巨噬细胞免疫球蛋白超家族受体的研究进展(一)
作者：孙晨鸣,马海霞,刘光伟,赵勇
【关键词】巨噬细胞;,免疫球蛋白超家族受体;,抑制作用
关键词]巨噬细胞;免疫球蛋白超家族受体;抑制作用
巨噬细胞在免疫系统中的主要作用是摄取、处理并提呈抗原给辅助性T 淋巴细胞/迟发型超敏反应T淋巴细胞（TH/TD）、B细胞,提供活化第1信号;分泌白细胞介素1（IL1）等第2信号分子,导致以TH细胞活化及以抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）的方式使外源性物质破坏。巨噬细胞表面存在多种受体,如免疫球蛋白超家族受体、补体受体（CR）、CC趋化性细胞因子受体（CCR）、A型清道夫受体（SRA）、甾体类激素受体（如17β雌二醇受体ERα）、Toll样受体（TLR）等,其免疫调节功能主要是通过这些受体而实现。其中免疫球蛋白超家族（immunoglobulinsuperfamily,IgSF）受体是巨噬细胞表面的一类重要受体,参与了多种巨噬细胞诱导的免疫性疾病,并在移植排斥反应中发挥重要作用。IgSF受体可传导抑制性或兴奋性信号,使巨噬细胞的功能上调或下调,从而保持免疫系统的内稳态及产生有效的免疫应答。
1IgSF受体的种类、结构及基因表达
IgSF受体主要包括巨噬细胞Fcγ受体（FcγR）、白细胞免疫球蛋白样受体（LILR）、成对免疫球蛋白样受体（PIR）、血小板内皮细胞黏附分子1（PECAM1/CD31）、骨髓分化蛋白（MyD1）、骨髓细胞上表达的触发受体（TREM）1、白细胞分化抗原（CD）200和CD200R。
1.1FcγRFcγR与免疫球蛋白G（IgG）的Fc段有高亲和力。共有3种FcγR,分别是FcγRⅠ、Ⅱ、Ⅲ,三者之间具有高同源性。FcγRⅠ(D64)为Mr70000的糖蛋白,存在于单核细胞和巨噬细胞膜表面。FcγRⅠa1编码的FcγRⅠ胞外区,与IgG具有高亲和力。FcγRⅠ有两个重要的结构特征:即受体的α链胞膜外区有3个免疫球蛋白样结构域,和1个与α链同源的γ链,两者以非共价键结合。FcγRⅠ的α链只有一段很短的胞质区,γ链胞质区有免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）,可传导活化信号。FcγRⅡ（CD32）是40000的糖蛋白,广泛表达于几乎所有骨髓细胞表面。FcγRⅡ不同异型的功能有所不同,FcγRⅡA通过胞内信号传导引起细胞兴奋,而FcγRⅡB则主要传导抑制性信号。FcγRⅢ（CD16）是40~80000的糖蛋白。FcγRⅢA表达于巨噬细胞、肥大细胞及自然杀伤（NK）细胞,而FcγRⅢB则只在中性粒细胞表达。FcγRⅢ胞膜外区含有2个免疫球蛋白结构域,与IgG的结合是低亲和力的。近期研究表明,FcγRⅠ的高亲和力主要是由于含有第3条免疫球蛋白样结构域,可与IgG2a和IgG2b特异性结合,但不与IgG1结合。FcγR的不同结构域与IgG复合物有不同亲和力的原因目前尚不明确,有待进一步研究1]。
1.2LILRLILR可与主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类或相关分子结合,表达于淋巴细胞及骨髓细胞膜表面。LILR有5个抑制性受体（LILRB1~LILRB5）、3个兴奋性受体（LILRA1~LILRA3）,这些受体在胞外有2~4个IgSF结构域,而胞质区含有酪氨酸残基,可磷酸化并发挥生物学作用。其中LILRB2和LILRB4又被称为免疫球蛋白样转录受体4和3（ILT4
和ILT3）,由染色体19q13.4编码2]。
1.3PIRPIR包括PIRA和PIRB,与LILR在结构、表达方式及基因定位上有很多相似之处。PIRA和PIRB超过92%的氨基酸序列是同源的,有6个胞外免疫球蛋白样结构域,1个疏水跨膜区,PIRB胞质内有4条免疫受体酪氨酸抑制性基序（ITIM）,而PIRA的胞质内只有一段短的序列2,3]。1.4PECAM1/CD31PECAM1/CD31的Mr为130000,编码基因位于17q23,由6个胞外免疫球蛋白结构域、1个跨膜区和1个胞质区组成的,胞质区是由12个丝氨酸、5个酪氨酸及5个苏氨酸残基组成,含有ITIM4]。
1.5MyD1MyD1是信号调节蛋白（SIRP）家族结合蛋白,包括3个胞外免疫球蛋白结构域,1个由22个氨基酸组成的单链疏水跨膜区及至少4个酪氨酸磷酸化位点,包括1个以上ITIM5]。
1.6TREM1TREM1是人染色体6p21编码的Mr为30000的IgSF糖蛋白,包括1个胞外免疫球蛋白样可变区、1个富含赖氨酸残基的跨膜区和1个短的胞质区6]。
1.7CD200和CD200RCD200是一种广泛分布于细胞表面的糖蛋白,可与骨髓细胞受体CD200R结合调节巨噬细胞的功能。CD200和CD200R包括2个胞外IgSF结构域,它们通过各自的氨基端相互作用。CD200还有1个疏水跨膜单链和1个短的胞质区,而CD200R的胞质区则含有可被磷酸化的酪氨酸残基7]。通过对几种IgSF受体的研究发现,这一家族受体的普遍特征是在胞外区含有数量不等的免疫球蛋白结构域,可与相应的配体结合,1条疏水跨膜单链,结构不一的胞质区,多数受体的胞质区含
有酪氨酸磷酸化位点──ITIM或ITAM,如:ILT、PIRB、PECAM1、SIRP及CD200R等（图1）。还有一部分受体则只有1个短的胞质区（如TREM1、PIRA及CD200等）。图1巨噬细胞上IgSF受体的结构（略）
2巨噬细胞IgSF受体在免疫调节中的作用
IgSF受体在自身免疫性疾病、感染、肿瘤和移植排斥反应等多种病理过程中发挥着重要作用。
2.1FcγRⅢA的基因型与冠状动脉疾病（CAD）的关系在巨噬细胞形成泡沫细胞引起动脉粥样硬化的过程中,动脉斑块就是由氧化的低密度脂蛋白（OxLDL）混有丰富的免疫球蛋白组成的。Gavasso等8]揭示,FcR的基因多态性可能影响多种感染和自身免疫性疾病的易感性,FcγRⅢA会影响巨噬细胞对IgG抗原抗体复合物的清除,从而引起CAD。试验证明,编码FcγRⅢA的V/V基因型比V/F或F/F能更有效地清除IgG1和IgG3免疫复合物（IC）,从而对CAD患者起到保护作用,这也是第1次将CAD 与FcγRⅢA的基因联系起来。
2.2巨噬细胞上的IgSF受体与自身免疫性疾病在自身免疫性疾病中,FcγR也发挥着重要作用。如在IC引起的关节炎中,FcγRⅢ在调节炎症的发作及程度中发挥着重要作用。在Nabbe等9]的试验中,膝关节局部感染腺病毒导致的干扰素γ（IFNγ）过度表达,会引起IC关节炎的发作及恶化。而在FcγRⅢ（/）的小鼠身上,IFNγ不会引起软骨细胞的死亡,这证实IFNγ引起的关节炎是依赖FcγRⅢ的。巨噬细胞上的其他IgSF受体在免疫调节中也发挥着重要作用,如LILR家族（ILT）。风湿性关节炎
（RA）涉及到滑膜炎症和关节表面的破坏,病理特征为滑液中中性粒细胞和巨噬细胞的增多,巨噬细胞主要分泌炎性因子IL1β和TNFα,而单核细胞ILT11的活化会导致钙离子流失及IL1β和TNFα分泌,提示ILT11的分泌与RA是有联系的。另外,在RA早期阶段还可观察到巨噬细胞表面LILRB2的表达增加,而巨噬细胞表面LILRB2表达的上调与RA的关系还需要进一步的研究。
2.3巨噬细胞上的IgSF受体与肿瘤在肿瘤免疫中,巨噬细胞IgSF受体对肿瘤的发生及抑制具有重要影响,IgSF受体可能会成为未来肿瘤分子治疗的重要手段。在中枢神经系统肿瘤中,星形细胞瘤和胶质母细胞瘤由于广泛侵袭周围脑组织而难于切除,表达于神经系统巨噬细胞（小胶质细胞）表面的SIRPα1则可抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭。Thomas等10]第1次在星形细胞瘤细胞活检中证实了SIRPα的表达。而Kapoor等11]推测,下调表皮生长因子受体（EGFR）的表达可引起SIRPα基因转录水平的上调。试验证实,SIRPα对许多信号传导途径有抑制作用,可以减少肿瘤细胞转移、生存及转化。SIRPα与肿瘤之间的详尽作用机制还有待进一步阐明。
2.4巨噬细胞IgSF受体与移植排斥反应Paulo等12]对移植排斥中各细胞的作用进行了总结,指出CD8+细胞毒性T细胞在排斥过程中起主要作用,CD4+T细胞则主要调节迟发型超敏反应,并可刺激B细胞的成熟与分化,通过FcR激活NK细胞和巨噬细胞引起ADCC。巨噬细胞是通过释放调节因子（如:NO和TNFα等）而发挥作用。其中NO被认为是巨噬细
胞对移植物发生排斥反应的主要因子,如在肾移植试验中,一氧化氮合酶（NOS）的表达与血管内皮的损伤密切相关,当选择性地抑制了NOS 的表达后,便可有效地减少血管内皮的损伤,并延长受者的生存时间13]。因此,近期的研究主要集中于巨噬细胞IgSF受体与NO的关系。如Alblas 等14]研究证明,SIRPα经Janus激酶/信号转导子和转录激动子（JAK/STAT）和磷脂酰肌醇3激酶/Rac1（一种鸟嘌呤核苷三磷酸酶结合蛋白）/还原型辅酶Ⅱ（NAPDH）氧化酶/过氧化氢依赖途径可诱导NO的产生。但巨噬细胞IgSF在移植排斥反应中作用的研究还很有限,且研究多集中于巨噬细胞对移植物的ADCC作用,而巨噬细胞作为抗原呈递细胞对排斥反应的作用的研究尚待深入。随着研究的不断进展,巨噬细胞IgSF受体对肿瘤、自身免疫性疾病及排斥反应的影响及机制会得到不断揭示,其在预防和治疗免疫性疾病、肿瘤的分子治疗及防止移植后排斥反应等方面将会发挥越来越重要的作用。
3IgSF受体的作用机制
IgSF受体胞外区决定了与不同配体的相互结合,而胞质区则通过一系列反应影响细胞的功能。受体FcγR、ILT4、ILT3、PIRA、PIRB及PECAM1等胞质区内都含有酪氨酸磷酸化区,酪氨酸磷酸化在调控巨噬细胞活性过程中发挥着重要作用。其中FcγR最具有代表性,而且也是巨噬细胞氧化反应发生的主要信号传导途径,研究的也最为透彻。配体与FcγR的结合引起信号传导,对细胞产生兴奋性和抑制性作用,这两种相反的作用主要是由于受体胞质区内的ITAM和ITIM两种不同的信号传导途经所
致。其中FcγRⅡB中发现有ITIM区,可传导抑制性信号;而FcγRⅠ和FcγRⅢA则是通过γ链同源二聚体将信号传导入巨噬细胞的细胞核中。每个γ链都有一段ITAM氨基酸序列复制,FcγRⅡA和FcγRⅡC在胞质区的α链中含有ITAM区。ITAM和ITIM的磷酸化会引起下游信号的活化,发生一系列级联反应,从而发挥对巨噬细胞的调节作用。
一、A型选择题 1 早期食管癌是指 A.未转移癌 B.原位癌 C.局限于粘膜浅层癌 D.病变长度小于3cm E.局限于粘膜或粘膜下层，不管有无淋巴结转移。 2 早期胃癌是指 A.未转移癌 B.仅限于粘膜层内癌 C.超过粘膜下层或浅肌层 D.癌细胞异型性小 E.以上都不是 3 慢性活动性肝炎特征性病变是 A.气球样变 B.嗜酸性小体 C.毛玻璃样肝细胞 D.淋巴细胞和浆细胞 E.碎片状坏死 4 B型萎缩性胃炎的特点是 A.胃体弥漫性病变，很少或不累及胃窦 B.胃分泌功能严重损害，维生素B12吸收障碍 C.血清胃壁细胞抗体阳性 D.常伴有恶性贫血 E.病变主要在胃窦部．与幽门螺杆菌感染有关 5 慢性胃溃疡肉眼形态特点是 A.直径2cm以上火山口样或不规则溃疡 B.直径2cm以内圆形溃疡，贲门侧边缘呈阶梯状 C.直径2cm以上圆形溃疡，幽门侧边缘呈阶梯样 D.直径2cm以内圆形溃疡，贲门侧边缘呈潜掘状 E.直径2cm以内圆形溃疡，周围粘膜皱襞排列紊乱 6 大肠癌最多见的部位是 A.直肠 B.乙状结肠 C.盲肠 D.横结肠 E.升结肠 7 关于慢性萎缩性胃炎的镜下改变叙述，下列哪项是错误的 A.病变区腺上皮萎缩，腺体缩小 B.在幽门窦病变区，幽门腺萎缩甚至消失 C.病变区有淋巴细胞浆细胞浸润 D.病变仅限于粘膜浅层 E.在胃底或胃体部病变，壁细胞减少或消失
8 下列哪项与溃疡病的发生无关 A.胃液的消化作用 B.交感神经过度兴奋 C.胆汁反流入胃 D.精神过度紧张 E.遗传因素 9 胃及十二指肠溃疡病的病理改变可分为四层，由浅到深可分为 A.坏死层、渗出层、肉芽组织层、瘢痕组织层 B.渗出层、坏死层、瘢痕组织层、肉芽组织层 C.渗出层、坏死层、肉芽组织层、瘢痕组织层 D.坏死层、肉芽组织层、渗出层、瘢痕组织层 E.以上都不是 10 溃疡病在病理上组织损伤至少要深达哪一层 A.粘膜层 B.粘膜肌层 C.粘膜下层 D.肌层 E.浆膜层 11 下列哪项是肝硬化的典型病理改变 A.纤维组织增生 B.细胞变性坏死 C.不同程度的炎细胞浸润 D.再生结节及假小叶形成 E.呈小胆管样结构的新生肝细胞 12 关于肝硬化腹水的形成因素，下列哪项是错误的 A.门脉压力增高 B.白蛋白降低 C.抗利尿激素减少 D.醛固酮增加 E.肝小叶静脉压增加 13 肝硬化最常见的并发症是 A.上消化道大出血 B.自发性腹膜炎 C.肝性昏迷 D.原发性肝癌 E.功能性肾衰竭 14 我国肝硬化的最常见原因是 A.慢性酒精中毒 B.病毒性肝炎 C.肝寄生虫病 D.营养缺乏 E.化学药品中毒 15 易引起消化性溃疡的最可能的部位是 A.胃小弯近幽门部
组织中巨噬细胞的分离 一取材 （1）无菌采集胃肠组织40g，用4℃生理盐水彻底冲洗组织块的血液，放入适量4 ℃DMEM 培养液中，带至细胞培养实验室。 （2）在超净工作台内，用无菌剪刀剔除可见的血管、结缔组织，将组织块剪成1～3㎜3大小 二组织消化 （1）将剪碎的组织块置于消化瓶中，加入预热至37℃含有0.125%的胰酶、10 U/ ml的DNase I的D-Hanks′液100 ml，置37℃孵箱中，10 min。 （2）消化产物加入50 ml离心管（预先加4.5 ml胎牛血清终止反应）。以800 rmp/min，5 min，离心，将细胞沉淀用3 ml 20%胎牛血清DMEM-H-G液。如果消化后上清液粘稠，可加入DNase I 消化5 min，用5 ml的胎牛血清终止反应，再800 rmp/min，5 min，离心，用20%胎牛血清DMEM-H-G培养液重悬细胞沉淀，暂放入37 ℃孵箱中。 （3）分别用80 ml、70 ml含胰酶对剩余的组织块消化，并重复（2）的步骤。 （4）将3份重悬的细胞悬液混合，取少量悬液镜下观察，呈单个细胞分布。离心（800 rmp/min，5 min）。用3 ml的DMEM-H-G液重悬。 三、细胞纯化 用Percoll等密度梯度沉淀法分离纯化胃肠巨噬细胞 （1）用9份Percoll液与1份10* D-Hanks′液配制90%的Percoll母液，再用Percoll母液与D Hanks′液配制35%和45%的Percoll溶液。 （2）用带14号长针头的玻璃注射器，按密度从大到小依次将45%和35%的Percoll溶液沿10 ml 离心管侧壁缓慢加入，每个梯度加3 ml，操作过程中注意不要有气泡产生。（3）将3 ml的细胞悬液用吸管缓慢沿管壁加入离心管，使其铺于Percoll密度梯度的液体表面，2500 rmp/min，20min，离心。 （4）离心后管内分3部分，底层（主要含红细胞），顶层（含连接组织成分，小血管，结缔组织），中间层（含统一的单个核细胞总体）。用吸管吸出云雾状中间层细胞带，比重在1.048～1.062 g/ml。加入3倍于Percoll液的DMEM-H-G液稀释，离心（800 rmp/min，10 min）。 （5）用少量20%胎牛血清、100 u/L青-链霉素的DMEM-H-G液重悬细胞沉淀。 这样就可以得到你要的巨噬细胞，不过可能会混有别的细胞，但大部分还是你所需要的。
1 原理巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。 2试验材料 昆明种小鼠10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供 公鸡1只 PRMI1640培养基 新生小牛血清 HEPES D-Hanks液 青霉素 链霉素 3试验仪器 无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。 二氧化碳培养箱 生物显微镜 高速冷冻离心机 低温冰箱 4实验步骤 4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法: 将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。 鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4℃冰箱内保存。使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。 培养液的无菌处理： (1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水，与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好，并高压灭菌。 (2)在净化室内，打开己消毒的zeiss抽滤器，将配制好的RPMI1640培养液进行过滤，开将过滤后的RPMI1640培养液分装，置入4℃冰箱中备用。
检验主管理专业考试题及答案-----------------------作者：
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2001年检验主管技师资格考试试题（专业知识） 一、以下每一道考题下面有A、B、C、D、E五个备选答案。请从中选择一个最佳答案，并在答题卡上将相应题号的相应字母所属的方框涂黑。 1.脑组织主要以什么为能源供给 A.葡萄糖 B.脂肪 C.蛋白质 D.氨基酸 E.核酸 答案：A 2.载脂蛋白B族中主要成分是 A.ApoB48 B.ApoB75 C.ApoB100
D.ApoB41 E.ApoB36 答案：C 3.高钾血症是指血清钾高于 A.3.5mmol/L B.4.0 mmol/L C.4.5 mmol/L D.5.0 mmol/L E.5.5 mmol/L 答案：E 4.“胆酶分离”通常是哪种疾病的征兆 A.急性心肌梗死 B.肝癌 C.脂肪肝 D.肝坏死 E.胆石症 答案：D
5.-羟丁酸脱氢酶检测，主要是反应下列乳酸脱氢酶同功酶中哪一种的活性 A.LD1 B.LD2 C.LD3 D.LD4 E.LD5 答案：A 6.关于血肌酐和尿素叙述错误的是 A.尿素的浓度取决于机体氮的分解代谢和肾脏的排泄能力 B.Scr和尿素浓度可反映肾小球滤过功能 C.血尿素测定比血肌酐测定更能准确地反映肾小球滤过功能 D.尿素酶法测定尿素反应专一，特异性强 E.酶偶联法测定肌酐特异性高，但价格昂贵 答案：C 7.对原发性甲状腺功能亢进病人，下列哪项是正确的 A.TT3 TT4下降，TSH升高 B.TT3 TT4下降，TSH下降
2020年护理三基模拟测试题[含参考答案] 一、单选题 1．某重度有机磷农药中毒病人，经抢救病情缓解，3日后突然出现肌无力，呼吸肌麻痹，提示为答案：C A:阿托品化 B:阿托品剂量不足 C:中间综合征先兆 D:解磷定中毒 E:并发急性肺水肿 2．男性，36岁，患肝硬化伴食管静脉曲张破裂出血，入院第3天行三腔双囊管压迫止血，评估中哪项不需要答案：B A:精神状态 B:病人的兴趣 C:静脉输液情况 D:三腔双囊管牵引效果 E:是否继续出血 3．女，18岁，体瘦弱，脊椎后凸畸形，弯腰动作受限，腹股沟区有肿物，行肿物穿刺抽出灰白色脓液，应考虑是答案：D A:股疝 B:腹股沟脓肿 C:骨肿瘤 D:脊椎结核 E:化脓性骨髓炎 4．输液护理中，判断血容量已补足的简便、可靠依据是答案：E A:脉搏在120次/min以下 B:收缩压在12kPa以上 C:中心静脉压在6cmH_TagDownStart_2_TagDownEnd_O以上 D:安静，肢端温暖 E:尿量30ml／h以上 5．须执行接触隔离的疾病是答案：B A:甲型肝炎
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小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。 【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定 0.引言 巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。 1.材料与方法 1.1实验对象 清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。 1.2实验方法 1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养 随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。 1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定 （1）台盼蓝染色计算存活率。 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）；
腹腔巨噬细胞的获取和培养 1.实验目的： 掌握腹腔巨噬细胞的获取方法及其培养技术 2.实验原理： 利用巨噬细胞具有趋化运动，吞噬，分泌和参与免疫调节的功能，向成熟大鼠腹腔内注射煮沸灭菌的4%的硫代乙酸钠，使血液中的单核细胞趋化至腹腔，即巨噬细胞。硫代乙酸钠刺激后4日腹腔内巨噬细胞数量较多且其他细胞成分少（如淋巴细胞）。 3.实验器材及材料： （1）成年大鼠 （2）手术器械：解剖剪，解剖镊和止血钳 （3）其他用品：注射器，培养皿和吸管，酒精及酒精棉球等 （4）清洗液：HBSS和不含Ca和Mg的HBSS。 （5）培养液：DMEM（加10%血清） （6）细胞计数板和计数器 4.实验步骤： （1）取细胞4d前，动物腹膜腔内注射5-10ml 4%硫代乙酸钠。（2）乙醚麻醉后，拉颈处死动物，经颈总动脉放血。将动物仰置，
剪去腹壁皮毛，用70%酒精消毒。 （3）沿正中线剪开腹壁，将5-10mlHBSS注入腹膜腔，用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞。 （4）吸出腹膜腔的细胞悬液，离心（1000r/min,10min）。 （5）用培养液混悬沉淀细胞，将细胞悬液加入培养皿中，培养2h. （6）吸去培养液，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS清洗2次，去除漂浮的细胞，得到附着于培养皿底部的巨噬细胞。 （7）采用刮取法或酶消化法取出贴壁的巨噬细胞，离心（1000r/min,10min）。用培养液混悬细胞，将细胞调整至1-3X106个/ml,继续培养或直接用于实验研究。 5.实验结果分析： （1）除巨噬细胞外，自腹膜腔洗出的细胞还含有淋巴细胞等。由于淋巴细胞不贴壁，培养2h后用HBSS清洗，可除去淋巴细胞和其他悬浮细胞。最终获得95%以上是巨噬细胞。（利用巨噬细胞贴壁能力较其他细胞强）。 （2）巨噬细胞大小约50μm,一般不分裂，在培养条件下可存活1-3周。直接从腹腔取得的巨噬细胞为静止性的，呈圆形，伪足不明显。经硫代乙酸钠刺激可获得大量的炎症性巨噬细胞，培养2h后，细胞多呈梭形并伸出伪足，即“有头有尾”，具有较强的变形运动和吞噬能力。
内科护理学消化系统疾病病人的护理分类模拟题4 A1型题 1. 慢性浅表性胃炎的最主要病因是 A.大肠杆菌感染 B.金黄色葡萄球菌感染 C.幽门螺杆菌感染 D.沙门杆菌感染 E.嗜盐菌感染 答案：C 2. 导致上消化道大量出血最常见的病因是 A.食管癌 B.胃癌 C.急性胃炎 D.消化性溃疡 E.肝硬化 答案：D 3. 肝硬化腹水产生的机制为 A.脾功能亢进 B.血浆清蛋白增多 C.门静脉压力增高 D.醛固酮分泌减少 E.肾小球滤过增加 答案：C
4. 十二指肠溃疡的好发部位是 A.球部 B.降部 C.水平部 D.升部 E.降部和升部 答案：A 5. 下列对慢性胃炎分型无意义的是 A.血清促胃液素测定 B.胃镜及活组织检查 C.上消化道造影 D.血清壁细胞抗体测定 E.胃液分析 答案：C 6. 结核分枝杆菌侵犯肠道主要是 A.血液传播 B.经口感染 C.呼吸道传播 D.生殖道传播 E.体液感染 答案：B 7. 原发性肝癌肝外血行转移最常见的部位是
A.肺 B.肾上腺 C.骨 D.肾 E.脑 答案：A 8. 肝炎患者眼结膜黄染的原因是 A.血中胆固醇太多 B.血中二氧化碳太多 C.血中氧含量太少 D.血中胆红素过多 E.红细胞破坏太多 答案：D 9. 严重呕血患者饮食护理正确的是 A.暂禁食 B.温热的流食 C.温凉的流食 D.软食 E.普食 答案：A 10. 有关呕血与黑便的讨论，不正确的是 A.有黑便不一定有呕血 B.有呕血常伴黑便
C.呕血呈咖啡色是血液在胃内经胃酸作用形成亚铁血红素所致 D.黑便呈柏油样是由于血红蛋白中铁与肠内硫化物作用形成硫化铁所致 E.幽门以上出血表现为呕血，幽门以下出血表现为黑便 答案：E 11. 消化性溃疡患者应避免口服 A.链霉素 B.庆大霉素 C.泼尼松 D.多潘立酮(吗丁啉) E.甲氧氯普胺(胃复安) 答案：C 12. 西咪替丁治疗消化性溃疡的机制是 A.阻断H+-K+-ATP酶 B.拮抗H2受体 C.中和胃酸 D.加速胃排空 E.延缓胃排空 答案：B 13. 上消化道大出血伴休克的首要护理措施是 A.去枕平卧 B.安定情绪 C.迅速配血 D.准备三腔二囊管
小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取 实验动物： 6-8周的SPF级雄性BALB/C小鼠，小鼠取细胞前三天每天腹腔注射0.5-1mL淀粉肉汤，或者取细胞前一小时注射1mL淀粉肉汤。 试剂：75% 乙醇、RPMI 1640 （Gibcol/BRL，美国）、含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)步骤： 1、取6周左右的小鼠，剃去腹部的毛并消毒。 2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入75%酒精中3～5秒。 3、倒立小鼠，置动物于解剖台上，固定四肢，75%酒精擦洗腹膜壁后，用9号针头5ml注射器沿腹中线将预冷的不含小牛血清的PBS5mL注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。轻轻按摩腹部2-3分钟，静置5-7分钟。 4、无菌条件下，剪开腹壁，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。再用75%酒精擦洗腹壁。 5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸入注射器内。小心拔出针头。把液体注入50ml离心管中。再用同样容量的PBS冲洗腹腔2～4次。合并渗出液于50 mL离心管中。直至冲洗液变澄清。 6、4℃ 250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 7、用PBS培养液洗涤细胞3次，每次4℃ 250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 8、用含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)悬浮细胞。将调整细胞浓度调整至 5×106cells/mL 加入培养皿中培养9、将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养3 h，然用37℃预温的RPMI-1640培养液清洗培养皿2-3次，去除未贴壁的细胞，即得到纯化的贴壁巨噬细胞。 种96孔板。2h细胞贴壁。换液。墨汁（时间短，可以不灭菌）染色。观察。
安徽大学 本科毕业论文（设计、创 作） 题目：山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培养技术研 究 学生姓名：孙义学号：D3******* 院（系）：生命科学学院专业：生物工程 入学时间：2012年9月 导师姓名：班谦职称/学位：博士 导师所在单位：安徽大学 完成时间：2016年5月
山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培 养技术研究 摘要 肺泡巨噬细胞是存在于肺泡中的免疫细胞，它是免疫系统的重要组成部分，肺泡巨噬细胞免疫功能非常活跃。它是肺脏抵御外来微生物侵害的第一道防线。本次实验通过研究山羊巨噬细胞的体外分离和体外培养技术，从而建立一套完整可行的巨噬细胞分离培养技术方法。人体吸入空气中的尘粒、细菌等异物进入肺泡和肺间质，多被巨噬细胞吞噬清除，在今天空气污染日趋严重的情况下，研究肺泡巨噬细胞对于免疫学和人类健康有重要的意义。而研究巨噬细胞分离培养技术将为肺泡巨噬细胞的免疫学研究奠定坚实的基础。本实验从健康无病变的羔羊肺脏灌洗液中分离肺泡巨噬细胞，加入脂多糖进行诱导刺激。实验表明，通过此次实验的方法，获得了高纯度的山羊肺泡巨噬细胞，在CO2培养箱中连续培养30天左右未发现细胞大规模死亡，LPS刺激下发现其仍具有免疫活性。为进一步通过山羊肺泡巨噬细胞进行各种致病菌导致的疾病的治疗和肺泡巨噬细胞的免疫学功能研究奠定实验基础。 关键词：肺泡巨噬细胞；分离培养；LPS；山羊。 Isolation and primary culture of goat alveolar macrophages in vitro Abstract Alveolar macrophages are present in alveolar in immune cells, it is an important part of the immune system, immune function of alveolar macrophages is very active. It is the first line of defense against microbial invasion of the lung. This experiment through study on goat macrophages in vitro isolation and in vitro culture techniques, so as to establish a complete set of feasible macrophage separation cultivation techniques. Inhaled dust particles in the air, bacteria and other foreign matter into the alveolar and interstitial lung, is phagocytosis of macrophages, in today's air pollution increasingly serious situation, study of alveolar macrophages is important for immunology and human health. And the study of macrophage isolation technology will lay a solid foundation for Immunology Study on alveolar macrophages. The separation of alveolar macrophages from healthy lamb lung lavage fluid of lesions in this experiment, With lipopolysaccharide induced stimulation. The experimental results show that through the experimental method, goat alveolar macrophages in high purity and in CO2 culture box in continuous culture about 30 days found no large-scale cell death, under the stimulation of LPS found it still has the immune activity. Study on the immunological function of further by goat alveolar macrophages were all pathogenic bacteria caused the disease treatment and alveolar macrophages lay the experimental foundation.
免疫学复习题 一、简答题 1、试述IgG、IgM、IgA的结构特点和生物学特性 2、机体内的抗毒素可通过哪些途径获得使用抗毒素应注意什么问题 3、某人服用磺胺后，出现溶血性贫血的症状，试用免疫学知识解释其发生机制。 4、HIV 感染后是如何损伤免疫系统的 5、肿瘤是怎样逃逸机体免疫系统的杀伤作用的 二、单选题 1、免疫对机体是： E A．有害的 B．有利的 C．有利也有害 D．有利无害 E．正常条件下有利，异常条件下有害 2、免疫细胞产生、发育、分化成熟的场所是： B A．淋巴结和脾脏 B．胸腺和骨髓 C．淋巴结和胸腺 D．骨髓和粘膜相关淋巴组织 E．淋巴结和骨髓 3、决定抗原特异性的分子基础是 A A.抗原表位 B.抗原的大小 C.抗原的电荷性质 D.载体的性质 E.抗原的物理性状 4、 TD-Ag是指 E A 是指在胸腺中加工处理的抗原 B 可直接激活B细胞产生抗体 C不能诱导产生免疫记忆 D只能诱导产生IgM类抗体 E 既能引起细胞免疫应答，又能引起体液免疫应答 5、与蛋白质载体结合后才具有免疫原性的物质是 D
A.完全抗原抗原抗原 D.半抗原 E.超抗原 6、接种牛痘疫苗后机体产生了对天花病毒的免疫力,反映了这二种抗原分子的 B A. 特异性 B. 交叉反应性 C. 分子大 D. 异种性 E. 化学结构复杂 7、超抗原A A.可以多克隆激活某些T细胞或B细胞 B.需经抗原提呈细胞加工处理 C.与自身免疫病无关 D.有严格的MHC限制性 E.只能 活化一个相应的T细胞克隆 8、特异性与抗原表位结合的抗体的部位是C A VL B VH C HVR D CH E CL 9、在脐带血可测到的抗体是A A IgG、IgM B IgM、IgA C IgA、IgG D IgD、IgM E IgE、IgM 10、3—6个月婴儿易患呼吸道感染是因为粘膜表面哪一类Ig不足A B. IgM C. IgG E. IgE 11、介导NK细胞发挥ADCC效应的Ig主要是：C B. IgM C. IgG E. IgE 12、补体： A A.是一组具有酶活性的蛋白质 B. 对热稳定 C. 具有溶菌作用，但无炎症介质作用 D.参与免疫病理作用 E．C1 在血清含量最高 13、三条补体激活途径的共同点是： E A.参与的补体成分相同 B. 所需离子相同转化酶的成分相同
巨噬细胞免疫球蛋白超家族受体的研究进展(一) 作者：孙晨鸣,马海霞,刘光伟,赵勇 【关键词】巨噬细胞;,免疫球蛋白超家族受体;,抑制作用 关键词]巨噬细胞;免疫球蛋白超家族受体;抑制作用 巨噬细胞在免疫系统中的主要作用是摄取、处理并提呈抗原给辅助性T 淋巴细胞/迟发型超敏反应T淋巴细胞（TH/TD）、B细胞,提供活化第1信号;分泌白细胞介素1（IL1）等第2信号分子,导致以TH细胞活化及以抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）的方式使外源性物质破坏。巨噬细胞表面存在多种受体,如免疫球蛋白超家族受体、补体受体（CR）、CC趋化性细胞因子受体（CCR）、A型清道夫受体（SRA）、甾体类激素受体（如17β雌二醇受体ERα）、Toll样受体（TLR）等,其免疫调节功能主要是通过这些受体而实现。其中免疫球蛋白超家族（immunoglobulinsuperfamily,IgSF）受体是巨噬细胞表面的一类重要受体,参与了多种巨噬细胞诱导的免疫性疾病,并在移植排斥反应中发挥重要作用。IgSF受体可传导抑制性或兴奋性信号,使巨噬细胞的功能上调或下调,从而保持免疫系统的内稳态及产生有效的免疫应答。 1IgSF受体的种类、结构及基因表达 IgSF受体主要包括巨噬细胞Fcγ受体（FcγR）、白细胞免疫球蛋白样受体（LILR）、成对免疫球蛋白样受体（PIR）、血小板内皮细胞黏附分子1（PECAM1/CD31）、骨髓分化蛋白（MyD1）、骨髓细胞上表达的触发受体（TREM）1、白细胞分化抗原（CD）200和CD200R。
1.1FcγRFcγR与免疫球蛋白G（IgG）的Fc段有高亲和力。共有3种FcγR,分别是FcγRⅠ、Ⅱ、Ⅲ,三者之间具有高同源性。FcγRⅠ(D64)为Mr70000的糖蛋白,存在于单核细胞和巨噬细胞膜表面。FcγRⅠa1编码的FcγRⅠ胞外区,与IgG具有高亲和力。FcγRⅠ有两个重要的结构特征:即受体的α链胞膜外区有3个免疫球蛋白样结构域,和1个与α链同源的γ链,两者以非共价键结合。FcγRⅠ的α链只有一段很短的胞质区,γ链胞质区有免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）,可传导活化信号。FcγRⅡ（CD32）是40000的糖蛋白,广泛表达于几乎所有骨髓细胞表面。FcγRⅡ不同异型的功能有所不同,FcγRⅡA通过胞内信号传导引起细胞兴奋,而FcγRⅡB则主要传导抑制性信号。FcγRⅢ（CD16）是40~80000的糖蛋白。FcγRⅢA表达于巨噬细胞、肥大细胞及自然杀伤（NK）细胞,而FcγRⅢB则只在中性粒细胞表达。FcγRⅢ胞膜外区含有2个免疫球蛋白结构域,与IgG的结合是低亲和力的。近期研究表明,FcγRⅠ的高亲和力主要是由于含有第3条免疫球蛋白样结构域,可与IgG2a和IgG2b特异性结合,但不与IgG1结合。FcγR的不同结构域与IgG复合物有不同亲和力的原因目前尚不明确,有待进一步研究1]。 1.2LILRLILR可与主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类或相关分子结合,表达于淋巴细胞及骨髓细胞膜表面。LILR有5个抑制性受体（LILRB1~LILRB5）、3个兴奋性受体（LILRA1~LILRA3）,这些受体在胞外有2~4个IgSF结构域,而胞质区含有酪氨酸残基,可磷酸化并发挥生物学作用。其中LILRB2和LILRB4又被称为免疫球蛋白样转录受体4和3（ILT4
细胞工程综合实验报告 小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 班级 xxxx 姓名 xxxx 学号 xxxxxxxxxx 指导教师 xxxx 实验时间 xxxx 成绩
小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 姓名学号班级 一、实验目的 1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。 2.初步掌握培养过程中的无菌技术。 3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培
常用免疫学检验技术的基本原理 免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T 细胞的克隆扩增，并分泌特异性的免疫球蛋白（抗体）。由于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体）。免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。 最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散，通过观察抗原－抗体相遇时产生的沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达到诊断的目的。这种扩散可以是蛋白的自然扩散，例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散实验。单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体的凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内，让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散，当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。 利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性，可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散，例如免疫电泳试验和双向免疫电泳。免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成分依次分散开。然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原的混合抗体，让各抗原成分与相应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。然后利用标准的抗原－抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体）的鉴别。上述的方法都是利用肉眼观察抗原－抗体反应产生的沉淀，因此灵敏度有很大的局限。比浊法引入沉淀检测产生的免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原－抗体反应产生的浊度，根据标准曲线来计算抗原（或抗体）的含量。该方法不但大大提高了检测的灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量的检测。
消化系统疾病病人的护理练习题4 一、A1 1、溃疡性结肠炎的发病目前多数认为与下列哪一种因素关系最大 A、遗传 B、感染 C、过敏 D、精神紧张 E、免疫异常 2、肠结核的主要感染途径是 A、血型播散 B、淋巴管播散 C、胃肠道播散 D、直接蔓延 E、经过胆道感染 3、X线钡影呈激惹征象，提示为 A、十二指肠球部溃疡 B、肠结核 C、克隆病 D、溃疡性结肠炎 E、结肠癌 4、肠结核的好发部位是 A、升结肠 B、回盲部 C、空肠 D、横结肠 E、乙状结肠 5、引起肠结核的结核杆菌分型主要是 A、人型 B、牛型 C、鼠型 D、非洲型 E、牛型和鼠型 6、下列对肠结核的描述正确的是 A、多见于老年人 B、男性多于女性 C、经口感染 D、多在阑尾部 E、腹痛多在左下腹 7、引起上消化道出血常见的疾病除外
C、十二指肠溃疡 D、急性糜烂性胃炎 E、急性胰腺炎 8、急性胰腺炎属于哪一类性质的炎症 A、感染性炎症 B、无菌性炎症 C、免疫性炎症 D、化学性炎症 E、化脓性炎症 9、急性胰腺炎，首先升高的是 A、血淀粉酶 B、尿淀粉酶 C、血脂肪酶 D、血糖 E、血钙 10、下列不属肝性脑病常见诱因的是 A、上消化道出血 B、大量排钾利尿 C、高热量饮食 D、严重感染 E、便秘 11、肝硬化大出血诱发肝性脑病的主要机制是 A、失血量多导致休克 B、失血后引起脑卒中 C、失血造成脑组织缺氧 D、失血量大干扰脑代谢 E、肠道积血产氨增多 12、假性神经递质引起肝性脑病的机制是 A、干扰脑的能量代谢 B、使脑细胞产生抑制性突触后电位 C、干扰脑细胞膜的功能 D、竞争性取代正常神经递质但其效应极弱 E、引起血浆氨基酸失衡 13、下列选项中不属于原发性肝癌病因的是 A、病毒性肝炎 B、肝硬化 C、黄曲霉菌 D、饮用水污染 E、免疫因素
文章编号:0253-3626(2003)04-0436-04 大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定 李静,王亚平 (重庆医科大学基础医学院组胚教研室,重庆400016) =摘要>目的:为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离,纯化和培养的方法。方法:分离获取大鼠骨髓细胞,在60%DM EM培养液,20%马血清,20%(v/v)L929培养上清的诱导条件下进行体外贴壁培养,6~7天时获得纯度较高的贴壁细胞。采用倒置显微镜下观察生活状态、Wr ight c s染色光镜观察、电子显微镜观察检测贴壁细胞形态学;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能;免疫细胞化学染色观察细胞表面标志等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。结果:获得高纯度的巨噬细胞,且具有良好的吞噬功能,并且具备巨噬细胞的形态特征,特有的水解酶类及特有的表面标志-CD68。结论:本法是一种简易实用的体外分离、纯化、培养骨髓巨噬细胞的方法。 =关键词>骨髓巨噬细胞;分离;纯化;鉴定 =中国图书分类法分类号>R32.43=文献标识码>A=收稿日期>2002-09-24 Methodology of separation,purification,cultivation an d identification of rat bone marrow macrophage LI Jing,et al (Dep artment o f Histolo gy and Embry ology,College of Basic Medical Sciences,Chongqing Medical University) =Abstract>Obj ective:T o study t he biolo gical functions of bone marrow macrophage(BM M5)and to establish the methodolog y of separation,purification,cultivation and identification of BM M5.M ethods:Using the techniques of anchorage-dependent culture of separated r at bone marrow cell(rBM C)in DM EM culture media(contain20%horse serum,20%(v/v)L929conditioned media)in v itro,a lo t o f purified anchor cells were obtained,and t hese cells were identified wit h specifically biological mar ker of macrophage, such as1,morpholog ical obser vation:invert phase contrast microscopy,light and electron microscopy;2,enzyme cytochemistr y:acid phosphatase(A CP),A-acet ic acid naphthol esterase(A-AN E);3,phagocytic exper iment:phag ocy tosis of chicken er ythrocy tes and prepared Chinese ink;4,immunocytochemistry:surface specific antig en of macrophage(CD68stain).Results:T he cells w er e purified having functional satisfactory macrophage acco rding to morphological observation,enzyme cytochemistr y,phag ocyt ic ex periment and immunocytochemistry.Conclusion:T his is a simple and easy method for separation,purification,cultivation and identificat ion of rat marro w macrophage. =Key w ords>Bone marr ow macro phag e;Separation;Purification;I dentification 巨噬细胞是机体的重要防御细胞。大量研究已证明[1,2],巨噬细胞在吞噬与清除异物和衰老死亡细胞、分泌生物活性物质,调节血细胞生成与参与免疫应答等方面发挥着广泛的生物学作用。深入研究巨噬细胞的生物学功能不仅能阐述诸多生理与病理生理学机理,而且对临床相关疾病的治疗也有重要价值。深入探讨巨噬细胞生物学功能的前提或核心 作者介绍:李静(1973-),女,讲师,硕士, 主要研究方向:血细胞发生及其调控机理。问题是如何获得高纯度、高活性的巨噬细胞。尽管国内外不少文献报道[3,4]已能从多种组织和器官中分离、纯化巨噬细胞,但这些方法十分繁琐、复杂,且所需时间较长,耗资较大。为研究一种既简便又经济的巨噬细胞分离与纯化的方法,我们通过诱导骨髓细胞分化,成功的建立了骨髓巨噬细胞的分离、纯化、培养和鉴定方法,为研究巨噬细胞的生物学功能奠定了基础。
1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。 2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。 3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜， 但勿伤及腹膜壁。 4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用 手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。 5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管 内。 6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle 培养基。 7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。 8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。 9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2 次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养 小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7 1.在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。我们的经验是，以0.25%胰 酶+0.02%的EDTA作为消化液。使用温至室温的消化液进行消化，消化时镜下观察，并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底，约3~5 mi n后，待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化，弃去胰酶，以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感，所以不要用吸管反复吹打细胞。该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来，所以换瓶传代就行了。看了楼主的描述，感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。 2.消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞 贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA 的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶3.我得操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、 细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS(磷酸盐缓冲液)10ml漂洗一至两次；弃去2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM 培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。 4.RAW264.7细胞传代后贴壁时间比较短，半小时就能贴很多，刚贴壁时细胞呈圆形，折 光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形，伸出伪足之类的吧。这个时候其实就是提示你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。 5.细胞老得特别快,用DMEM培养基本上一天培养基就会变黄,需要换液,如果换液换晚了 的话细胞就感觉长融在一起细胞壁不清楚,但基本上不会有死细胞 6.小鼠的单核细胞系RAW264.7细胞(ATCC号:TIB-71)用含10% 胎牛血清(FBS，美国 GIBCO公司)的无酚红DMEM (美国Promega公司)培养液培养，其中含50 U/ml青霉素和 50 μg/ml庆大霉素。3 d换液1次,细胞汇片后, 用胰酶二乙胺四乙酸（EDTA）消化液消化 细胞,根据不同的实验目的接种于不同规格的培养板上。 7.ATCC complete growth medium:The base medium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）, Catalog No. 30-2002. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%.