附件2
无菌工艺模拟试验指南（无菌原料药）
1.目的
为指导和规范无菌原料药生产企业开展无菌工艺模拟验证，充分评价无菌原料药生产过程的无菌保障水平，确保无菌原料药的安全性，依据《药品生产质量管理规范（2010年修订）》及附录，制定本指南。
2.定义
本指南所述的无菌工艺模拟试验，是指采用适当的培养基或其他介质，模拟原料药生产中无菌操作的全过程，评价该工艺无菌保障水平的一系列活动。
3.范围
3.1本指南涵盖了无菌工艺模拟试验的基本要求、不同工艺模式的相应要求、试验的基本流程和结果评价等内容，适用于无菌原料药的无菌工艺验证。
3.2本指南所述条款是在现有无菌工艺技术基础上提出的相关要求，旨在规范企业开展无菌工艺模拟试验活动。在科学的基础上，鼓励新技术、新设备的引入，进一步提高无菌原料药的无菌保障水平。
4.原则
在对无菌生产工艺充分认知和生产经验累积的基础上，应结
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合工艺、设备、人员和环境等要素定期开展无菌工艺模拟试验，以确认无菌生产过程的可靠性。同时也为企业及时识别风险，进而改进无菌控制措施提供数据支持。开展无菌工艺模拟试验应遵循以下原则：
4.1 基于无菌工艺设计，对无菌生产全过程实施风险评估，识别生产过程风险点，评估现有控制措施的有效性。模拟试验方案设计时，应充分考虑风险评估的结果。
4.2 应充分考虑硬件装备水平与无菌风险的关联性，结合无菌生产过程所涉及到的工艺、设备、人员以及操作时限等因素针对性开展模拟试验，尽可能模拟实际无菌生产全过程，应特别关注暴露操作、人工干预等高风险过程。
4.3 如生产线有多种无菌生产工艺，应采用风险管理的模式，在综合评价不同无菌生产工艺的基础上设计模拟试验方案，以评价每种无菌工艺过程的可靠性。
4.4 如无菌生产工艺存在显著差异，宜对每种工艺开展模拟试验。
5.无菌原料药生产工艺及模拟范围
无菌原料药的无菌生产工艺通常为：原料药进一步精制和无菌操作的结合，作为无菌原料药生产工艺的开始，多采用除菌过滤或其他除菌技术将物料中的微生物去除，之后采取无菌操作技术的工艺单元，最终获得免受微生物污染的原料药。无菌工艺模拟试验应从第一步无菌操作开始，即经除菌过滤或其他方法获取无菌药液，直至无菌产品完全密封结束。
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与无菌制剂工艺相比，无菌原料药的生产工艺一般更复杂，工艺设备选型呈现出非标化和功能设计差异化等特点。即使是同一无菌工艺过程，因设备选型和系统密闭程度的不同，无菌风险也存在着显著差异。
目前，无菌原料药常用无菌工艺包括：无菌结晶工艺、无菌冷冻工艺和无菌喷雾干燥工艺。
5.1 无菌结晶工艺
典型的无菌结晶工艺流程是从非无菌物料开始，经除菌过滤进入无菌结晶罐内，通过调整物料温度或加入其他溶剂使物料中有效活性成分结晶或沉淀析出，该过程会因控制晶体生长的需要而引入晶种。养晶结束后进入固液分离设备，去除母液获得湿品，必要时对湿品进行洗涤，湿品在固液分离设备内进行干燥或通过辅助密闭系统转移至其他干燥设备内进行干燥，之后根据产品特性和最终质量要求进行必要的整粒（或微粉化），以控制产品粒度大小和分布，混粉也是常用的工艺单元，主要解决产品均一性的问题。最后产品经分装、密封，将产品严封于容器内。
5.2 无菌冻干工艺
常见的无菌冻干工艺流程包括：液体物料经除菌过滤得到无菌料液，在无菌防护下使用加料枪将无菌料液注入冻干机托盘内，按照规定程序进行冷冻真空干燥，干燥结束后经除菌级呼吸器释放冻干机内的真空。在无菌防护下打开冻干机门，将干品由托盘转移至无菌料仓内，或在无菌防护下通过真空密闭吸料系统将干品转移至下一工序，干品通常需要整粒和混粉工艺，以得到
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质量均一的干品，最后经分装、密封，将产品严封于容器内。
5.3 无菌喷雾干燥工艺
无菌喷干工艺适用于耐热性好的无菌原料药，工艺流程通常包括：液体物料经除菌过滤后持续稳定地注入干燥塔内，在无菌高压空气的作用下瞬间雾化成液滴，并与流动的无菌热空气发生传质传热，液滴因水分迅速蒸发而变为粉末状干品，获得的干品经气固分离器收集至无菌料仓内，或直接分装至最终市售包装内。产品在料仓内可实现进一步混粉操作，随后经分装机完成干品的分装、密封等过程，将产品严封于容器内。
5.4 密闭与开放系统
通常无菌工艺由一系列的无菌单元操作组成，单元操作分为“密闭”或“开放”系统，采用“密闭”系统可更好的保障无菌水平。
5.4.1 “密闭”系统
“密闭”系统是通过物理隔离的方式，阻止环境中微生物进入系统内部，保护药品免受外界的污染。因“密闭”系统设计上的优越性，在无菌操作过程提供了可靠的无菌保护措施。企业进行无菌原料药工艺设计时，应尽量考虑采用“密闭”系统的可行性。“密闭”系统至少具备以下特征：
5.4.1.1 能够实现在线灭菌（SIP）或系统在使用前进行密闭和灭菌。
5.4.1.2 能够在一个生产周期内保持系统的完整性。且在与其他密闭系统连接时，能够保持系统完整性不受破坏。
5.4.1.3 在实施预防性维护过程中，有相应措施保护系统的—4 —
完整性。
5.4.2 “开放”系统
“开放”系统是不符合“密闭”系统规定的一项或多项特征的系统，“开放”系统条件下进行的操作是影响最终药品无菌特性的重要环节，如设备（或管道）的无菌连接、分装过程容器的更换等，是引入微生物污染的高风险过程。模拟试验方案设计时应重点考察以上过程中无菌保障措施的有效性。
6.模拟试验方案的设计及实施过程要求
模拟试验是一个系统性工程，通过模拟无菌生产工艺全过程，证实生产过程中无菌保障措施的有效性。因此，模拟试验实施应关注以下几方面：
6.1开展模拟试验的前提条件
开展无菌工艺模拟试验之前，应确认与无菌工艺相关的支持性系统和灭菌系统等验证已完成，并达到了可接受的标准。
6.1.1工艺设备、公用系统和辅助设施按照预期要求完成了设计、安装、运行确认及与无菌生产有关的性能确认。
6.1.2已对工艺设备、公用系统、辅助设施等的灭菌方法完成了相应的验证，物料及厂房、设施所用消毒剂及消毒方式完成了相关的验证。
6.1.3药液及与产品接触的气体、设备组件、容器具灭菌工艺完成了相应的验证。
6.1.4无菌生产区域的气流及环境达到了设计要求，并能稳定运行。依据规定的消毒方法和频次进行环境消毒，应避免消毒
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剂的过度使用。
6.1.5根据无菌生产工艺要求建立了相关文件。
6.1.6参与无菌工艺模拟试验的人员接受了药品GMP、无菌更衣、无菌操作、微生物知识和模拟试验方案的培训。
6.1.7进入无菌洁净区的全部人员通过了更衣程序的确认，并采取文件或其他措施，确定了每位参与者可进入的区域和允许的无菌操作项目。
6.2基于无菌风险的模拟试验方案设计
模拟试验方案设计应结合无菌生产工艺，尽量与实际无菌操作过程保持一致，以求试验结果真实反映生产过程的无菌保障水平。
6.2.1无菌生产工艺的风险评估
无菌生产工艺的设计基于对产品特性、工艺技术和无菌保证措施的认知和经验的累积，设计模拟试验方案前应对无菌生产工艺开展系统性风险评估，以充分识别无菌生产过程中潜在风险点，方案设计时充分考虑风险评估的结果。
6.2.2模拟试验方案设计时，应重点考察和评估高风险无菌操作过程，如溶媒结晶工艺中引入晶种的过程。无菌生产工艺的暴露操作是影响最终原料药无菌特性的重要环节，如设备（或管道）的无菌连接、无菌容器的转运和更换、灌装等关键操作。
6.2.3证实人员的无菌操作能力能够满足无菌生产要求，是实施模拟试验的目的之一。模拟试验方案设计时，应结合工艺过程中的开放系统，重点考察人员的无菌操作过程，评价人员无菌—6 —
操作素养和防护措施的可靠性。
6.3 模拟介质的选择与评价
6.3.1 模拟介质的选择
应考虑模拟介质与无菌工艺的适宜性，结合被模拟产品的特点以及模拟介质的可过滤性、澄清度、灭菌方式等方面选择模拟介质，以尽可能模拟无菌生产全过程。不应选择明显具有抑菌性的模拟介质，以确保模拟试验结果的可信度。通常可采用的模拟介质包括：促进微生物生长的培养基和安慰剂。
6.3.2 培养基的选择
6.3.2.1 胰酪大豆胨液体培养基（TSB）是一种广谱性培养基，特别对无菌工艺环境中源自人体的细菌、芽孢和真菌有良好的促生长效果，是无菌工艺模拟试验常用的培养基。
6.3.2.2 如果产品需充入惰性气体、储存在无氧条件，无菌操作在严格的厌氧环境中进行时（即氧气浓度低于0.1%），应考虑采用厌氧培养基，如硫乙醇酸盐液体培养基（FTM），也可选择其他适宜的培养基。在厌氧的无菌工艺环境监控中反复发现厌氧微生物或在产品无菌检查中发现厌氧微生物时，应考虑增加厌氧培养基开展模拟试验。
6.3.2.3 用于模拟抑菌性产品的培养基，如有必要需评估抑菌性产品残存对其促生长能力及模拟试验结果的影响。
6.3.2.4 包含动物来源成分的培养基，应考虑培养基引入外源污染的风险。如BSE（可传染性海绵脑病）、TSE（疯牛病）等风险，亦可选用植物来源的培养基。
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6.3.3 培养基的配制
6.3.3.1 模拟试验的培养基应在适宜区域进行准备，需注意培养基粉尘在环境中的扩散、残留及去除，防止其残存于环境及设备表面而造成微生物滋生。通常按照药典要求或厂商提供的配制方法配制培养基。配制后的培养基应尽快灭菌或除菌过滤。
6.3.3.2 培养基在模拟试验前应恢复至室温，即用型无菌液体培养基储存和使用条件应遵循生产商要求。
6.3.4 培养基的除菌与灭菌
6.3.4.1 除菌过滤
由于培养基的特性与药液有差异，培养基除菌过滤的滤器型号可与产品使用的过滤器不同。如因培养基颗粒或生物负载较大等原因引起除菌过滤器堵塞时，可增加预过滤。应考虑降低非无菌培养基中细菌和霉菌生长的风险，以避免微生物生长导致培养基过滤性能的降低。此外除菌过滤的方式无法避免支原体污染，湿热灭菌或辐照灭菌有助于降低该潜在风险，必要时可配合除菌过滤联合使用。针对以上情况应进行风险评估并采取合理应对措施。
6.3.4.2 湿热灭菌
在湿热灭菌过程中应考虑避免受热不均匀或灭菌不充分现象。应对该灭菌方式进行风险评估和验证，也可使用无菌干粉或液体成品培养基。
灭菌过程应遵循生产商推荐的灭菌时间和温度的建议，并对灭菌过程予以验证。确保灭菌后培养基的促生长能力，避免过长—8 —
时间及过热灭菌使培养基碳化造成其促生长性能的降低，应进行促生长能力试验。
6.3.4.3 辐照灭菌
使用辐照灭菌的培养基粉末，应在适宜环境下进行配制等操作。辐照灭菌过程应经过验证，并在产品质量报告中体现验证所用的菌种和剂量等信息。
6.3.5 培养基促生长能力试验
6.3.5.1 应在无菌工艺模拟试验前及14天培养后按照现行中国药典方法对培养基进行促生长能力试验。
6.3.5.2 按照中国药典要求，培养基促生长能力试验使用的菌种包括：白色念珠菌（CMCC98001）、黑曲霉（CMCC98003）、枯草芽孢杆菌（CMCC63501）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、铜绿假单胞菌（CMCC10104）和生孢梭菌（CMCC64941）等。除标准菌株之外，还可考虑加入环境和无菌检查中发现的典型微生物。促生长试验接种量应小于100CFU。按照中国药典要求进行培养，证明培养基能够支持微生物的生长。
6.3.6 其他模拟介质的选择及评价
6.3.6.1 其他模拟介质的选择
对于无菌粉末及特殊产品，可根据产品特性、无菌工艺、生产设备及模拟介质特点，也可选用其他模拟介质，如安慰剂。模拟介质的流动性应尽可能类似于被模拟产品，易于灌装/分装等无菌操作。模拟介质还应具有易于灭菌，无抑菌性，易溶解等特性。常用模拟介质有聚乙二醇、乳糖、甘露醇、氯化
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钠、凡士林等。模拟介质的灭菌过程应经验证并提供相关报告，其内容包括灭菌方式对模拟介质特性有无不良影响，灭菌后的无菌性。模拟介质的包装形式应与被模拟产品的包装形式保持一致。
6.3.6.2 其他模拟介质的评价
在使用模拟介质前应对其适用性进行确认，包括抑菌试验、溶解度试验等，如选用无菌模拟介质还应进行无菌试验。抑菌试验通常使用枯草芽孢杆菌（CMCC63501）和白色念珠菌（CMCC98001）。除此之外，还应考虑加入环境和无菌检查中发现的典型微生物。无菌模拟介质用无菌水分散后，加入到无菌培养基中，达到模拟工艺选用的浓度范围，然后每份培养基中接种10—100CFU。阳性对照接种到不含无菌模拟介质的试管中，按照现行中国药典要求培养7天，所有试管应明显微生物生长。
6.4 模拟灌装的数量和持续时间
6.4.1 无菌工艺模拟灌装的数量应足以保证评价的有效性及完成模拟方案中设计的各种干预活动，通常模拟灌装的数量不宜低于正常生产分装数量。
6.4.2 应对所设计的模拟方式、持续时间、灌装的数量、预期收率作出合理说明。
6.4.3 模拟试验所用模拟介质的量，应能够覆盖无菌工艺设备的全部内表面，特别是混粉过程，应确保模拟介质覆盖混粉器内壁全部表面。
6.4.4 考虑到模拟最差条件的需要，模拟关键无菌操作过程—10 —
的维持时间不应低于实际生产用时。
6.5 容器装量
容器中培养基灌装量应考虑适宜微生物生长的需要和容器内表面覆盖的要求，灌装量不必与产品相同。适宜的装量既可保证产品通过倒置和旋转接触到容器所有内表面，又有足够的氧气支持微生物的生长。
6.6 模拟试验方法的选择
通常无菌原料药生产工艺由多个工艺单元构成。模拟试验方案的设计应考虑试验过程可连续性问题，并确定采用连续工艺模拟还是分段模拟。
6.6.1 连续工艺模拟方式
6.6.1.1 这种模拟方式是将整个无菌过程视为一个整体，模拟介质不间断地完成各个单元操作，并在最终分装容器内进行无菌培养和判定，以评价生产过程的无菌保障水平。
6.6.1.2 连续工艺模拟方式的选择，取决于模拟介质在模拟过程中的适用性，如喷雾干燥工艺可采用液体模拟介质，通过模拟喷雾干燥过程，可将液体模拟介质转化为固体模拟介质，进而实现分装、密封等过程的模拟。
6.6.1.3 连续工艺模拟可以真实反映整体无菌保障水平。但也有其不足之处，如发现污染，调查污染源的难度较大。
6.6.2 分段模拟方式
6.6.2.1 分段模拟方式是将无菌生产过程按照工艺单元分割成若干段，逐段进行模拟试验，分段数量取决于工艺过程和模拟
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介质。模拟试验最终的结果是各段独立模拟试验结果的累积，对一些无菌工艺而言，如结晶工艺，可根据需要变换采用液体或固体模拟介质，保持与实际工艺过程的一致性。
6.6.2.2 分段工艺模拟的优点是可以特定评价某一单元操作的无菌风险，如发现微生物污染，相对于连续工艺模拟更易于发现污染源，进而采取针对性纠正措施。
6.6.2.3 分段模拟方式也有不足之处，如：需要更多种类或数量的模拟介质；模拟介质需要多次无菌化处理，增加潜在污染风险；需要采集更多的物料、环境和人员监测样本进行评价。
6.7 最差条件的选择
最差条件并不是指人为创造的超出允许范围的生产状况和环境。为了确认无菌工艺风险控制的有效性，应通过风险评估并结合无菌生产工艺、设备装备水平、人员数量和干预等因素来设计模拟试验的最差条件。包括但不限于以下方面：
6.7.1 人员
应充分考虑人员及其活动对无菌生产工艺带来的风险，如模拟生产过程的最多人数，当操作人员数量减少可能导致其他方面污染风险增加时，则此类条件也视为最差条件之一。参与人员应包括日常参与到无菌生产的全部人员，如生产操作、取样、环境监测和设备设施维护人员，同时应考虑以上人员交叉作业、班次轮换、更衣、夜班疲劳状态等因素。
6.7.2 时限
应适当考虑模拟实际生产操作过程中房间、设备、物料消毒—12 —
或灭菌后放置的最长时间及最长的工艺保留时限等，如：混粉或分装前的等待时限。
6.7.3 分装速度
模拟试验应涵盖产品实际灌装速度范围，基于无菌风险的角度分析评价灌装速度对工艺过程及其他方面的影响程度。如模拟最长的暴露时间或模拟最大操作强度/难度。
6.7.4 环境
6.7.4.1模拟试验挑战的最差环境，应考虑选择无菌生产周期的末端，或连续生产期间，环境消毒周期性内最长的时间间隔。
6.7.4.2 日常生产中，针对微生物污染事件而制定了纠正措施。在模拟试验时，应对纠正措施的有效性给予确认。
6.8 干预设计
6.8.1 概念
干预是指由操作人员按照相关规定参与无菌工艺生产有关的所有操作活动。干预可分为固有干预和纠正性干预。固有干预是指常规和有计划的无菌操作，如环境监控、设备安装或容器更换等；纠正性干预是指对无菌生产过程的纠正或调整，如更换部件、设备故障排除等。
6.8.2 原则
无菌生产过程各种允许的干预活动应该文件化，明确规定正常生产活动和干预活动，模拟试验中干预设计应与实际的生产活动保持一致，模拟试验不应挑战不合理的干预，以证明其
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合理性。在模拟试验方案中应制定干预清单和实施计划，模拟试验时逐一实施并记录。
6.8.3 干预类型及频次
6.8.3.1 模拟试验方案中应明确规定固有干预和纠正性干预（如维修、故障停机、设备调试）的类型、频次。
6.8.3.2 固有干预及经常发生的纠正性干预应在每次模拟中都实施，偶发性的干预可周期性的模拟。如无菌生产过程意外暂停或重启、无菌状态下设备、设施偶发故障排除等。
6.8.3.3 模拟试验应设计并实施足够多的纠正性干预。干预频次的设计应考虑生产过程按比例覆盖模拟试验的全过程。
6.8.3.4 对于无菌取样过程，应考虑分布在分装的前、中、后阶段，调整装量、取样、重复密封过程均应考虑模拟，并为生产过程中处理该类问题提供参考。
6.8.4 人员
实施干预的人员（应包括操作、维修人员等）应经过相关的培训和考核，能够按规定的程序实施各种干预。标准化的固有干预可由部分操作人员实施并据此评价其他人。对于复杂操作，如分装机装配或故障排除等，每个从事此类操作的人员都应在试验过程进行模拟，操作条件不应优于日常生产的操作条件。
6.8.5 干预后产品（容器）的处理
实际工艺中如明确规定受干预影响的产品（容器）应从生产线上剔除，在模拟试验时也可剔除，模拟试验时产生的这类产—14 —
品（容器）可不培养。无需培养的培养基应予以记录并评估其合理性。如在干预发生前已经密封，但在日常生产中按规定不需要剔除的产品，模拟试验时也应保留、培养并纳入评估。
6.8.6 记录
模拟试验过程中的所有干预必须记录，用以评估干预对无菌保证的影响。纠正性干预记录的内容至少应包括纠正性干预的类型、位置、次数；固有干预记录至少包括干预内容和发生频率等信息。
6.9 容器规格
对于生产线存在多种相似的容器规格（如：同一品种的不同容器规格）时，应通过风险评估选择模拟的容器规格，通常选择最小和最大尺寸的容器进行模拟。特殊规格的容器应考虑单独进行模拟。
6.10 培养与观察
6.10.1 模拟介质的处理
无菌工艺模拟试验结束后，应对所使用的模拟介质（培养基、安慰剂）进行全部处理和培养。非培养基模拟介质可通过适当的无菌过滤器系统将微生物转移至滤膜或其他便于培养、观察的介质上，之后滤膜或其他介质浸入培养基内进行培养；也可在最终包装容器内加注无菌培养基进行培养。培养基的浓度应能支持潜在微生物的生长，如：TSB一般浓度控制在3%水平。
6.10.2 培养条件
6.10.2.1 应对容器翻转、倒置等，确保培养基接触容器（包
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括密封件）的所有内表面。培养时间至少14天。可选择两个温度进行培养：在20℃—25℃培养至少7天，然后在30℃—35℃培养至少7天。如选择其他培养计划，应有试验数据支持所选培养条件的适用性。在整个培养期间应连续监控培养温度。
6.10.2.2 如实际生产过程中，分装容器内需要填充惰性气体，在模拟试验过程应考虑用无菌空气替代，避免影响微生物生长。
6.10.2.3 如必须采用惰性气体用于模拟厌氧无菌工艺（氧气浓度低于0.1%）及培养厌氧微生物，应确认惰性气体与所选培养基的组合，能够支持微生物的生长。
6.10.3 培养后的检查
6.10.3.1 培养结束后，应对所有模拟灌装产品逐一进行无菌性检查，通常应在合适的照度下进行目视观察。
6.10.3.2 在培养期间定期观察培养基的培养情况，如在培养期间发现异常情况时应进行进一步调查。如在检查中发现密封缺陷的灌装产品，应进行适当的原因调查并采取纠正措施。
6.10.3.3 培养容器不透明时，应考虑将转移至透明容器观察，以确保有阳性时能被观察到。
6.11 计数与数量平衡
为保证模拟试验结果的可靠性，应对各阶段灌装数量进行准确计数，如灌装数量、干预剔除数量、培养前数量和培养后无菌检查数量，各阶段数量应平衡。如发现不平衡，应调查原因并判断本次模拟试验结果的有效性。
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6.12 环境及监控
6.12.1 环境监控方案设计
应通过风险评估确定日常生产环境监控的各要素，如取样点、取样对象、取样频率、警戒和纠偏标准、实施方法等。模拟试验时应采用与日常生产相同的环境监控方案为基础，模拟生产状况，包括采样仪器、耗材的转移、消毒等，任何异于日常环境监控的情况都应有说明和记录。
与实际生产过程相比，模拟试验中的环境监控应考虑增加额外的监测环节，如人员监测。
6.12.2 环境监控数据处理
6.12.2.1 环境（包括人员）监控的数据结果用于评估模拟生产过程中的环境条件是否适宜于生产。当模拟试验出现阳性结果时，环境监测数据可用于进行根本原因的调查。
6.12.2.2 模拟试验时发生的环境偏差并不是模拟试验成功的否决条件，是否通过试验取决于调查的结果。环境监测结果异常时，即使试验结果成功，也应进行必要的调查和纠正。即使最终决定在环境监控结果超出纠偏标准时无菌工艺模拟试验依然通过，也不意味着日常生产可以在同等环境偏差的条件下进行。
6.13 人员因素
所有被授权进行无菌操作的人员，包括生产操作人员、监督人员和维修人员等，每年至少参与一次成功的无菌工艺模拟试验。
7. 可接受标准与结果评价
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无菌工艺模拟试验可接受标准应当遵循现行GMP无菌药品附录中的有关规定。
7.1 应采用定性标准判定模拟试验结果，定性标准意味着模拟试验只接受零污染的结果，排除了定量标准中识别微生物污染来源的困惑和潜在不确定性风险。
7.2 应通过评估确定模拟介质的预期收率，并作为模拟试验结果可接受标准之一。
8. 污染调查与纠正措施
8.1 无菌工艺模拟试验存在污染，即意味着无菌保证可能存在问题，出现的任何污染样品均应视为偏差并彻底调查，并为改进无菌工艺提供数据支持。
8.2 可通过查看无菌工艺模拟试验的录像或现场记录，还原模拟试验过程中人员操作行为、干预及设备运行等状况，有利于分析问题的来源。对无菌工艺模拟试验实施过程相关的所有记录进行详细调查，并关注各种偏差、验证、变更等，所有偏离原始验证状态情况均应逐一评估并说明。检查所有相关人员的培训和资质确认记录。
8.3 建议对模拟试验中发现的微生物进行鉴别，以便开展污染途径的调查，并列入企业微生物菌种库。
8.4 调查的关键是查找污染来源，结合调查需要，应制定一个完整的取样和微生物鉴别计划，调查过程应有记录并归档。调查结果应形成书面报告并得到质量管理部门的批准。
8.5 如调查找到指定的原因，应制定纠正预防措施，并再次—18 —
进行模拟试验，以证明措施的有效性。如调查无指定原因，应对生产工艺过程的无菌控制开展系统性评估，在现有模拟试验方案的基础上增加取样点和频次，以获得更多数据支持原因调查，同时应适当增加试验批次。
9. 模拟试验的周期与再验证
9.1 新建无菌生产线，在正式投产前，每班次应当连续进行3次合格的模拟试验。
9.2 正常生产中，每班次每半年应至少进行一次模拟试验。对于因停产的生产线，在恢复正式生产前应考虑进行无菌工艺模拟试验。
9.3 空气净化系统、无菌生产用设备设施、无菌工艺及人员重大变更或设备的重大维修后，应进行风险评估确认再模拟试验批次。
9.4 应充分评估生产线的风险，在发现设施、人员、环境或工艺的持续监测出现不良趋势或无菌不合格时，也应考虑再次进行模拟试验。
10. 无菌工艺模拟试验的局限性
无菌工艺模拟试验虽然基于无菌风险而开展的，但考虑到每次无菌操作过程的唯一性，成功的无菌工艺模拟试验是允许正式生产的必要条件，但应注意其局限性。
10.1 以现行药品GMP法规要求为准则，评价无菌生产过程的法规符合性，低于规范要求的无菌工艺过程，不能通过模拟试验来证实其无菌控制的合理性。
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10.2 虽然可通过培养基模拟灌装试验来评估无菌生产工艺的可靠性。但当产品无菌检查出现阳性时，不能以模拟试验结果，排除生产过程所带来的污染可能性。
10.3 模拟试验过程引入了模拟介质，存在残留或促进微生物滋生的潜在风险。因此，模拟试验完成后模拟介质应进行清洁和有效性确认。
11. 术语
无菌原料药：法定药品标准中列有无菌检查项目的原料药。
无菌工艺：物料、器具经过灭菌处理，并在无菌防护下加工获得最终产品，且产品装入其最终容器后不再进行任何灭菌处理。
无菌工艺模拟试验：用模拟介质代替产品，模拟无菌工艺过程，来评估无菌生产过程的无菌保障水平。
“密闭”系统：是指系统在使用前采用经验证的灭菌程序进行在线灭菌或密闭后灭菌，并在一个完整生产周期内能够耐受压力或真空，系统泄漏率维持在规定范围内，以保证系统的完整性。
模拟介质：可用于替代无菌原料药模拟无菌工艺过程的物料，如培养基、安慰剂等。
TSB（Tryptone Soy Broth Medium）：胰酪大豆胨液体培养基，用于真菌和需氧菌培养。
安慰剂：是一种“模拟的无菌原料药”。其物理特性与无菌原料药相似，但无促生长作用。
FTM（Fluid Thioglycollate Medium）：硫乙醇酸盐液体培养—20 —
附件3 无菌工艺模拟试验指南（无菌制剂） 1.目的 为指导和规范无菌制剂生产企业开展无菌工艺模拟试验，充分评价无菌制剂产品生产过程的无菌保障水平，确保无菌制剂的安全性，依据《药品生产质量管理规范（2010年修订）》及附录，制定本指南。 2.定义 本指南所述的无菌工艺模拟试验，是指采用适当的培养基或其他介质，模拟制剂生产中无菌操作的全过程，评价该工艺无菌保障水平的一系列活动。 3.范围 3.1本指南涵盖了无菌工艺模拟试验的基本要求、不同工艺模式的相应要求、试验的基本流程和结果评价等内容，适用于无菌制剂的无菌工艺验证。 3.2本指南所述条款是在现有无菌工艺技术基础上提出的相关要求，旨在规范企业开展无菌工艺模拟试验活动。在科学的基础上，鼓励新技术、新设备的引入，进一步提高无菌制剂的无菌保障水平。 4.原则 在对无菌生产工艺充分认知和生产经验累积的基础上，应结 —1 —
合工艺、设备、人员和环境等要素定期开展无菌工艺模拟试验，以确认无菌生产过程的可靠性。开展无菌工艺模拟试验应遵循以下原则： 4.1对无菌生产过程实施风险评估，识别生产过程风险点。评估结果应在试验方案设计时给予考虑。 4.2应充分考虑硬件装备水平与无菌风险的关联性，结合无菌生产过程所涉及到的工艺、设备、人员以及操作时限等因素针对性开展模拟试验。尽可能模拟实际无菌生产全过程。应特别关注暴露操作、人工干预等高风险过程。采用良好设计且受控的无菌灌装系统，特别是自动化的系统如吹灌封、隔离器等，污染率可大幅度降低。 4.3如在同一生产线生产不同剂型和容器规格的产品，应考虑模拟试验方案对各产品无菌工艺过程的适用性。应对有显著差异的无菌工艺过程开展模拟试验。采用风险评估的方式统筹考虑该生产线生产使用的容器类型、规格大小，产品类别，灌装速度、过程中断等环节，进行试验方案的设计。 5.无菌制剂生产工艺及模拟范围 无菌生产工艺通常包含：经除菌过滤或其他方法获取无菌药液或无菌粉末，在无菌条件下进行液体灌装或粉末分装，容器密封。冻干制剂在液体灌装的基础上增加了冷冻干燥过程。 无菌工艺模拟试验应从无菌操作的第一步开始，直至无菌产品完全密封结束。如果在产品制备阶段采用了无菌工艺，此部分工艺也应作为模拟验证的一部分。对于全过程无菌生产（如配制—2 —
1．【2018新课标1卷】焦亚硫酸钠（Na2S2O5）在医药、橡胶、印染、食品等方面应用广泛。回答下列问题： （1）生产Na2S2O5，通常是由NaHSO3过饱和溶液经结晶脱水制得。写出该过程的化学方程式__________。 （2）利用烟道气中的SO2生产Na2S2O5的工艺为： ①pH=4.1时，Ⅰ中为__________溶液（写化学式）。 ②工艺中加入Na2CO3固体、并再次充入SO2的目的是__________。 （3）制备Na2S2O5也可采用三室膜电解技术，装置如图所示，其中SO2碱吸收液中含有NaHSO3和Na2SO3。阳极的电极反应式为_____________。电解后，__________室的NaHSO3浓度增加。将该室溶液进行结晶脱水，可得到Na2S2O5。 （4）Na2S2O5可用作食品的抗氧化剂。在测定某葡萄酒中Na2S2O5残留量时，取50.00mL葡萄酒样品，用0.01000mol·L?1的碘标准液滴定至终点，消耗10.00mL。滴定反应的离子方程式为_____________，该样品中Na2S2O5的残留量为____________g·L?1（以SO2计）。 【答案】2NaHSO3＝Na2S2O5+H2O NaHSO3得到NaHSO3过饱和溶液2H2O－4e－＝4H＋+O2↑a
S2O52－+2I2+3H2O＝2SO42－+4I－+6H＋0.128 【解析】分析：（1）根据原子守恒书写方程式； （2）①根据溶液显酸性判断产物； ②要制备焦亚硫酸钠，需要制备亚硫酸氢钠过饱和溶液，据此判断； （3）根据阳极氢氧根放电，阴极氢离子放电，结合阳离子交换膜的作用解答； （4）焦亚硫酸钠与单质碘发生氧化还原反应，据此书写方程式；根据方程式计算残留量。 详解：（1）亚硫酸氢钠过饱和溶液脱水生成焦亚硫酸钠，根据原子守恒可知反应的方程式为2NaHSO3＝Na2S2O5+H2O； （2）①碳酸钠饱和溶液吸收SO2后的溶液显酸性，说明生成物是酸式盐，即Ⅰ中为NaHSO3； ②要制备焦亚硫酸钠，需要制备亚硫酸氢钠过饱和溶液，因此工艺中加入碳酸钠固体、并再次充入二 氧化硫的目的是得到NaHSO3过饱和溶液； 点睛：本题以焦亚硫酸钠的制备、应用为载体考查学生对流程的分析、电解原理的应用以及定量分析等，题目难度中等。难点是电解池的分析与判断，注意结合电解原理、交换膜的作用、离子的移动方向分析电极反应、亚硫酸氢钠浓度的变化。易错点是最后一问，注意计算残留量时应该以二氧化硫计，而不是焦亚硫酸钠。 2．【2018新课标2卷】我国是世界上最早制得和使用金属锌的国家，一种以闪锌矿（ZnS，含有SiO2和少量FeS、CdS、PbS杂质）为原料制备金属锌的流程如图所示： 相关金属离子[c0(M n+)=0.1mol·L-1]形成氢氧化物沉淀的pH范围如下：
目录 1 概述 (1) 2 验证目的 (1) 3 适用范围 (1) 4 职责 (1) 5 验证人员 (1) 6 验证要求 (1) 7 验证工艺 (2) 8 工艺描述 (2) 9 取样计划及可接受标准 (5) 10 验证过程 (6) 11 验证结果与评价 (8) 12 偏差 (10) 13 稳定性试验 (10) 14 再验证 (10)
1概述 1.1产品描述 1.2公司生产的*****为无菌原料药，其工艺验证主要为工艺过程的验证，包括精制结晶、 过滤洗涤烘干、包装和无菌生产验证，以及不溶性颗粒的控制。 1.3验证采用同步验证，取连续三批试生产批的数据利用制图（或表）统计分析方法进行数 据分析。 1.4本验证是在厂房设施验证、设备验证、设备清洗验证、工艺用水验证、无菌生产验证已 完成的基础上进行的。 2验证目的 通过验证证明*****无菌原料药的生产工艺处于控制状态，所有被定义为关键工艺及控制参数范围已被验证，此工艺能恒定地生产出符合预先规定的质量标准的产品。 3适用范围 适用于公司*****无菌原料药生产工艺的验证 4职责 4.1生产技术部负责验证方案和验证报告的起草、生产计划的安排（包括与各部门的协调）。 4.2生产车间负责生产的进行和批生产记录的填写。 4.3质量管理部负责检验方法的验证和中间过程、产品的检测。 4.4验证工作组负责验证方案和验证报告的审核和批准。 5验证人员 6 6.1所有原辅料必须通过各个原辅料测试标准规定的所有项目 6.2
6.3 品分成三个1/3部分，在每个部分中取样，开始的1/3为B；中间的1/3为M，末了的1/3为E。 6.3.1验证时的取样除常规取样点外，还必须增加额外的取样点。 6.3.2每个部位的样品，必须单独测试有关项目。 7验证工艺 8 8.1工艺流程图及工序管理点 8.1.1工艺流程图
无菌工艺模拟试验指南（无菌制剂） （征求意见稿） 国家食品药品监督管理总局 食品药品审核查验中心
二〇一六年十月 目录 1.目的 (1) 2.定义 (1) 3.范围 (1) 4.原则 (2) 5.无菌制剂生产工艺及模拟范围 (2) 6.模拟试验方案的设计及实施过程要求 (3) 6.1. 无菌工艺模拟试验的前提条件 (3) 6.2.基于风险的方案设计 (4) 6.3.模拟介质的选择与评价 (4) 6.4.灌装数量及模拟持续时间 (8) 6.5.容器装量 (9) 6.6. 模拟试验方法的选择 (9) 6.7. 最差条件的选择 (10) 6.8.干预 (12) 6.9.容器规格 (13) 6.10.培养与观察 (14) 6.11. 计数与数量平衡 (15) 6.12. 环境（包括人员）监控 (15) 6.13. 人员因素 (16) 6.14. 不同剂型应考虑的特殊因素 (16) 6.15. 方案的实施 (19) 7.可接受标准与结果评价 (20)
8.污染调查及纠正措施 (21) 9.模拟试验的周期与再验证 (21) 10.无菌工艺模拟试验的局限性 (212) 11.术语 (23) 12. 参考文献 (24)
无菌工艺模拟试验指南（无菌制剂） 1.目的 为指导和规范无菌制剂生产企业开展无菌工艺模拟试验，充分评价无菌制剂产品生产过程的无菌保障水平，确保无菌制剂的安全性，依据《药品生产质量管理规范》（2010版）及附录，制定本指南。 2.定义 本指南所述的无菌工艺模拟试验，是指采用适当的培养基或其他介质，模拟制剂生产中无菌操作的全过程，评价该工艺无菌保障水平的一系列活动。 3.范围 3.1.本指南涵盖了无菌工艺模拟试验的基本要求、不同工艺模式的相应要求、试验的基本流程等内容，适用于无菌制剂的无菌工艺验证。 3.2.本指南所述条款是在现有无菌工艺技术基础上提出的相 关要求，旨在规范企业开展无菌工艺模拟试验活动。在科学的基础上，鼓励新技术、新设备的引入，进一步提高无菌制剂的无菌保障水平。 4.原则 在对无菌生产工艺充分认知和生产经验累积的基础上，应结合工艺、设备、人员和环境等要素定期开展无菌工艺模拟试验，
附件2 无菌工艺模拟试验指南（无菌原料药） 1.目的 为指导和规范无菌原料药生产企业开展无菌工艺模拟验证，充分评价无菌原料药生产过程的无菌保障水平，确保无菌原料药的安全性，依据《药品生产质量管理规范（2010年修订）》及附录，制定本指南。 2.定义 本指南所述的无菌工艺模拟试验，是指采用适当的培养基或其他介质，模拟原料药生产中无菌操作的全过程，评价该工艺无菌保障水平的一系列活动。 3.范围 3.1本指南涵盖了无菌工艺模拟试验的基本要求、不同工艺模式的相应要求、试验的基本流程和结果评价等内容，适用于无菌原料药的无菌工艺验证。 3.2本指南所述条款是在现有无菌工艺技术基础上提出的相关要求，旨在规范企业开展无菌工艺模拟试验活动。在科学的基础上，鼓励新技术、新设备的引入，进一步提高无菌原料药的无菌保障水平。 4.原则 在对无菌生产工艺充分认知和生产经验累积的基础上，应结 —1 —
合工艺、设备、人员和环境等要素定期开展无菌工艺模拟试验，以确认无菌生产过程的可靠性。同时也为企业及时识别风险，进而改进无菌控制措施提供数据支持。开展无菌工艺模拟试验应遵循以下原则： 4.1 基于无菌工艺设计，对无菌生产全过程实施风险评估，识别生产过程风险点，评估现有控制措施的有效性。模拟试验方案设计时，应充分考虑风险评估的结果。 4.2 应充分考虑硬件装备水平与无菌风险的关联性，结合无菌生产过程所涉及到的工艺、设备、人员以及操作时限等因素针对性开展模拟试验，尽可能模拟实际无菌生产全过程，应特别关注暴露操作、人工干预等高风险过程。 4.3 如生产线有多种无菌生产工艺，应采用风险管理的模式，在综合评价不同无菌生产工艺的基础上设计模拟试验方案，以评价每种无菌工艺过程的可靠性。 4.4 如无菌生产工艺存在显著差异，宜对每种工艺开展模拟试验。 5.无菌原料药生产工艺及模拟范围 无菌原料药的无菌生产工艺通常为：原料药进一步精制和无菌操作的结合，作为无菌原料药生产工艺的开始，多采用除菌过滤或其他除菌技术将物料中的微生物去除，之后采取无菌操作技术的工艺单元，最终获得免受微生物污染的原料药。无菌工艺模拟试验应从第一步无菌操作开始，即经除菌过滤或其他方法获取无菌药液，直至无菌产品完全密封结束。 —2 —
无菌检查方法学验证 1. 概述 将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作,并接种小于100cfu 的试验菌,同时设置阳性对照,按规定温度培养3~5 天,与各相应的阳性对照管比较: 如含供试品各管中的试验菌均生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用,可按此法进行供试品的无菌检查;如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用,并再重新进行验证试验。 2. 验证前提条件 供试品的选择原则:相同配方,不同规格的制品,选择其中装量最大的制品进行验证。种类相同,含量不同的制品,选择含量最高的制品进行验证。照此原则,多规格制 品按下表选择供试品进行验证。 3. 验证方法 3.1菌液制备 3.1.1细菌菌液制备程序 ①取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上,使均匀分布，置30~35C培养18h~24h。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30~35C培养18h~24h o 同法操作,培养得第3代培养物。 ②取生抱梭菌的冻干菌种管一支,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养 肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上,使均匀分布,置30~35C培养18h~24h o用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜
面上，于30~ 35°C培养18h~24h。取生抱梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流 体培养基中,30~35C培养18h~24h,得第3代培养物。 ③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混合器混合20s或在手掌上振敲80次,以使细菌悬浮均匀,得初步菌悬液。 ④取初步制成的上述菌悬液和生抱梭菌第3代新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度，即得每1ml含菌数小于100cfu验证细菌菌液。 3.1.2抱子悬液制备程序 ①取白色念珠菌和黑曲霉的冻干菌种管各一支,分别在无菌操作下打开,以毛细 吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入改良马丁琼脂斜面上，使均匀分布，置23~28C培养5~7天。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于改良马丁琼脂斜面上,同上述条件培养得第2代培养物。取第2代培养物,同法操作,得第3代培养物。 ②用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml0.9%无菌氯化钠溶液加入上述第三代新鲜斜 面试管内,反复吹吸,洗脱抱子,用管口带有薄的无菌棉花或纱布的毛细吸管吸出抱子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度,即得每1ml含菌数小于100cfu验证抱子悬液。 3.2 薄膜过滤 3.2.1 供试品试验组 取规定量供试品,按《无菌检查标准操作细则》薄膜过滤后,如为不含防腐剂供试品，则往其中一只滤筒内接入100ml改良马丁培养基，往另一只滤筒内各接入100ml 的硫乙醇酸盐流体培养基,用5ml灭菌注射器抽取1ml验证菌液，从集菌培养器胶管处注入培养基中;如为含防腐剂供试品,则待供试品过滤完后,连续 3 次用
ISE TCAD 课程设计教学大纲 ISE TCAD 环境的熟悉了解 一．GENESISe ——ISE TCAD 模拟工具的用户主界面 1） 包括GENESISe 平台下如何浏览、打开、保存、增加、删除、更改项目；增加实 验；增加实验参数；改变性能；增加工具流程等； 2） 理解基本的项目所需要使用的工具，每个工具的具体功能及相互之间的关系。 二．工艺流程模拟工具LIGMENT/DIOS ，器件边界及网格加密工具MDRAW 1） 掌握基本工艺流程，能在LIGMENT 平台下完成一个完整工艺的模拟； 2） 在运用DIOS 工具时会调用在LIGMENT 中生成的*_dio.cmd 文件； 3） 能直接编辑*_dio.cmd 文件，并在终端下运行； 4） 掌握在MDRAW 平台下进行器件的边界、掺杂、网格的编辑。 三．器件仿真工具DESSIS ，曲线检测工具INSPECT 和TECPLOT 。 1） 理解DESSIS 文件的基本结构，例如：文件模块、电路模块、物理模块、数学模 块、解算模块； 2） 应用INSPECT 提取器件的参数，例如：MOSFET 的阈值电压（Vt ）、击穿电压 BV 、饱和电流Isat 等； 3） 应用TECPLOT 观察器件的具体信息，例如：杂质浓度、电场、晶格温度、电子 密度、迁移率分布等。 课程设计题目 设计一 PN 结实验 1） 运用MDRAW 工具设计一个PN 结的边界（如图所示）及掺杂； 2） 在MDRAW 下对器件必要的位置进行网格加密； 3） 编辑*_des.cmd 文件，并在终端下运行此程序，考虑偏压分别在-2V ，0V ，0.5V 时各自的特性； 4） 应用TECPLOT 工具查看PN 结的杂质浓度，电场分布，电子电流密度，空穴电 流密度分布。 提示：*_des.cmd 文件的编辑可以参看软件中提供的例子并加以修改。 所需条件：17 103?=A N ， 18 103?=D N 设计二 NMOS 管阈值电压Vt 特性实验 1） 运用MDRAW 工具设计一个栅长为0.18m μ的NMOS 管的边界及掺杂； 2） 在MDRAW 下对器件必要的位置进行网格加密；
类别：编号: 部门：页码: 无菌检验方法验证 版次：□新订口替代: ________________ 制定人: ___________________ ____________ H H 日审批会签: _____________________________________________
1.1 确认所用的检查方法适用于一次性活检钳的无菌检查。 1.2 确认检查结果的准确性、可靠性、重复性和可操作性及检查方法的完整 性。 2. 验证范围 适用于我公司生产的一次性活检钳无菌检验。 3. 检验依据 《中国药典》附录无菌检查法 ISO11737-2: 医疗器械的灭菌微生物学方法第一部分: 确认灭菌过程的无菌试验 GB/T14233.2- 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分: 生物学试验方法 4. 验证器材 4.1 检验环境: 无菌检查应在环境洁净度10000 级下的局部100 级的单向流空气 区域内进行操作。 4.2 设备: 医用净化工作台、生物安全柜、无菌检查膜过滤器、电动吸引器、 电热干燥箱、霉菌培养箱、数显生化培养箱、压力蒸汽灭菌器、电子天平、pH 计、冰箱、恒温水浴锅、显微镜等。 4.3 培养基及稀释液: 硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、pH7.0 氯化钠- 蛋白胨缓冲液、0.1% 蛋白胨水溶液、营养琼脂。 4.4其它实验材料：微孔滤膜（孔径w 0.45um,直径约50mm）、无菌过滤杯、无 菌剪刀、无菌镊子、无菌钳子、无菌手套、吸管（1ml和10ml）、酒精灯、三角烧瓶、接种环、培养皿。
5.1 原理: 活检钳的形状为不溶物, 为微生物转移更彻底, 特选用无菌检查法中的 薄膜过滤法。 5.2 设备器材: 验证中所用器材、设备已经过国家计量单位鉴定合格并有鉴定证书。 5.3 培养基: 验证中所用培养基以经过培养基灵敏度实验检测合格。 5.4 操作步骤: 5.4.1 供试品的取样按照GB/T 2828.1- 相关规定进行逐批取样。 5.4.2 将所需物品, 供试品表面消毒, 经过传递窗, 紫外线照射半小时. 无菌室紫 外线消毒半小时。 5.4.3 操作人员用洗手液、自来水清洗双手, 关闭紫外灯, 换拖鞋, 脱外衣放入衣 柜, 穿洁净白大衣, 进入缓冲间, 再用洗手液、纯化水清洗双手, 用75% 乙醇对手进行消毒, 穿戴无菌衣、帽、口罩、手套等。 5.4.4 进入菌检室, 打开医用洁净工作台风机, 运行至少15分钟以上。 5.4.5 将所需物品由传递窗取出, 两只消毒液桶分别放置于菌检洁净工作台一侧, 其余物品放置于传递窗一侧的方形桌上, 剥去牛皮纸外包装。 5.4.6 医用洁净工作台内点燃酒精灯。打开3个养琼脂平板, 置于医用洁净工作 台的不同位置。 5.4.7 取供试品, 在医用洁净工作台内, 打开包装袋, 小心将供试品取出, 将其剪成 约10cm的小段，浸入500ml 0.1%无菌蛋白胨水溶液中，充分振摇作为供 试液。 5.4.8 将供试液平均转入三个薄膜过滤器的滤杯中, 开启电动吸引器开关进 行过滤，用pH7.0蛋白胨-氯化钠缓冲液每次100ml冲洗滤膜三次，用平口镊子夹取滤膜（过程保持滤膜的完整性） , 一张转移到100ml 改
工艺流程模拟计算 1、工艺流程模拟目的 （1）物料衡算 物料衡算就是根据质量守恒定律确定原料和产品间的定量关系，计算出原料和辅助材料的用量、各种中间产品、副产品、成品的产量和组成以及三废的排放量。 物料平衡是进行工艺设计和设备设计的基础，通常在完成物料衡算的基础上才能进行能量衡算，进行工艺方案的比选，指导设备的工艺计算及选型、仪表选型、管道尺寸计算等，完成化工过程的PFD和PID的设计。另外，通过物料衡算还可以分析实际生产过程是否完善，从而找出改造措施来改进工艺流程，达到提高收率、减少副产物和降低三废排放量等目的。 （2）能量衡算 在生产过程中能量消耗是一项重要的技术经济指标，他是衡量生产方法是否合理、先进的重要标志之一。热量衡算是在物料衡算的基础上依据能量守恒定律，定量表示工艺过程的能量变化，计算需要外界提供的能量或系统可输出的能量，由此确定加热剂或冷却剂的用量、机泵等输送设备的功率以及换热设备的尺寸。此外，通过整个工艺过程的能量衡算还可以得出过程的能耗指标，分析工艺过程的能量利用是否合理，以便节能降耗，提高过程的能量利用水平。 工艺专业在完成全过程物料、能量平衡计算后，应把主要物流计算结果列于物料平衡表，也可直接表示在工艺流程图上。 2、工艺流程模拟计算软件 （1）工艺装置采用PRO/II软件、ASPEN PLUS软件或HYSYS软件； （2）火炬、装置空气等系统管网应采用INPLANT软件。 （3）当以上软件不适用时，可采用其它软件，但应通过工艺室技术组认可、主管副总或主管副总经理审定、公司技术委员会批准。 3、计算基础 （1）计算所需的原始数据（如原料组成、产品要求等）。 （2）编制计算输入文件应依据确定的工艺流程方案。 4、计算步骤 （1）根据工艺流程方案编制计算流程框图； （2）初步确定每个工艺操作单元的操作条件；
灭菌/无菌工艺验证指导原则（第二稿） 目录 1概述 (2) 2制剂湿热灭菌工艺 (3) 2.1湿热灭菌工艺的研究 (3) 2.1.1 湿热灭菌工艺的确定依据 (3) 2.1.2过度杀灭法的工艺研究 (5) 2.1.3残存概率法的工艺研究 (5) 2.2湿热灭菌工艺的验证 (7) 2.2.1物理确认 (7) 2.2.2 生物学确认 (9) 3制剂无菌生产工艺 (10) 3.1无菌生产工艺的研究 (10) 3.1.1无菌分装生产工艺的研究 (10) 3.1.2 过滤除菌生产工艺的研究 (11) 3.2 无菌生产工艺的验证 (12) 3.2.1培养基模拟灌装试验 (12) 3.2.2 除菌过滤系统的验证 (14) 4原料药无菌生产工艺 (17) 4.1 无菌原料药生产工艺特点 (18) 4.1.1 溶媒结晶工艺 (18) 4.1.2 冷冻干燥工艺 (19) 4.2 无菌原料药工艺验证 (19) 4.2.1 验证批量 (19) 4.2.2 最差条件 (19)
1概述 无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料药，一般包括注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。从严格意义上讲，无菌药品应完全不含有任何活的微生物，但由于目前检验手段的局限性，绝对无菌的概念不能适用于对整批产品的无菌性评价，因此目前所使用的“无菌”概念，是概率意义上的“无菌”。一批药品的无菌特性只能通过该批药品中活微生物存在的概率低至某个可接受的水平，即无菌保证水平（Sterility Assurance Level, SAL）来表征。而这种概率意义上的无菌保证取决于合理且经过验证的灭菌工艺过程、良好的无菌保证体系以及生产过程中严格的GMP管理。 无菌药品通常的灭菌方式可分为：1）湿热灭菌；2）干热灭菌；3）辐射灭菌；4）气体灭菌；5）除菌过滤。按工艺的不同分为最终灭菌工艺（sterilizing process）和无菌生产工艺（aseptic processing）。其中最终灭菌工艺系指将完成最终密封的产品进行适当灭菌的工艺，由此生产的无菌制剂称为最终灭菌无菌药品，湿热灭菌和辐射灭菌均属于此X畴。无菌生产工艺系指在无菌环境条件下，通过无菌操作来生产无菌药品的方法，除菌过滤和无菌生产均属于无菌生产工艺。部分或全部工序采用无菌生产工艺的药品称为非最终灭菌无菌药品。基于无菌药品灭菌/除菌生产工艺的现状，本指导原则主要对在注射剂与无菌原料药的生产中比较常用的湿热灭菌与无菌生产工艺进行讨论。本指导原则中的湿热灭菌工艺验证主要包括灭菌条件的筛选和研究，湿热灭菌的物理确认，生物指示剂确认等内容；无菌生产工艺验证主要包括无菌分装、除菌过滤、培养基模拟灌装、过滤系统的验证等验证内容。 最终灭菌工艺和无菌生产工艺实现产品无菌的方法有本质上的差异，从而决定了由这两类工艺生产的产品应该达到的最低无菌保证水平的巨大差异。最终灭菌无菌产品的无菌保证水平为残存微生物污染概率≤10-6，非最终灭菌无菌产品的无菌保证水平至少应达到95%置信限下的污染概率<0.1%。由此可见，非最终灭菌无菌产品存在微生物污染的概率远远高于最终灭菌无菌产品，为尽量减少非最终灭菌无菌产品污染微生物的概率，鼓励企业在生产中采用隔离舱等先进技术设备。 基于质量源于设计的药品研发与质量控制的理念，为保证无菌药品的无菌保证水平符合要求，研发者在产品的研发过程中应根据药品的特性选择合适的灭
产品无菌方法验证 一、概述 1、简介 无菌检查法是指检查无菌药品、医疗器械等是否无菌的一种方法。无菌检查是在洁净度百级的单向流空气区域内进行，其全过程严格遵守无菌操作，防止微生物污染。本验证方案参考《中华人民共和国药典2010版二部》附录无菌检查法和GB/T19973.2-2005/ISO 11737-2:1998 医疗器械的灭菌微生物学方法第二部分：确认灭菌过程的无菌试验。二、验证目的 通过对无菌方法的培养基适用性检查、无菌检查方法的适用性检查，并且结果符合规定，证明培养基的适用性以及无菌检验方法的适用性，以达到用适合的方法对样品进行无菌检查的目的。 三、范围 本验证方案适用于X公司医疗器械无菌检查方法。本文件规定了无菌验证的程序、方法、标准和记录。 四、验证参考文件 五、验证人员及职责 1质量部QC：负责验证计划、方案起草、按监控计划执行，做好检验工作，并进行记录，出具报告。 2质量部：质量部经理负责验证方案的审核、记录的审核和报告的审核。按文件管理要求，作好验证方案文件的控制工作。 六、验证内容 1、验证试验项目
1.1 培养基的的适用性检查。 1.2方法适用性检查 2、验证实施步骤 2.1 所用培养基 胆盐硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基 2.2 培养基的配制 硫乙醇酸盐流体培养基：称取硫乙醇酸盐流体培养29.3g，加入蒸馏水或去离子水1L，煮沸至完全溶解，分装试管，121℃灭菌15min。 改良马丁：称取改良马丁28.5g加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热至完全溶解，分装试管，121℃灭菌30min。 2.3 菌悬液配制 所用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 铜绿假单胞菌CMCC(B)10104 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 生孢梭菌CMCC(B)64941 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 用无菌生理盐水将所用菌种稀释至30-100CFU/ml（2～8℃保存24h内使用）。 2.3 检验方法以及培养条件的选择 依据产品特点和标准推荐，优先选用直接浸泡于生长培养基（硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基）中，然后硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基分别在23～28℃和30～35℃培养14天，逐日观察，并记录结果。 2.4 培养基的适用性检查 2.4.1 培养基的无菌检查 硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基分别取5支，培养14天，应无菌生长。2.4.2 灵敏度检查 2.4.2.1 接种 取每管装量12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种作空白对照,培养3天；取每管装量9ml的改良马丁培养基5管，分别接种白色念珠菌、黑曲霉2支，另一支不接种作空白对照，培养5天。逐日观察结果。 2.4.2.2 结果判断 空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 2.5 无菌方法适用性检查 2.5.1 接种 取装量为25ml的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄的葡萄球
今日，国家药品监督管理局发布了《无菌工艺模拟试验指南（无菌制剂）》，作为实施《药品生产质量管理规范（2010年修订）》的指导性文件，指南计划于2018年10月1日生效。 指南全文如下： 无菌工艺模拟试验指南 （无菌制剂） 1. 目的 为指导和规范无菌制剂生产企业开展无菌工艺模拟试验，充分评价无菌制剂产品生产过程的无菌保障水平，确保无菌制剂的安全性，依据《药品生产质量管理规范（2010年修订）》及附录，制定本指南。 2. 定义 本指南所述的无菌工艺模拟试验，是指采用适当的培养基或其他介质，模拟制剂生产中无菌操作的全过程，评价该工艺无菌保障水平的一系列活动。 3. 范围 3.1本指南涵盖了无菌工艺模拟试验的基本要求、不同工艺模式的相应要求、试验的基本流程和结果评价等内容，适用于无菌制剂的无菌工艺验证。 3.2本指南所述条款是在现有无菌工艺技术基础上提出的相关要求，旨在规范企业开展无菌工艺模拟试验活动。在科学的基础上，鼓励新技术、新设备的引入，进一步提高无菌制剂的无菌保障水平。 4. 原则 在对无菌生产工艺充分认知和生产经验累积的基础上，应结合工艺、设备、人员和环境等要素定期开展无菌工艺模拟试验，以确认无菌生产过程的可靠性。开展无菌工艺模拟试验应遵循以下原则： 4.1对无菌生产过程实施风险评估，识别生产过程风险点。评估结果应在试验方案设计时给予考虑。 4.2应充分考虑硬件装备水平与无菌风险的关联性，结合无菌生产过程所涉及到的工艺、设备、人员以及操作时限等因素针对性开展模拟试验。尽可能模拟实际无菌生产全过程。应特别关注暴露操作、人工干预等高风险过程。采用良好设计
且受控的无菌灌装系统，特别是自动化的系统如吹灌封、隔离器等，污染率可大幅度降低。 4.3如在同一生产线生产不同剂型和容器规格的产品，应考虑模拟试验方案对各产品无菌工艺过程的适用性。应对有显著差异的无菌工艺过程开展模拟试验。采用风险评估的方式统筹考虑该生产线生产使用的容器类型、规格大小，产品类别，灌装速度、过程中断等环节，进行试验方案的设计。 5. 无菌制剂生产工艺及模拟范围 无菌生产工艺通常包含：经除菌过滤或其他方法获取无菌药液或无菌粉末，在无菌条件下进行液体灌装或粉末分装，容器密封。冻干制剂在液体灌装的基础上增加了冷冻干燥过程。 无菌工艺模拟试验应从无菌操作的第一步开始，直至无菌产品完全密封结束。如果在产品制备阶段采用了无菌工艺，此部分工艺也应作为模拟验证的一部分。对于全过程无菌生产（如配制后不能除菌过滤）的产品，无菌工艺模拟还应涵盖原液配制、半成品配制等无菌操作过程。企业应根据风险评估确定无菌工艺模拟试验的起始工序。 6. 模拟试验方案的设计及实施过程要求 模拟试验是一个系统性工程，通过模拟无菌生产工艺全过程，证实生产过程中无菌保障措施的有效性。应从以下几方面关注模拟试验的设计与实施： 6.1无菌工艺模拟试验的前提条件 在无菌工艺模拟试验之前应确认与无菌工艺相关的支持性系统和灭菌系统等验 证已完成，并达到了可接受的标准。 6.1.1 工艺设备、公用系统和辅助设施已按照预期完成了设计、安装、运行确认及与无菌生产有关的性能确认。 6.1.2 已对工艺设备、公用系统、辅助设施，如高压灭菌设备、配液罐、隧道烘箱等的灭菌方法完成了相应的验证。物料及厂房、设施所使用消毒剂及消毒方式完成了相关的验证。 6.1.3 药液及产品接触的气体、设备组件、容器、器具等灭菌工艺或除菌工艺的验证已经完成。 6.1.4 无菌生产区域的气流及环境达到了设计要求，并能稳定运行。但不得采用对环境或者器具进行过度灭菌或消毒的方式提高无菌保证水平。 6.1.5 根据无菌生产工艺要求建立了相关受控操作文件。
2015中考化学试题分类汇编——工艺流程题 1.（安徽）我国制碱工业先驱侯德榜发明了“侯氏制碱法”。其模拟流程如下： (1)反应①的化学方程式________________，反应②的基本反应类型为_______。 (2)工业上用分离液态空气 的方法制取氢气，属于_______变化（填“物理”或“化学”）。 (3)操作a 的名称是_____，实验室进行此操作所需的玻璃仪器有烧杯、玻璃棒、______。 (4)写出NH 4Cl 的一种用途________________。 （1）CaCO 3 =CaO+CO 2↑；分解反应。（2）物理；（3）过滤；漏斗。（4）做化肥或氮肥等。 2. （益阳）过氧化钙晶体﹝CaO 2·8H 2O ﹞较稳定，呈白色，微溶于水，广泛应用于环境杀菌、消毒。以贝壳为原料制备CaO 2流程如下： （1）气体X 是CO 2，其名称是 二氧化碳 ；将过氧化钙晶体与溶液分离的方法是 过滤 。 （2）反应Y 需控制温度在0~5℃，可将反应容器放在 冰水混合物 中，该反应是化合反应，反应产物是CaO 2·8H 2O ，请写出化学方程式CaO 2＋H 2O 2＋7H 2O ＝CaO 2·8H 2O 。获得的过氧化钙晶体中常含有Ca(OH)2杂质，原因是 CaO 或Ca(OH)2过量，且Ca(OH)2微溶 。 （3）CaO 2的相对分子质量为 72 ，过氧化钙晶体﹝CaO 2·8H 2O ﹞中H 、O 元素的质量比为 1∶10 。 （4）为测定制得的过氧化钙晶体中CaO 2·8H 2O 的质量分数，设计的实验如下：称取晶体样品50g ，加热到220℃充分反应（方程式为2CaO 2·8H 2O =====△2CaO ＋O 2↑＋16H 2O ↑，杂质不发生变化），测得生成氧气的质量为 3.2g ，请计算样品中CaO 2·8H 2O 的质量分数（CaO 2·8H 2O 相对分子质量为216），写出必要的计算过程。 解：设样品中CaO 2·8H 2O 的质量为x 2CaO 2·8H 2O =====△2CaO ＋O 2↑＋16H 2O ↑ 432 32 x 3.2 ∴x ＝43.2（g ） ∴ 样品中CaO 2·8H 2O 的质量分数为＝86.4% 答：样品中CaO 2·8H 2O 的质量分数为＝86.4% 3. （呼和浩特）空气中氮气的含量最多，氮气在高温、高能量条件下可与某些物质发生反应。下图是以空气和其他必要的原料合成氮肥(NH 4NO 3)的工业流程。请按要求回答下列问题： %10050 32.4
一次性使用无菌医疗器械无菌试验 方法验证方案 编制：日期： 审核：日期： 批准：日期：
1.验证目的 通过实验验证检测方法的适用性及培养基的适用性、无菌性、灵敏度。 2.样品信息 3.实验设备及器材 3.1使用仪器及器具：大试管、灭菌锅、洁净工作台、生物安全柜、电子天平、电热恒温培养箱、霉菌培养箱。 3.2使用材料及菌种：硫乙醇酸盐液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、生饱梭菌、白色念珠菌、大肠埃希菌。 4.验证组成员及职责 姓名部门职责 品质部组长：负责验证方案的审核、核准并负责验证报告的核准 品质部负责验证方案、验证报告的起草并组织实施 品质部负责验证过程中现场的监控及验证实施和试验过程的操作 5.验证依据 《中国药典》2015版和GB/14233.2-2005 6.验证步骤 6.1检测设备计量有效性验证 确认以下设备经过校量并在有效期内 设备名称是否校验是否在有效期内备注 灭菌锅 洁净工作台 生物安全柜 电子天平
电热恒温箱 霉菌培养箱 确认人/日期：审核/日期： 6.2培养基适用性检查 6.2.1无菌性检查：取每种每批培养基5支（瓶），培养14天，应无菌生长。检查结果见表1。 表1
6.2.2灵敏度检查 6.2.2.1菌液制备方法描述 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或者胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃-35℃培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或者沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20℃-25℃培养24-48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20℃-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.5%（ml/ml）聚山梨酯80无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2℃-8℃，可在24小时内使用。 6.2.2.2培养基接种 取每管将量为12ml的硫乙醇酸盐液体培养基7支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生饱梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。 6.2.2.3结果判断，空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该批培养基的灵敏度检查符合规定。 6.2.2.4试验结果见表2 表2 培养基试验液是否长菌菌生长情况培养条件判定 硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球 菌1ml 1. 30℃-35℃培 养3天 2. 铜绿假单胞菌 1ml 1. 2. 生饱杆菌1ml 1. 2. 空白对照 胰酪大豆胨枯草芽孢杆菌 1.20℃-25℃培
无菌原料药培养基模拟灌装试验 指南 （征求意见稿） 国家食品药品监督管理总局 食品药品审核查验中心
二〇一六年七月2
目 录 1 目的 (4) 2 定义 (4) 3 范围 (4) 4 总则 (4) 5无菌生产工艺 (5) 5.1无菌结晶工艺 (5) 5.2无菌冻干工艺 (5) 5.3无菌喷干工艺 (6) 5.4 无菌防护技术 (6) 6 模拟试验实施过程 (6) 6.1开展模拟试验的前提条件 (6) 6.2基于无菌风险的模拟试验方案设计 (7) 6.3模拟介质的选择与评价 (8) 6.4模拟介质的配制 (9) 6.5模拟介质的灭菌 (10) 6.6结晶工艺过程的模拟……………………………………………… <10> 6.7冻干工艺过程的模拟……………………………………………… <11> 6.8喷干工艺过程的模拟……………………………………………… <12>
6.9模拟灌装数量和持续时间………………………………………… <12> 6.10容器装量 (12) 6.11最差条件的选择 (12) 6.12 模拟试验过程的干预设计 (13) 6.13模拟试验过程的监测 (14) 6.14培养基的培养与观察 (14) 7 模拟试验可接受标准与结果评价 (15) 8 模拟试验失败后的调查与纠正措施 (15) 9 开展试验的周期与再验证 (15) 10 无菌模拟试验局限性 (16) 11 术语 (16) 12 参考文献 (17) 2
无菌原料药培养基模拟灌装试验指南 （征求意见稿20160725） 1 目的和依据 为指导和规范无菌原料药生产企业开展培养基模拟灌装试验，以充分评价无菌原料药生产过程的无菌保障水平，确保所生产无菌原料药的无菌安全性，依据《药品生产质量管理规范》（2010版）及附录，制定本指南。 2 定义 本指南所指的培养基模拟灌装试验是指采用无菌的培养基或其他介质，模拟原料药生产中无菌操作的全过程，以评价该无菌工艺无菌保证程度的一系列活动。 3范围 本指南涵盖了无菌原料药培养基模拟灌装试验的基本要求、不同工艺模式的特殊要求、试验的基本流程等内容，适用于无菌原料药的无菌工艺验证。 4 总体要求 为确保药品的无菌要求，在对无菌生产工艺充分认知和生产经验累积的基础上，应结合工艺、设备、人员和环境等要素定期开展培养基模拟灌装试验，以确认无菌生产过程的可靠性，同时也为企业及时识别风险进而改进无菌控制措施提供数据支持。开展培养基模拟灌装试验应遵循以下原则： 4.1 基于无菌工艺设计，对无菌生产过程实施风险评估，识别生产过程风险点以及现有控制措施的有效性，并在试验方案设计时给予考虑。 1
无菌检查方法的验证 无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法，是作为无菌产品批放行的重要依据及药监部门对无菌产品质量监管的一个重要项目。因此如何确保无菌检查方法的准确可靠至关重要，而检查方法的验证是保证检查结果的公正、科学和准确的基础，因此各个主要国家的GMP或药典都对无菌检查方法的验证提出了严格的要求，2010版中国药典对分析方法验证和检查的要求也有大幅度的提高，同时也是GMP检查中检查的重点和容易发现问题的区域。 验证要求与方法 无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。 前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。 再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。 通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。 这里，验证的重点环节包括： 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。 供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。 具体的验证方法如下： 菌种的选择 无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌[CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌[CMCC(F)98 003]代表霉菌。 菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，