蛋白免疫印迹（western blot）实验
实验步骤：
一、试剂准备
1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。【晶莱生物】
二、蛋白样品制备
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取
（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
（6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提前开离心机预冷）
（7）将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。
2.组织中总蛋白的提取
（1）将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
（3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
（4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm 离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。
3.加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按1操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
（1）将培养液倒至15 ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。
（2）弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5 min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
（3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml 离心管中并置于－20℃保存。
三、蛋白含量的测定
1.制作标准曲线
（1）从－20℃取出1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。
（2）取18个1.5 ml离心管，3个一组，分别标记为0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。
（3）按下表在各管中加入各种试剂。
（4）混匀后，室温放置2 min。在生物分光光度计（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。
2.检测样品蛋白含量
（1）取足量的1.5 ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 ml。室温放置30 min 后即可用于测蛋白。
（2）取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
（3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用无菌水洗一次。
（4）取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待测蛋白样品，混匀后静置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。
四、SDS－PAGE电泳
1.清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2. 灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
（4）按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
（5）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
（6）测完蛋白含量后，计算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5 ml 离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。）上样前要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。
（7）加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
3.电泳
电泳时间一般4～5 h，电压为40 V较好，也可用60 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
五、转膜
1. 转一张膜需准备6张7.0～8.3 cm的滤纸和1张7.3～8.6 cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）
5. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h。
6. 转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
六、免疫反应
1 . 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
2. 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5 ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。
3. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应。
七、化学发光，显影，定影
1. 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
2. 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1 cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1 min或5 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2 min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10 min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
八、凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
展开
注意事项：
1. 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2. 显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。
3. DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。
其他：
一、免疫反应
1. 用0.01 M PBS洗膜，5 min ×3次。
2. 加入包被液，平稳摇动，室温2 h。
3. 弃包被液，用0.01 M PBS洗膜，5 min×3次。
4. 加入一抗（按合适稀释比例用0.01 M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12 h以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
5. 弃一抗和1%BSA，用0.01 M PBS分别洗膜，5 min×4次。
6. 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01 M PBS稀释），平稳摇动，室温2 h。
7. 弃二抗，用0.01 M PBS洗膜，5 min×4次。
8. 加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
实验三：免疫印迹 1 原理 免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。 免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。 蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。 转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。 2 试剂与仪器 2.1 试剂（所有试剂均供两组用） 2.1.1 转移缓冲液 Tris 3.025g 甘氨酸14.413g 甲醇20mL 加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL 2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS) Tris 2.42g NaCl 27.750g
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被
课程名称：生物医学实验同组学生姓名：指导老师：应李强成绩： 实验名称：基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术实验类型：生物化学 一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填） 三、主要仪器设备（必填）四、操作方法和实验步骤 五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析（必填） 七、讨论、心得 一、实验原理 电泳是指带电颗粒在电场中的泳动。许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都含有可电离基团，在非等电点条件下带有电荷，在电场力的作用下，它们向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。 蛋白质印迹技术（western blotting） 又称免疫印迹技术和western印迹技术，是鉴别蛋白质的分子杂交技术 原理：将经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品转移到固相载体上。以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与对应的未标记的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应。经过底物显色、化学发光或放射自显影，检测特异基因表达的蛋白成分的存在和含量。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二抗标记物 常用的二抗标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等，辣根过氧化物酶最敏感的底物是3,3’-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位被反应转变成棕色沉淀。在钴或镍离子存在下进行反应可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。但是，使用辣根过氧化物酶不可能完全排除背景颜色，因此须十分小心地观察生色反应，一旦特异性染色蛋白带清晰可见，就应尽快终止生色反应。碱性磷酸酶可催化底物5一溴-4-氯-3-引哚磷酸／氮蓝四唑(BCIP／NBT)在原位转变为深蓝色化合物。这是利用二抗标记物进行的显色反应，是最早的Western Blotting检测方法，现在主要用于免疫组化，在显微镜下观察。该方法的灵敏度相对较低，可以检测ng水平的目标蛋白。 Western blotting 蛋白显影方法 1．增强化学发光法(ECL) ECL化学发光检测试剂是基于Luminol的新一代增强型化学发光底物试剂，它由辣根过氧化物酶（HRP）催化发生化学反应，发出荧光，结果可以通过X光片压片和其它显影技术展现，或使用Luminometer检测。溶液A主要成分为Luminol及特制发光增强剂，溶液B主要成分为H2O2及特殊稳定剂。 发光液A和B在HRP的催化作用下Luminol与H2O2反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在激发过程中不需要消耗HRP，HRP只是起催化作用，所以只要HRP没有降解失活，是可以重复加发光液的。ECL化学发光检测灵敏度较高，可以检测pg水平的目标蛋白。 Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类：主要是鲁米诺（luminol）及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。 在Ecl底物中，含有鲁米诺（溶液A）和H2O2 （溶液B），在HRP（辣根过氧化物酶）催化 剂的作用下，发出荧光来。HRP不消耗。
万方数据
万方数据
万方数据
蛋白质免疫印迹技术的实验研究 作者：张燕婉， 叶珏， 时那， 孟宪敏， 王来元， ZHANG Yan-wan， YE Jue， SHI Na， MENG Xian-min， WANG Lai-yuan 作者单位：中国医学科学院,阜外心血管病医院中心实验室,北京,100037 刊名： 实验技术与管理 英文刊名：EXPERIMENTAL TECHNOLOGY AND MANAGEMENT 年，卷(期)：2008,25(10) 被引用次数：21次 参考文献(9条) 1.郭尧君蛋白质电泳实验技术 2006 2.Nieman T Detection based on solution-phase chemiluminescence systems 1989 3.李晓军,秦浚川,武建国蛋白印迹技术研究进展[期刊论文]-临床检验杂志 2004(3) 4.Towbin H;Staehelin T;Gordon Electrophoretic franker of proreins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets.Procedure and some appHcations 1979(76) 5.Hauri H P;Bucher K Immunoblotting with monodonal antibodities:Importance of the blocking solution 1986(159) 6.高红,王贵新,王维林,张可仞用蛋白印迹技术初步评价肝母细胞瘤血管内皮生长因子表达的意义[期刊论文]-中华小儿外科杂志 2006(2) 7.Towbin H;Gordon J Immunoblotting and dot immunobinding:current status and outlook 1984(72) 8.Tovey ER;Baldo BA Characterisation of allergens by protein blotting 1987(08) 9.沈关心;龚非力抗体技术实验指南 2006 本文读者也读过(1条) 1.段勇.黄韬.袁育林.刘华.李娅.金克炜.DUAN Yong.HUANG Tao.YUAN Yulin.LIU Hua.LI Ya.JIN Kewei蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上皮钙粘蛋白的表达[期刊论文]-检验医学2009,24(1) 引证文献(7条) 1.秦双立,徐玥蛋白质印迹法在氟中毒研究中的应用[期刊论文]-山东化工 2015(13) 2.马瑛,马明,沈辉,骆新荣,高庆华不孕奶牛宫颈黏液相关ASA免疫印迹分析[期刊论文]-中国奶牛 2013(06) 3.程娜娜,韩榕He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管蛋白的影响[期刊论文]-激光生物学报 2013(04) 4.刘娇,华碧春,黄智锋蛋白表达检测技术在中药肝损伤机制研究中的应用进展[期刊论文]-浙江中医药大学学报2013(04) 5.韩继美胶体金免疫层析法对AFP、CEA和FN的快速检测[学位论文]硕士 2009 6.黄斌芳c-Jun基因启动子区的遗传变异与肺癌易感性的研究[学位论文]硕士 2012 7.程娜娜He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管结合蛋白MAP65-1的影响[学位论文]硕士 2014 引用本文格式：张燕婉.叶珏.时那.孟宪敏.王来元.ZHANG Yan-wan.YE Jue.SHI Na.MENG Xian-min.WANG Lai-yuan 蛋白质免疫印迹技术的实验研究[期刊论文]-实验技术与管理 2008(10)
Western blot实验报告 摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法 方法：western blot 结果：见后文 结论：western blot能很好地分离蛋白 关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白 Western blot test report Abstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transfer Results: see below Key words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。 免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。 蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。 1 试剂与仪器 1.1 试剂（所有试剂均供两组用） 1.1.1 8%电泳分离胶的配制 H2O 6.9ml
实验1：抗ANA自身抗体的检测（欧蒙斑点法） 一、实验目的及原理 抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是一组针对细胞核成分的自身抗体。ANA阳性提示患有自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病、干燥综合症、全身性硬皮病、原发性胆汁性肝硬化等。 根据细胞内各分子的理化特性和分布部位，ANA可分为抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体和抗其他细胞成分抗体。 在本实验中，抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒（欧蒙印迹法）的检测模条上平行包被了高度纯化的自身抗原。用于体外定性检测人血清或血浆中的抗nRNP/Sm、Sm、SS-A（天然SS-A和Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1)CENPB、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白和AMAM2共14种不同抗原IgG 类抗体。 欧蒙印迹法的实验原理如下：样本血清与包被抗原的检测膜条温育，如果标本为阳性血清，则血清中的自身抗体将与膜条相应位点上的自身抗原特异性结合。洗膜后添加碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗人IgG（二抗），将与结合在膜条相应抗原位点上的自身抗体（一抗）结合，形成抗原-1st Ab-2nd Ab复合物。最后，加入酶底物NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-磷酸盐）显色，阳性血清在对应膜条抗原条带处原位可形成蓝紫色的化合物沉淀。 二、实验材料 1.包被抗原的检测膜条 2.nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、PMScl、Jo-1、CENP B、PCNA 、dsDNA、 核小体、组蛋白、核糖体P蛋白 3.阳性对照：人IgG，100 倍浓缩，1x0.02ml 4.酶结合物：碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，10倍浓缩，1x3ml 5.样本缓冲液，直接使用，1x100ml 6.清洗缓冲液，10 倍浓缩，1x 50ml 7.底物液：NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-3-吲哚-磷酸盐），直接使用， 1×30ml
免疫印迹 免疫印迹 免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。 免疫印迹法的基本原理 将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下, 使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等, 对抗原固定化基质膜进行检测和分析。 免疫印迹法的基本步骤 免疫印迹法（以抗原分析为例）基本上可分为抗原分离、抗原印迹和抗原检定三个步骤。在每一步中因采用的具体实验方法不同, 可构成多种免疫印迹分析系统。 免疫印迹法的优点 免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术。它具有下列优点： 1、湿的固定化基质膜柔韧, 易于操作； 2 、固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近, 不会象凝胶那样受孔径阻隔； 3、免疫印迹分析只需少量试剂； 4、孵育、洗涤的时间明显减短； 5、可同时制作多个拷贝, 用于多种分析和鉴定； 6、结果以图谱形式可长期保存； 7、免疫探针可通过降低PH值等方法, 象抹去录音磁带一样将探针抹掉, 再换用第二探针进行分析检测。免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此, 它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。 免疫印迹 免疫印迹又常称Western blot，是一综合性的免疫学检测技术。它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。由于免疫学检测敏感性高，并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩，因此，Western blot的灵敏度特别高，可达到放射免疫的分析水平。而使用一般的免疫学检测技术（如ELISA、放射免疫沉淀）检测时，由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强，往往并不容易达到目的。而Western blot却没有这些缺点。因此，Western blot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质（抗原）的检测。也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量。
免疫实验—抗血清制备及抗体效价检测 摘要：用具有抗原性的物质牛血清白蛋白（BSA)注入到健康动物例如鼠、兔的 机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。抗血清，是指含有免疫蛋白的血清。抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。此次实验主要是进行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验（ELISA）对其进行抗体效价检测。 关键字：牛血清白蛋白（BSA) 抗血清抗体效价免疫 实验过程： 本次实验一共分为三个分实验： 实验一：免疫 实验二：抽血、放血，分离抗血清 实验三：ELISA测定抗体效价 实验一：免疫 一、抗血清制备的原理 用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。二、目的 制备高效价的抗血清 三、实验仪器、材料和试剂 实验仪器：1mL 注射器，酒精棉球，剪刀 材料：家兔，小鼠 试剂：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸，牛血清白蛋白（BSA) 三、方法和步骤 1、动物编号 左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。红色表示十位数,用黄色表示个位数。免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。
如下图所示抓取目标动物 家兔为300～600 μg/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20，20~40 μg / ml），每次不超过0.5mL。 小鼠腹腔注射 以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推 0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液， 为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。
蛋白免疫印迹（western blot）实验 实验步骤： 一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。【晶莱生物】 二、蛋白样品制备 1.单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提前开离心机预冷） （7）将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。BCA法。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。 (3)电泳
i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。 两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾 干。 ii.灌胶与上样 （1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 （操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。） （2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） （3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 （4）配4%的浓缩胶,加入TEMED（TEMED,中文名为四甲基乙二胺，是一种无色透明的液体，有微腥臭味，可以用于配制SDS-PAGE胶。TEMED可以催化APS产生自由基，从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合,可作为一种促凝剂使用）后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
免疫印迹（immunoblotting） 免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。 主要实验步骤如下： 1.蛋白质抽提 a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。 b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。 2.蛋白质定量： 按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。 3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE) 将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。 4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。 5.膜的封闭和抗体孵育 a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。 b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。 c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。 6.结果检测： 化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。 7.数据分析： 目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 8.实验报告，包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关图表。
寄生虫实验报告 篇一：寄生虫读书笔记实验报告 医学寄生虫学 读书笔记 实验报告 作者：周茜 学号：120505020 专业：中西医临床全科1班 读书笔记 章节一医学寄生虫学绪论医学寄生虫学包括医学蠕虫学、医学原虫学和医学节肢动物学3个部分。 第一节寄生虫生物学 1、生物伙伴关系根据其利害关系的不同，可分为：①共生②共栖③寄生 2、寄生虫与宿主：受益的一方称为寄生物，受到损害的一方称为宿主。 3、命名：寄生虫的命名按照生物进化规律和亲缘关系进行，其拉丁名由属名
和种名组成，属名在前，种名在后。 4、寄生虫有多种分类方式，按其与宿主的关系可分为： ①专性寄生虫②兼性 寄生虫③偶然寄生虫④机会致病寄生虫⑤体内寄生虫 ⑥体外寄生虫⑦长期性寄生虫⑧暂时性寄生虫 5、寄生虫由于长期过寄生生活，丧失了独立生活的能力，因而必须选择性地寄生于特定宿主，这种现象称为寄生虫的宿主特异性。根据寄生虫不同生长时期所寄生对象的不同，宿主可以分为：①终宿主②中间宿主③保虫宿主④转续宿主 6、寄生虫生活史：指寄生虫完成一代生长发育繁殖的全过程和必要的条件。 7、寄生虫繁殖方式包括有性繁殖和无性繁殖。 第二节寄生虫与宿主间的相互关系 1、寄生虫对宿主的致病作用：夺取营养、机械性损伤、毒性作用、免疫损伤 2、宿主对寄生虫的抗感染免疫包括固有免疫和适应性免疫。 （一）固有免疫：机体可以通过生理屏障抵御某些寄生
虫入侵，或者通过体内 的吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞、细胞因子和补体等机制对入侵的寄生虫发挥杀伤作用。 （二）适应性免疫：寄生虫感染的适应性免疫特点①寄生虫抗原复杂，成分 繁多，具有种、株、期的特异性；②感染形成的免疫力一般不完全也不持久；③适应性免疫应答机制复杂，参与的免疫效应产物有IgG、IgM、IgA、IgE（尤其是IgE）及细胞因子等；④ADCC效应的杀虫驱虫机制在抗寄生虫感染中的作用尤为重要；⑤超敏反应机制参与免疫应答过程。 寄生虫感染的适应性免疫应答①消除性免疫②非消除性免疫 寄生虫的免疫逃避现代研究表明寄生虫能有效地逃避宿主致死性攻击，从而在宿主体内存活，其机制可能与寄生虫的抗原变异、抗原伪装、抑制或直接破坏宿主的免疫应答、解剖位置的隔离等因素有关。 寄生虫感染引起的超敏反应日本血吸虫感染引起的尾蚴性皮炎主要为Ⅰ型速发型超敏反应；黑热病引起的贫血有Ⅱ型细胞毒型超敏反应机制参与；血吸虫病肾病为Ⅲ型免疫复合物超敏反应；血吸虫虫卵肉芽肿主
蛋白印迹实验报告 篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白 实验十二Western印迹鉴定目标蛋白 实验目的 1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法； 2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。 实验原理 Western印迹法简称蛋白质印迹法。蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位
素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。 试剂与器材 试剂 1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL； 2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中； 3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL； 洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20； 5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。 6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,
用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。高压灭菌20 分钟，室温保存。用前稀释至1x 。 7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。 器材 电泳装置一套; 2.电转移膜装置 3.抗体-酶反应摇床 操作方法 〈一〉电转移 1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。 2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。 3．剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号（2）。 4．按下图示制备“夹心饼”，打开电极板，在一边放上一块纤维垫，再依次往上叠加3-4张滤纸，将凝胶轻放于滤
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明 一、试剂和溶液 转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色 二、实验步骤 1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟； 2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿， 半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟； 3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带； 4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗 涤3 次； 5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h； 6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说 明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜； 7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min； 8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行 稀释）中，室温混摇2h； 9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min； 10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在
有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好； 11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝 光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干； 12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。
酶联免疫吸附测定蛋白浓度 作者姓名 （北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083） [摘要]酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ElISA）是目前常用的免疫学检测方法之一，它不仅可以检测抗体，还可以检测抗原。具有敏感性高、特异性强、方法简便、容易观察结果、便于大规模检测的特点，应用范围和程度可与放射免疫分析法相比拟。本实验研究酶联免疫吸附的测量准确度及线性，实验过程中应注意的问题及ELISA技术的应用实例及研究进展。 [关键词]酶联免疫吸附；HRP；分光光度法 酶联免疫吸附测定指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。基本原理是首先使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。然后使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。最后利用酶促反应产生的荧光产物测定吸光度值。利用洗涤的方法，固相载体上形成的抗原抗体复合物与初始加入的包被物浓度或者抗原抗体特异性有关，故最后结合在固相载体上的酶量与样品浓度成一定的比例。故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/mL。常见的ELISA方法有直接法，间接法，双抗夹心法，竞争法等，分别用于不同应用情形及检测需要。 80年代后，随着生物素-亲合素系统（BAS）作用被发现，这一亲和作用被结合应用到ELISA技术上，大大提高了后者反应的灵敏性与专一性。 同时，ELISA技术的研究进展还包括对灵敏度的提高。碱性礴酸酶(AP)一双底物系统并不直接催化有色物质生成，而是使NADP 脱磷酸，生成NAD，NAD进入由醇脱氢酶和黄递酶催化的氧化还原循环，导致深色物质生成。辣根过氧化物酶(HRP)一增强发光显示系统也在原先的方法上有所改进，用纳米金作为底物可使方法灵敏度高上百倍。 ELISA技术在医学中有广泛的应用，如肿瘤学，细菌学，病毒学的检测，在机理研究方面，免疫病理学，内分泌学，血液学的研究中都会用到ELISA技术检测特定分子的存在及含量差别。 1材料和方法 1.1 材料 鼠抗氯霉素（CAP）单克隆抗体。氯霉素-牛血清交联蛋白。牛奶样品。HRP-羊抗鼠Ig。 包被液：0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液（Na2CO3 0.159 克，NaHCO3 0.294克，蒸馏水稀释至100 mL）。 洗涤及稀释液：0.01mol/L pH7.4 PBST 溶液（NaCl8g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，1mL吐温20，0.5mL。蒸馏水加至1000mL）。
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册 蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A 蛋白样本提取制备 1 细胞或组织裂解 2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量 4 电泳上样样品的准备 B 电泳 1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳 C 转膜与显色（Western Blot） 1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜 3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色 D 常见问题分析与解决方案 附录1 WB实验试剂配制方法 附录2 SDS-PAGE胶的配制
WB概述: 检测原理:
A 蛋白样本提取制备 蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤， 总体原则和注意事项： 1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 （通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品） 2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择） 3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略） 5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 A-1 细胞或组织裂解 A-1-1 细胞裂解 裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择* 目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒 全细胞NP-40 or RIPA（附录1）全蛋白抽提试剂盒 细胞质（可溶蛋白）Tris-HCl（附录1）胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒 线粒体蛋白提取试剂盒 细胞质（细胞骨架等不溶蛋白）Tris-Triton（附录1）蛋白分级抽提试剂盒 细胞质（磷酸化蛋白）磷酸化蛋白抽提试剂盒 细胞膜NP-40 or RIPA（附录1）膜蛋白抽提试剂盒 蛋白分级抽提试剂盒 细胞核RIPA（附录1）核蛋白抽提试剂盒 线粒体RIPA（附录1）线粒体蛋白抽提试剂盒 亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法： 1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2） 2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask). 3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中， 44℃摇动30 min 54℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力） 6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀. A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解， 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80°C， 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组 织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml). 4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本， 弃沉淀,