,具有选择正确的起始位点,保证精确起始的功能。同时,T A T A框还能影响转录速率。如兔的珠蛋白基因中T A T A框的保守序列A T AAA A人工突变为A TG T AA时,转录效率会下降80%。 上游元件主要包括C AA T框和GC框两种,均具有增强转录活性的功能。其中,C AA T框的保守序列是GGC T2 C A A TC T,一般位于上游-75紧靠-80,与其相互作用的因子有C TF家族的成员C P1、C P2和核因子NF21等;GC框的保守序列是G TGGGC G GG GC AA T,常以多拷贝形式存在-90处,识别该序列的转录激活因子为Sp1。两种上游元件同时存在或者只存在其中之一,但并非所有真核基因的启动子都存在上游启动子元件,有些植物细胞中几乎不存在C AA T框。 应答元件通常位于基因上游,能被转录因子识别和结合,从而调控基因的专一性表达。如热激应答元件、激素应答元件、c A M P应答元件、金属应答元件、糖皮质激素应答元 作者简介刘玉瑛(1982-),女,北京人,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学。 收稿日期2007204223件和血清应答元件等。应答元件含有短重复序列,不同基因中应答元件的拷贝数相近。 2真核生物启动子预测相关数据库资源 2.1EPD(Eukaryotic promote r database)[1]EP D数据库(http://w w w.e pd.isb2sib.ch/或者f tp://f tp.e pd.isb2sib.c h/ pub/da taba se s/epd)是一个针对真核R NA聚合酶II型启动子的非冗余数据库。现有启动子序列数据1500多个,按层次组织。关于启动子的描述信息直接摘自科学文献。该数据库中所有的启动子均经过一系列实验证实,如:是否为真核R NA聚合酶ò型启动子、是否在高等真核生物中有生物学活性、是否与数据库中的其他启动子有同源性等。同时,EPD 与其他的相关数据库如EM B L、S WI S S2P RO T、TRA NS FAC等,实现了数据的交叉链接。在其最新版本(第76版)中,EPD 将收集的启动子分为6大类:植物启动子、线虫启动子、拟南芥启动子、软体动物启动子、棘皮类动物启动子和脊椎动物启动子,共2997个条目,其中人类启动子有1871个,约占总数的62%。EPD数据库是目前唯一一个源自实验数据的真核生物启动子数据库,是常用的预测软件测评的手段之一。 2.2PLAC E(Plant cis2ac ting regulatory DNA elements)[2] P LAC E数据库(http://w ww.dna.af frc.go.jp/htdoc s/PL AC E/, F TP服务器为ftp://ftp.dna.a ff rc.go.jp/)是从已发表文献中搜集植物顺式作用元件资料而建立的模体数据库(mo tif data base),始于1991年。目前服务器位于日本农林渔业部。P LAC E数据库中只囊括维管植物的信息,其他与植物顺式作用元件同源的非植物模体也同时被收录。并且所收录信息根据实验最新进展随时得到更新。同时,PL AC E数据库中还包括了对每个模体的描述和在PubM ed中的相关文献编号,以及在DDB J/E MB L/GenB ank的核酸序列数据库的登录号,点击后可阅读相关文献摘要等信息。登陆PL AC E数据库界面,用户可通过关键词、S RS关键词或者同源序列查询顺式作用元件的信息。关键词可以是模体名称、涉及的诱导子或者植物激素、胁迫类型、该基因表达的组织或者器官、原始文献的作者、模体序列、植物种属等。查询结果显示位点(模体)名称、位置、序列和PL ACE登录号,同时,也可以用F AS T A 格式批量上传序列信息。 安徽农业科学,J ou rnal o f Anh ui Ag ri.Sci.2007,35(24):7418-7419责任编辑孙红忠责任校对李洪
模式生物 生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象。此时，这种被选定的生物物种就是模式生物。比如：孟德尔在揭示生物界遗传规律时选用豌豆作为实验材料，而摩尔根选用果蝇作为实验材料，在他们的研究中，豌豆和果蝇就是研究生物体遗传规律的模式生物。由于进化的原因，许多生命活动的基本方式在地球上的各种生物物种中是保守的，这是模式生物研究策略能够成功的基本基础。选择什么样的生物作为模式生物首先依赖于研究者要解决什么科学问题，然后寻找能最有利于解决这个问题的物种。19世纪末20世纪初，人们就发现，如果把关注的焦点集中在相对简单的生物上则发育现象的难题可以得到部分解答。因为这些生物更容易被观察和实验操作，因此，除了在遗传学研究外，模式生物研究策略在发育生物学中获得了非常广泛的应用，一些物种被大家公认为优良的模式生物，如线虫、果蝇、非洲爪蟾、蝾螈、小鼠等。 随着人类基因组计划的完成和后基因组研究时代的到来，模式生物研究策略得到了更加的重视；基因的结构和功能可以在其它合适的生物中去研究，同样人类的生理和病理过程也可以选择合适的生物来模拟。 目前在人口与健康领域应用最广的模式生物包括，噬菌体、大肠杆菌、酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、海胆、果蝇、斑马鱼、爪蟾和小鼠。在植物学研究中比较常用的有，拟南芥、水稻等。随着生命科学研究的发展，还会有新的物种被人们用来作为模式生物。但它们会有一些基本共同点： 1）有利于回答研究者关注的问题，能够代表生物界的某一大类群； 2）对人体和环境无害，容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖； 3）世代短、子代多、遗传背景清楚； 4）容易进行实验操作，特别是具有遗传操作的手段和表型分析的方法。 背景 早在20世纪最初的20年中，甚至更早到19世纪，人们就发现，如果把关注的焦点集中在相对简单的生物上则发育的现象难题可以得到部分解答。因为这些生物的细胞数量更少，分布相对单一，变化也较好观察。由于进化的原因，细胞生命在发育的基本模式方面具有相当大的同一性，所以利用位于生物复杂性阶梯较低级位置上的物种来研究发育共通规律是可能的。尤其是当在有不同发育特点的生物中发现共同形态形成和变化特征时，发育的普
感受态BL21、BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS BL21没有T7 RNA聚合酶基因, 因此不能表达T7启动子控制的目的基因, 但是可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。 BL21(DE3)是λDE3溶原菌，带有T7 RNA聚合酶，可用于表达T7启动子控制的目的基因，也可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。 BL21（DE3）pLysS含有pLysS质粒，一种与pET共存的表达T7裂解酶的质粒，可以减少目的基因的本底表达，提供更严紧的控制。 真核原核启动子 原核： 几个常用的启动子和诱导调控表达系统 1.最早应用于的表达系统的是Lac乳糖操纵子，由启动子lacP + 操纵基因lacO + 结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。 https://www.doczj.com/doc/896839093.html,cUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI 的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO 上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。 3.tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。 4.trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。 5.在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。 6.IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI 的温度敏感突变体，30℃下抑制转录，42℃开始发挥作用。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物的稳定。 7.以λ噬菌体转录启动子PL、PR 构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30℃下阻遏启动子转录，42℃下解除抑制开始转录。同样的，PL、PR表达载体需要以cI857(ts)作为表达菌株，现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR 启动子的转录。比如Invitrogen的PL表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的cI基因
第三章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术 （light microscopy ） （一）普通复式光学显微镜技术 a ． 光学放大系统：目镜和物镜 光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片 组成 机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sin α/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm ）、染色 （二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1． FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2． 不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光 素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。 （三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰 分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。 通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。 （四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ） 光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。 二、电子显微镜技术（electron microscope ） （一） 电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大 分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等 真空系统：用两级真空泵不断抽气 记录系统：荧光屏或感光胶片成像 （二） 主要电镜制样技术介绍 制样要求：①要求样品很薄（数十纳米） ②要求保持精细结构 1．超薄切片技术 ①固定：保持样品形态结构，甚至超微和分子水平上结构。 固定剂：常用饿酸（OsO 4）和戊二醛等，另外有物理方法如高频微波。
第2章第2节生物学研究的基本方法 教学目的 1、说出实验法研究的一般步骤； 2、尝试设计简单的实验并控制实验条件； 1、根据实验数据建立一个表格并分析数据。 教学重点 实验法研究的的一般步骤 课时安排 2课时。 教学方法 观、思、读、探相结合 板书设计 第2节生物学研究的基本方法 一、生物学研究的基本方法 观察法、调查法、分类法、文献法、实验法 二、实验法的一般步骤 1、实验法示例——响尾蛇是如何追寻它放走的猎物的 2、活动“讨论实验法基本程序” 发现并提出问题——收集与问题相关的信息——作出假设——设计实验方案——实施实验并计录——分析实验现象——得出结论 三、用实验法研究影响生物分布的环境因素——活动“探究影响分布鼠妇的环境因素”教学过程 第一课时以实验法研究的示例“响尾蛇是如何追寻它放走的猎物的”为核心，探究实验法基本程序的。 复习提问：①上节课我们学习哪四位具有代表性的科学家？②他们的研究成果是什么？③他们的研究方法是什么？ (回答：略。)
导入：他们的研究方法有观察法、调查法、分类法、文献法、实验法。这就是生物学研究的基本方法，而其中实验法是现代生物学研究的重要方法。那么实验法包括哪些内容呢？ 阅读书P27——28，看看科学家们对提出的问题是如何分析，进行实验的，在阅读过程中注意思考这么几个问题：①这个实验要解决什么问题？②科学家们做出了什么样的假设？ ③这个假设是根据什么做出的或者说在作假设前科学家都做了哪些工作？④实验中人为控制的条件是什么？⑤为什么要强调多次重复以上的实验？（同学们边回答教师边讲解，加深同学们的认识。） 结合影片，师生共同完成下表； 响尾蛇是如何追寻它放走的猎物的 着事先设 ：将一只没有被响尾蛇袭击过的死老鼠，沿着事先设定的弯曲路径， 进行实验，观察到响尾蛇的头缓慢地左右移动，同时它的舌迅速
专题一科学探究 专题二
结构名称植物动物细菌真菌功能 注意事项： 1.显微镜的目镜长度与放大倍数成，物镜成，放大倍数越大，看到的细胞数目，每个细胞的体积，视野。
2.显微镜下看到的像是；污点可能存在的地方有、、，判断的方法是。 3.低倍镜换高倍镜的正确步骤：移中心—找目标—换物镜—调细准。 4.洋葱鳞片叶表皮细胞装片滴，而口腔上皮细胞装片滴，浓度过大，细胞，原因是。 5.能量转换器有：和，根、洋葱、叶片表皮细胞中能量转换器是。 6.叶绿体：将转化为（光合作用）；线粒体将转化为（呼吸作用）。 7.没有细胞结构的生物：；没有细胞核的生物：；除动物细胞外，其他细胞都含有；液泡中的物质叫。 8.血液属于（结构层次），甲状腺属于，皮肤属于。橘子皮属于，果肉属于，经络属于。 9.细胞分裂时，先分裂，然后是，最后是，植物细胞还会形成新的。细胞分裂前后，的形态和数量保持不变。 10.分裂使细胞的发生变化，分化使细胞的发生变化，生长使细胞的发生变化。 中考训练： 1下列关于草履虫的叙述中，不正确的是（） A 具有细胞膜、细胞质和细胞核 B 能通过生殖器官进行繁殖 C 能够趋利避害，适应环境 D 对污水有一定的净化作用 2.使用显微镜观察植物细胞的临时装片时，若是光线很强的情况下，为了控制进光量，应选用的光圈和反光镜依次是（） A 较大的光圈，平面镜 B 较大的光圈，凹面镜 C 较小的光圈，平面镜 D 较小的光圈，凹面镜 3.下图是植物细胞分裂过程中不同时期的图像，按发生分裂的先后顺序，他们的关系是（） A acdb B cdab C abcd D adbc 4.右图为动、植物细胞结构示意图，请据图回答： （1）表示植物细胞的是图（填“甲”或“乙”） （2）动植物细胞都具有的结构是细胞膜、细胞质、细胞核。图中【D】的结构名称是； 【C】的结构名称是；控制细胞外物质进出，具有保护细胞部结构作用的是【B】。 （3）图甲中，位于细胞的最外面，起保护和支持细胞作用的是【E】，含细胞液的水泡似的结构是【A】。 专题三、生物与环境 1、生物的生存依赖于一定的环境阳光
科学探究专题复习 成都石室蜀都中学刘玮琦 一．教学目标 1.知识目标：掌握科学探究及其基本方法。 2.能力目标：能够提出问题，作出假设，设计实验以及得出结论。 3.情感目标：体会实事求是、严谨求实的科学态度，确立关爱生命、关爱环境的情感意识。 二．教学重难点 1.教学重点：掌握科学探究的基本步骤 2.教学难点：掌握科学探究的基本步骤 三．教学准备 收集相关资料，整理科学探究相关考题。 四．教学过程 (一)复习要点： 1、尝试书面表达问题：尝试根据日常生活、资料信息发现问题、提出问题、表达问题。其中的提出问题要紧扣题目，采用一般疑问句，并应考虑是否可以开展。 2、应用已有的知识，对问题的答案提出可能的设想——即作出假设。作出假设要紧扣问题，可有正面或反面(肯定或否定)两种截然不同的假设。 3、拟定探究计划，列出所需要的材料与用具，选出控制变量，设计对照实验。⑴要使实验结果具有说服力，关键是要设置对照实验。而一组对照实验应包括一个实验组和一个对照组，凡是没有设置对照实验的实验设计都是不合理的。⑵设计对照实验时，实验组与对照组控制的变量(即实验组与对照组不同的条件)只允许一个(即注意控制单一变量)，而控制的变量往往在题干或提出的问题中有体现。如要“探究光对叶绿素形成的影响”，该实验控制的变量就是光(或光照)。在控制变量的过程中，变量要相对立，而且要尖锐(如光照充足与黑暗、适温与低温、有水与无水等)，对照实验中，除变量外，其它因素(条件)要完全相同(即等量原则)。⑶为排除偶然性，减少实验误差，使实验结果更真实，还要考虑设置重复实验。重复实验可进行多次实验过程；也可用多只动物、多粒种子(或多棵生长情况相同的幼苗)等进行一次实验。以上①②③三点是我们改正实验设计的有关不足之处的原理和依据。 4、描述现象，处理数据，得出结论。科学探究中的描述现象与得出结论是不相同的：描述现象是把实验组与对照组产生的现象用文字(或用表格数据统计)形式描述出来。其中的实验结果预测(或预测实验结果)和描述实验现象往往是一样的。而得出结论是必须经过有关数据的处理、有关现象分析讨论后得出的该探究活动最终的实验结论，该结论往往与假设相同或相反。 （二）经典中考题目点拨 《科学探究》专题复习 1.实验“验证绿叶在光下合成淀粉” 知识背景： (1)实验前2一3天，把盆栽的天竺葵放于暗处。（目的：消耗掉叶片中的淀粉） (2)在经过黑暗处理的实验材料上选1-2片生长 健壮的
一．学习目标：（重难点） 1.初步认识生物 2.区别生物和非生物 3.说出生物特征 能力目标：通过积极主动参与讨论培养学生观察、区别能力和发散思维能力。 情感目标：、通过“生物的生命现象”的讨论，培养学生热爱大自然和关爱生物的良好品质。 二．预习导学：（学一学） 阅读课本相关内容，小组合作填空： 1、显微镜的反光镜有平面和凹面，光线强时用 _____ 面镜，光线弱时用 _____ 面镜。 2、遮光器的上面有大小不等的圆孔，叫做，光线弱的时候用。 3、显微镜的物镜分高倍镜和低倍镜，从外观来看，短而粗的是，长而细的是。初中阶段，一般只需要使用。 4、转动时，可以大幅度升降镜筒；转动时，镜筒升降幅度较小，可以使物像更清晰。 5、物象的放大倍数= 乘以。 三．预习收获和障碍： 科学观察可以直接用__________，也可以借助_______、__________等仪器，或利用__________等工具，有时还需要_________________。 四．合作交流议一议： （一）预习交流（处理预习中的问题） 1．写出显微镜的各结构名称（图②）： ①___________ ②___________ ③___________ ④___________ ⑤___________⑥___________ ⑦___________ ⑧___________ ⑨___________ ⑩___________⑾___________ ⑿___________ ⒀___________ 2．写出下列实验器材的名称（图①）： 图①图② （二）课堂研讨（展示才能说一说，先练后展） 仔细观察教师的演示实验，说出下列实验器材的正确用 法： 1、试管夹夹试管时应从试管底部往上套，夹在试管的 _______。 2、酒精灯的灯焰分为外焰、内焰、焰心，___________ 温度最高。灯帽拿下应正放在桌上，熄灭酒精灯时用_______。 3、试管和烧杯，可直接加热的是___________，需垫上 石棉网的是___________。 4、给试管内液体加热时：液体的体积不能超过试管容积 的___________；加热时，试管应倾斜（与桌面成45），加热 过程中应不时___________移动试管，管口不能对着______。 五．反思提升（想一想） 下列关于科学观察的说法，不正确的是（） A．科学观察是科学探究的一种基本方法 B．科学观察必须借助有关用具才能进行 C．观察时要全面、细致和事实就是，并及时记录下来 D．观察时要积极思考，多问几个为什么 六．课堂检测（小试牛刀做一做） 1、显微镜的物镜是40x，要观察放大600倍的物像，应 选用的目镜是（） A．20× B.15× C．10× D.5× 2、用显微镜观察洋葱表皮细胞装片的同一部位，下列哪 种目镜和物镜的组合，在视野中所看到的细胞数目最多（） A．目镜10×；物镜10× B.目镜10×；物镜40× C．目镜15×；物镜10× D.目镜5×；物镜40× 3、在光线条件比较差的实验室内使用显微镜时，应 该（） A. 调大光圈，用平面反光镜 B．调大光圈，用凹面反光镜 C．调小光圈，用平面反光镜 D．调小光圈，用凹面反光镜 4、使用普通光学显微镜时，转动下列哪个结构，能较大 范围地升降镜筒（） A．转换器 B．遮光器 C．粗准焦螺旋 D．细准焦螺旋 5、图②是显微镜结构图，请据图回答： （1）用来调节光线强弱的结构是［］和［］。 （2）转动时，镜筒升降幅度很小的结构是［］。 （3）接近玻片标本的镜头是［］。 （4）光线经过反光镜反射后进入镜筒，我们能通过目镜 观察到物像。光线经过显微镜的［］、［］、 ［］、［］、［］这几个部件。 自我评价：教师评价：日期：陇县城关镇中学“导学案”设计稿 七年级班姓名：科目：生物课题：《生物学研究的基本方法》课型：主备人：雷满仓审核：组名：
1.神经生物学研究的常用方法 神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。总体上，神经生物学的研究 方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子 生物学方法及脑成像技术。 7.1形态学方法 神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其 他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。 7.1.1束路追踪法 追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累。不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。HRP可被神经末梢、胞体和树突吸收，轴突损伤部分也可摄入。在胞体内，HRP的活性可持续4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反应而显现出来。被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。 除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。 7.1.2免疫组织化学 免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。 组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有抗原性。分离纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗原注入另一种动物体内，后者即产生相应的特异性抗体（免疫球蛋白）。从被免疫动物的血清中提取出该抗体，再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体处理组织切片或细胞，标记抗体即与细胞的相应蛋白质（抗原）发生特异性结合。常用的荧光素是异硫氰酸荧光素（FITC）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC），在荧光显微镜下可观察荧光抗体抗原复合物。常用的酶是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP,从辣根菜中提取的），它的底物是3，3'－二氨基、联苯胺（DAB）和H2O2,HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合，也可在光镜和电镜下观察。 标记抗体被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接结合。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体（第一抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简称二抗），再以标记物标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗－标记二抗复合物。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较常用的是一种称之为过氧化物酶－抗过氧化物酶复合物法（peroxidase-antiperoxidase complex