1.1 MAC地址过滤
1.1.1 工作原理
交换机检查接收的数据帧，如果源MAC地址是被过滤的地址，则直接丢弃数据包。
1.1.2 配置命令
(config)#mac-address-table filtering mac-addr vlan vlan-id/*指定需要过滤的MAC地址
#show mac-address-table filtering /*查看过滤的MAC地址
1.1.3 网络拓扑图
1.1.4 测试方法
在S2126G上启用MAC地址过滤，过滤来自PC1的MAC地址：00-90-F5-21-82-4F。
期望目标：
过滤前，PC1可以ping通PC2。
过滤后，PC1不能ping通PC2。
1.1.5 测试结果
过滤前，PC1可以ping通PC2。
1
在S2126G上启用MAC地址过滤：
过滤后，PC1不能ping通PC2。
2
本文以大肠杆菌DH10B为例介绍外源基因在大肠杆菌中表达全过程 克隆步骤包括：模板制备（基因组DNA提取）-感受态细胞的制备-PCR-纯化回收-酶切-连接-转化-挑菌摇菌-质粒抽提-酶切鉴定-测序 1) 基因组DNA提取（以家蚕为例） 1. 取家蚕五龄后部丝腺约0.5g，于10ml匀浆器内，加2mlDNA抽提缓冲液，在 冰上充分研磨，转入5ml的离心管； 2. 加入RnaseA（10ul）至终浓度20ug/ml，37℃水浴1h； 3. 加入ProteinaseK（25ul）至终浓度100ug/ml，55℃水浴2h； 4. 分装到1.5ml eppendorff管，0.6ml/管； 5. 加入等体积的平衡酚（pH8.0），充分混匀，5000g，15min，取上清； 6. 重复5，再抽提1次； 7. 用等体积的酚/氯仿（1/1，v/v），氯仿各抽提1次 8. 将上清移入新离心管，加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），2倍体积的 无水乙醇，充分混匀，4℃过夜 9. 用牙签将絮状沉淀物挑出。用75%冰酒精洗涤3次，37℃控干； 10. 200μl 0.1 TE(pH8.0)溶解DNA； 11. 检测OD值； 12. 做好标记，以供进一步实验之用。 2) 感受态细胞的制备 1. -20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏（划板），37℃，8-12小时； 2. 用灭菌牙签挑取单菌落，放入3ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜； 3. 取100μl过夜培养物接种到另一3 ml LB培养基中，37℃振荡培养2～2.5 h， 使OD值在0.6左右（把握好浓度，OD值可以不用测）；将菌液分装到1.5ml EP 管中（在超净台完成） 4. 5000 g离心4 min收集菌体，将菌体重悬于800 μl 75 mmol/L冷CaCl2中， 冰浴30 min；（CaCl2要用高纯度的，切记！） 5. 4℃，5 000 g离心4 min，弃上清； 6. 加入200μl 75 mmol/L冷CaCl2，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放4 h 后用于转化，或加0.1倍体积甘油混匀，－70℃保存备用。可以保存至少6个月。 3) PCR 1、PCR反应体系： ddH2O 37.7 μL 10×PCR buffer 5 μL （25mM） dNTP 4 μL 引物1/2 1μL/1μL Taq酶 0.3μL 模板 1μL PCR反应体系总体积 50 μL 充分混匀，稍离心。 2、PCR反应条件
交换机转发过滤提高网络安全性能 当数据帧到达交换机接口时，交换机就将数据帧的目的地址与转发/过滤MAC数据库中的地址进行比较，如果目的硬件地址是已知的且已经在交换机的MAC数据库中，帧就只会被发送到正确的外出接口。交换机将不会把帧送往除了目的地接口之外的任何其他接口，这就保留了在其它网段上的带宽。这种技术就是交换机的转发过滤技术。 这种技术对于提高网络性能与网络安全很有作用。笔者将通过两个例子来谈谈这种技术对于交换式网络的重要意义。 案例一：利用二层交换机来隔离冲突域 如现在有一台交换机连着四台主机，分别为A、B、C、D。假设现在主机A要发一个数据包给主机D。当交换机收到主机A发过来的数据帧之后，该如何处理呢? 1、若交换机中没有主机A或者主机D的MAC地址信息 如果这个网络是刚刚组建，又或则出于某种原因，网络管理员把交换机重置后，则交换机的转发/过滤表会被清除。此时，由于主机A的MAC地址不在转发/过滤表中，所以，交换机会将主机A的MAC地址和端口添加到自己的MAC数据库中，然后再把帧转发到主机D中。但是，如果主机D的MAC地址不在交换机的MAC数据库中，则交换机会将帧转发到除了主机A连接的接口之外的其他所有接口中。也就是说，在交换机不知道目的主机MAC 地址的时候，则交换机上的除了本台设备之外的其他任何设备，如主机B、C、D都将收到主机A发出的数据包。很明显，此时交换机的一些带宽就会被浪费掉。在这种情形下，转发过滤技术并不能够带来多大的益处。 2、若交换机知道目的主机的MAC地址 假设交换机通过ARP等机制，在自己的MAC地址库中已经知道了所连接设备的MAC 地址，如主机A、B、C、D的MAC地址。要了解这些信息不难。只要这个网络存在一定时间，则通过地址学习功能，交换机可以记录相关设备的MAC地址信息。 在交换机已经了解了其相邻设备的MAC地址后，当交换机接收到主机A发过来的数据帧之后，会如何处理呢?交换机首先会读取数据帧中的目的MAC地址。然后在自己的MAC 地址库中进行查找。发现有匹配的MAC地址后，就从MAC地址库中查询中对应的交换机出口。然后再把数据帧从这个出口转发出去。从这个转发的过程中，我们可以看到数据帧是一进一出。而不像集线器一样，是一进多出;或者像上面提到的不知道目的MAC地址那样，也是一进多出。在这种情形下，交换机直接把数据帧准确无误的转发到对应的接口上。很明显，此时就不会对其他网段的带宽带来不利的影响。 通过这种转发过滤技术，就可以在最大限度内避免冲突域的产生，从而在很大程度上提高网络性能。 在利用二层交换机来隔离冲突域时，要注意一个问题。当交换机不知道目的MAC地址的话，则交换机并不能够起到隔离冲突域的作用。因为此时，交换机仍然会把数据帧转发到所有的交换机接口中。故当网络管理员利用交换机组建比较大型的网络时，不要频繁的重复启动交换机等网络设备。因为重新启动后，其MAC地址库中的内容可能会丢失。如此的话，交换机就又要重零开始学习MAC地址以及MAC地址与端口的对应表。 案例二：保护交换机端口的安全 在交换机管理中，还有一个难点就是如何防止非授权用户的主机介入到交换机的端口上? 也就是说，在一个角落中放置了一台交换机，其中可能还有一些空闲的端口。此时，如何来保障这些端口的安全性呢?是否所有人或者网络设备都可以随意的连接到这些空闲的端口呢?答案当然是否定的。接下去，笔者就谈谈如何来保护交换机端口的安全。这跟交换机的转发过滤决定也是息息相关的。 在思科的二层交换机中，提供了一些端口安全的保护机制。我们进入到某个交换机的接
笔记3（分子克隆2——主要步骤） 分子克隆可以分为以下几个步骤： 分离制备待克隆的DNA片段————将靶DNA片段与载体在体外进行连接————重组DNA分子转入宿主细胞————筛选、鉴定阳性重组子————重组子的扩增。 1.带有目的基因的DNA片段的获得： 可以用限制内切酶降解基因组DNA，再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段，可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的DNA片段，可以用mRNA做模板，用反转录酶合成互补DNA，即cDNA，也可以用化学合成的方法直接合成一段DNA。 2.重组DNA分子的构建： 重组DNA分子中包括两部分，一部分是外源DNA，即目的DNA片段，另一部分是载体DNA。用作载体的，有质粒、噬菌体或病毒DNA。它们的基本特征是能够独立复制。如果用同一种限制性内切酶切割这两种DNA，则它们的末端完全相同，由于有互补的单链末端序列存在，在连接酶的作用下，就可以形成重组DNA 分子。在没有互补单链末端的情况下，也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。
3.重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选： 重组DNA分子必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达．这个过程叫做转化。大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。除此以外．其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞，可以根据实验的需要加以选择。在被转化的宿主细胞中，不同的单个细胞(在平板上表现为单个菌落，亦称克隆)中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒，因此必须进行筛选，以便确定哪些是重组克隆。筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法，依载体的性质而定。 4.特定重组克隆的鉴别： 由于重组克隆往往是较多的，而在某一克隆实验中，我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进一步鉴别。使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。 此外，找出了目的克隆之后，还需要根据实验的目的，进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。主要有酶切图谱的制定，基因在DNA 片段上的精确定位，确定是否有内含子，DNA序列分析，离体翻译实验，外源基因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。
常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。
利用路由器MAC地址过滤限制局域网用户登录互联网 单位有四台电脑，通过路由器（型号TL-R402）进行连接，四台电脑可以互访也可以上外网，最近由于有得员工在上班时下载和看影视节目，严重影响了工作，为此领导要求将其中一台电脑可以连接外网接收文件，另外三台电脑限制其不能上外网，但四台电脑要可以互访。经试验用路由器的MAC地址过滤就可以轻松做到这一点。 1.首先，在浏览器地址栏中输入19 2.168.1.1回车，会出现路由器的登陆画面，输入路由器的账号与密码（默认是madin），登陆路由器界面， 2.选择安全设置—防火墙设置，勾选“开启防火墙”和“开启MAC地址过滤”，然后保存。 在开启MAC地址过滤当中有两个选项，为了以后其他电脑临时上网方便，这里选择了‘禁止已设MAC地址列表中已启用的MAC地址访问internet，允许其他MAC地址访问internet’，然后保存。当然为了进一步加强安全性也可以选择另外一项,那样的话只在路由器中开通了有效的MAC地址才能上外网。 3.然后点击‘MAC地址过滤’会出现以下界面（如图），如果以前没有设置过，那么列表会是空白的，
那样的话我们就要点击添加新条目，将受控的电脑MAC地址添加进去，并设置好名称便于以后管理。 4.如果我们需要电脑1—3不能上外网，那么就依次点击列表当中的“编辑”选项，将需要限制的电脑MAC地址一栏中的状态改为“生效”，这样这几台电脑就不能登陆外网了，如果要某一台电脑能上外网，将其MAC地址一栏中的状态改为“失效”即可，
设置完成后点击保存后退出，这样受限制的电脑就不能上网了。 注意记的将路由器的账户和密码改一下，毕竟默认的密码大家在网上搜索一下就知道。 高级点的路由器还可以利用bt迅雷下载限制和家长控制功能，使我们的上网环境更安全。 有的朋友问如何快速获得MAC地址？我们可以用命令行来查看，当电脑比较多时还是不太方便，这里给大家提供一个批处理文件，可以将它下载后存入U盘，插到需要查看MAC地址的电脑上运行一下，就会生成一个以本机电脑名称的文本文件，打开这个文件，本机的电脑名、IP地址、子网掩码等都保存在里面，其中Physical Address.后面的 ××—××—××—××—××—××就是本机的MAC地址，如果有双网卡或无线网卡。也会将它们记录在这个文本文件中的，方便吧。 下载MAC地址查 询.https://www.doczj.com/doc/2519273102.html,/attachment.php?aid=NjgyMDc3fDRhOWQ4MTZifDEyOTI3MzQ2OTZ 8OGI5MFZqRXQ1blpqdzhPaG5iQXBxVFdqOWtTV1ZNSmFMSHk1ai9kdFYyd2wrL2c%3D& request=yes&_f=.bat
分子克隆技术 一、填空题 1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。 2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前，要对载体进行去磷酸化处理，我 们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它 的目的是___________________________。 3.用α互补筛选转化子是，带有外源片段的菌落显___________________________色。 4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。 5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和 ___________________________。 6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、 ___________________________、___________________________、 ___________________________、___________________________。 二、简答题 1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。 2.为得到质量较好的水稻RNA，抽提前应做如何准备？RNA抽提过程中、RNA的 保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么？ 3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害，在操作放射性同位素 时，我们可以采取哪些措施进行防护？ 4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些？ 5.质粒抽提时用到的SolutionI，SolutionII，SolutionIII及异丙醇分别起什么作用？操 作时应注意什么？ 三、分析问答题 1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA 和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。 2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤？涉及到哪些工具酶？要获得 理想的结果，各步骤操作中应主要注意哪些事项？ 3.在Southern杂交实验中，同一根杂交管内的膜曝光的····（原卷此处不清晰）冲 洗后，有些组X光片信号很强，有些组信号很弱，有的样品点样孔附近有较强的 信号，但是有的地方信号较弱，请分析造成这种结果的可能原因。 4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR（反转录前没有对总RNA进 行去除DNA 的处理）试验的琼脂糖凝胶电泳图，凝胶上共点了6个样，PCR使用 的模板从左至右分别是：该组提取的水稻总DNA，该组提取的水稻总RNA，该组 的4个反转录产物。（原卷本题图不清晰） 请问： 提取的RNA的质量如何？ RT-PCR是否成功？为什么会出现这样的结果？ 有哪些地方需要改进？
交换机实现MAC地址表的绑定和过滤 结构图： 交换式使用2970，两台PC机同时只接一台到G0/2端口上 目的： 绑定配置后，在G0/2绑定PC1的端口，PC1只能接到G0/2才能工作，接其他的口都不能工作，PC2接该口或其他口自动工作 过滤配置后，PC1交换机任意口都不能工作，PC2接该口或其他口自动工作 1.配置绑定 switch(config)#int vlan 1 switch(config-if-vla1)#ip add 192.168.1.11 255.255.255.0 switch(config-if-vla1)#no shut 使用MAC地址表配置绑定 Switch(config)#mac-address-table static 00-04-61-7E-AD-9D vlan 1 interface GIgabitEthernet 0/2 验证测试： Switch#show mac-address-table All 0180.c200.0010 STATIC CPU All ffff.ffff.ffff STATIC CPU 1 0004.617e.ad9d STATIC Gi0/2 Total Mac Addresses for this criterion: 21
PC1接到G0/2端口可以PING通192.168.1.11 PC1接其他端口PING不通192.168.1.11 PC2接G0/2或其他端口都可以PING通192.168.1.11 将PC2网线接到G0/2接口上 能PING通vlan1 自动学习到MAC地址 Switch#show mac-address-table 1 0004.617e.ad9d STATIC Gi0/2 1 000a.e42c.0198 DYNAMIC Gi0/2 2配置MAC地址过滤 2970做不了过滤 switch(config)#mac-address-table blackhole address 00-04-61-7E-AD-9D vlan 1 Switch#show mac-address-table 无论PC1接到交换机哪个端口，都PING不通192.168.1.11 PC2接任意口都可以PING通
分子克隆技术步骤 在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA 片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖( 细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning) 含义指在生物体 外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。 将DNA 片段( 或基因)与载体DNA 分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA 和cDNA 克隆两类。 cDNA 克隆是以mRNA 为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA) ，再与载体DNA 分子连接引入寄主细胞。每一cDNA 反映一种mRNA 的结构，cDNA 克隆的分布也反映了mRNA 的分布。特点是：①有些生物，如RNA 病毒没有DNA ，只能用cDNA 克隆； ②cDNA 克隆易筛选，因为cDNA 库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA 克隆只含一个mRNA 的信息； ③cDNA 能在细菌中表达。cDNA 仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。 1. 方法： (1) DNA 片段的制备：常用以下方法获得DNA 片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA 切成一定大小的DNA 片段； ②用物理方法( 如超声波) 取得DNA 随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA 反转录产生cDNA 。 (2) 载体DNA 的选择： ①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA 呈环状，大小为1-200 千碱基对(kb) 。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA 可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb 以下的DNA 片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA 库和次级克隆。 ②噬菌体DNA ：常用的λ噬菌体的DNA 是双链，长约49kb，约含50 个基因，其中50% 的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA 两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA 库。 M13 噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有 F 基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF) 在 寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA 的M13 噬菌体，又能方便地制备单链DNA ，用于DNA 顺序分析、定点突变和核酸杂交。 ③拷斯(Cos) 质粒：是一类带有噬菌体DNA 粘性末端顺序的质粒DNA 分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb 的外源DNA 片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA ，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。 (3) DNA 片段与载体连接：DNA 分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA 片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA 可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA 往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA 片段可在某些DNA 连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA 片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。 连接反应需注意载体DNA 与DNA 片段的比率。以λ或Cos 质粒为载体时，形成线性多连体DNA 分子，载体与DNA 片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。 (4) 引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA 或噬菌体DNA(M13) 与氯化钙处 理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA 被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重
cisco交换机ip和mac地址绑定 虽然在TCP/IP网络中，计算机往往需要设置IP地址后才能通讯，然而，实际上计算机之间的通讯并不是通过IP地址，而是借助于网卡的MAC地址。IP地址只是被用于查询欲通讯的 目的计算机的MAC地址。 ARP协议是用来向对方的计算机、网络设备通知自己IP对应的MAC地址的。在计算机的 ARJ 缓存中包含一个或多个表，用于存储IP地址及其经过解析的以太网MAC地址。一台计算机与另一台IP地址的计算机通讯后，在ARP缓存中会保留相应的MAC地址。所以，下次和同一个IP地址的计算机通讯，将不再查询MAC地址，而是直接引用缓存中的MAC地址。 在交换式网络中，交换机也维护一张MAC地址表，并根据MAC地址，将数据发送至目的计算 机。 为什么要绑定MAC与IP 地址：IP地址的修改非常容易，而MAC地址存储在网卡的EEPROM 中，而且网卡的MAC地址是唯一确定的。因此，为了防止内部人员进行非法IP盗用(例如盗用权限更高人员的IP地址，以获得权限外的信息)，可以将内部网络的IP地址与MAC地址绑定，盗用者即使修改了IP地址，也因MAC地址不匹配而盗用失败:而且由于网卡MAC地址的唯一确定性，可以根据MAC地址查出使用该MAC地址的网卡，进而查出非法盗用者。 目前，很多单位的内部网络，都采用了MAC地址与IP地址的绑定技术。下面我们就针对Cisco 的交换机介绍一下IP和MAC绑定的设置方案。 在Cisco中有以下三种方案可供选择，方案1和方案2实现的功能是一样的，即在具体的交换机端口上绑定特定的主机的MAC地址（网卡硬件地址），方案3是在具体的交换机端口上同时绑定特定的主机的MAC地址（网卡硬件地址）和IP地址。 1.方案1——基于端口的MAC地址绑定 思科2950交换机为例，登录进入交换机，输入管理口令进入配置模式，敲入命令： Switch#config terminal ＃进入配置模式 Switch(config)# Interface fastethernet 0/1 ＃进入具体端口配置模式 Switch(config-if)#Switchport port-secruity ＃配置端口安全模式 Switch(config-if )switchport port-security mac-address MAC(主机的MAC地址) ＃配置该端口要绑定的主机的MAC地址 Switch(config-if )no switchport port-security mac-address MAC(主机的MAC地址) ＃删除绑定主机的MAC地址
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
端口内基于MAC地址过滤的ACL访问控制 2011-09-30 15:44:09 标签：端口安全休闲职场 上一次的工程实例我们解决了CISCO3550交换机的某个端口下面如果只连接了一台主机时的端口安全设置方法，即只有指定的主机才能访问网络，其它的主机(以MAC地址为唯一标识)是无法通过CISCO的这个端口访问网络，这种措施虽然有效，但是却有一定的局限性，具体表现为CISCO3550交换机的很多端口下面是连接有交换机，而且还是普通的二层交换机，这也就相当于一个端口下面有多台主机通过，针对这种情况如何实现只有指定的MAC 地址的主机才能通过呢，最初我们还是想通过端口安全的相关命令来实现，但是发现效果不理想，只是实现了限制连接主机数量的操作，如下所示： 一、限制连接主机的数量 我们通过一系列的实验终于得到了一个结论，即如果CISCO3550的端口下面连接了一台二层交换机，以前我们使用采用的端口安全措施就不怎么有效了，无法实现只有指定的主机的MAC地址才能通过，最多只能限制端口中通过的MAC地址数量的上限，比如我们最大允许5台主机通过CISCO3550交换机的第4端口，操作步骤如下： 3550#conf t Enter configuration commands one per line. End with CNTL/Z. 3550(config)#inter fa0/4 3550(config-if)#switchport port-security
3550(config-if)#switchport port-security maximum 5 查看端口4的当前配置如下 3550#show run inter fa0/4 Building configuration... Current configuration : 146 bytes ! interface FastEthernet0/4 switchport access vlan 66 switchport mode access switchport port-security switchport port-security maximum 5 end 这样的设置也是属于端口安全的一种，只不过以上的操作是通过限制通过的主机数量来保护端口的带宽，这在我们的工作实际中倒是也是这样的需要，比如我们开通了一个单位的互联网用户，采用包月制，这样就需要限制这个单位同时上网的主机数量，比如不能超过25台，就可以通过设置这样设置“maximum”的值为“25”来实现。这种措施是有效的，但是距离我们的要求还有一定的距离，我们还是想实现即使是CISCO3550端口下面连接了一台
分子克隆实验标准步骤 一、 常规分子克隆实验流程： 二、 分子克隆实验标准步骤（含实验编号）： 1. PCR 扩增目的基因（编号Clone SOP-1） 以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例 体系（50ul ）： 10×KOD buf 5ul dNTP(2mM) 5ul Mg 2+ 3ul Primer1 1ul Primer2 1ul Template50-200ng KOD0.5ul ddH 2O up to 50ul 程序： 95℃2min 98℃10s 58℃30s 35cycle 68℃2kb/min 68℃7min 12℃∞
2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2） 琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。 胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。 ③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀 的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。 3.试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3） 以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 ①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL， 12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） ②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中， 称取重量。 ③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN 溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。 注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA 的能力较强。 ④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑥重复操作步骤⑤。 ⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附 柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 ⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或 ddH2O，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。 4.酶切反应（编号Clone SOP-4） 以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例 双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）： 10×FastDigest? buffer or 10×FastDigest? Green buffer 5ul FastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ul FastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ul DNAN ddH2Oupto50ul 酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。 5.酶切产物的回收（编号Clone SOP-5） 以本实验室常用Axygen?AxyPrep?PCRClean-UpKit（Axygen）为例 ①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A
一、扩增 1、LB培养基5ml； 2、抗生素：1000X，即1:1000比例。种类根据细菌抗性决定； 3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中； 4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。 二、纯化质粒DNA 1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚； 2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。取三次； 3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min； 4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒； 5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)； *备注：S1：S2：S3=5:5:7 6、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液； 7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液； 8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。重复一遍； 9、空管离心12000xg，1min； 10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率） 四、跑胶回收：sost回收失败 1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。 插入：配胶方法 大块胶60ml；小块胶25ml； 需要配置大块胶、大孔胶； Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min； 趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml； 倒入槽里。 2、跑胶：单位厘米/5-10v。所以大槽25cm，150v即可。小槽100v即可。 3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）； 4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；
TPLINK路由无线MAC地址过滤设置 1.取得MAC的方法：WIN+R，输入CMD，用‘NBTSTAT-AIP’地址查看 2. 取得自己电脑IP与MAC的方法：WIN+R，输入CMD，用‘IPCONFIG/ALL’地址查看 无线MAC地址过滤功能通过MAC地址允许或拒绝无线客户端接入无线网络，有效控制无线客户端的接入权限。无线MAC过滤可以让无线网络获得较高的安全性。每一个网络设备，不论是有线网卡还是无线网卡，都有一个唯一的标识叫做MAC地址（媒体访问控制地址）。网卡的MAC地址可以用这个办法获得：打开命令行窗口，输入ipconfig /all，然后出现很多信息，其中物理地址（Physical Address）就是MAC地址。
得知无线网卡的MAC地址后，我们就可以在无线路由器中进行详细配置。由于我司11N 无线路由器和11G无线路由器在无线MAC地址过滤设置中有所区别，因此下面分别描述这两种情况。 一、11N无线路由器无线MAC地址过滤 由于无线MAC地址过滤配置较简单，因此我们以实例来进行说明。例：假如您希望MAC 地址为“00-21-27-B7-7E-15”的主机访问本无线网络以及希望禁止MAC地址为“00-0A-EB-0 0-07-5F”的主机访问无线网络，其他主机均不可以访问本无线网络，您可以按照以下步骤进行配置： 步骤1： 使用路由器管理地址登陆路由器管理界面，然后在“设置”菜单中选择“无线MAC地址过滤”选项，出现如下界面： 步骤2： 将过滤规则设为“禁止列表中生效规则之外的MAC地址访问本无线网络”。 步骤3：
点击“添加新条目”按钮，MAC地址为“00-21-27-B7-7E-15”，类型为“允许”，状态为“生效”的条目。为了方便管理，描述一项中可以添加说明。譬如该地址为张三的电脑，则可以在描述中填写“张三”。 步骤4： 同理，在第二个“添加新条目”中，添加MAC地址为“00-0A-EB-00-07-5F”，描述为“李四”，状态为“失效”的条目。 步骤5： 条目添加完成后，再启用MAC地址过滤功能。此时，无线MAC地址过滤设置中条目如下图：
配置MAC地址过滤（自治型AP） 【实验名称】 配置MAC地址过滤（自治型AP） 【实验目的】 掌握MAC地址过滤技术的原理及配置方法 【背景描述】 在会议室开机密会议的时候，公司不希望其他的人能够接入到会议室的无线网络中，因此网络 管理员建议可以在会议室的AP设备上启用MAC地址过滤技术，使得只有参与会议的人员才可以 接入到无线网络中，其他的人无法接入。 【需求分析】 需求：保证机密会议进行时，网络接入的安全性 分析：对于机密会议，不希望其他无关人员接入到会议室的无线网络中来，在无线设备上进行MAC地址过滤，可以严格控制接入的用户。 【实验拓扑】 【实验设备】 RG-WG54P 1台 RG-WG54U 2块 PC 2台 【预备知识】 无线局域网基本知识 【实验原理】 MAC地址，即网卡的物理地址，也称硬件地址或链路地址，这是网卡自身的惟一标识。通过 配置MAC地址过滤功能可以定义某些特定MAC地址的主机可以接入此无线网络，其他主机被拒 绝接入。从而达到访问控制的目的，避免非相关人员随意接入网络，窃取资源。 395
【实验步骤】 第一步：配置STA 1，与RG-WG54P相连接。 1、将STA1和RG-WG54P的供电模块的Network口通过直通线连接。 2、配置STA 1本地连接的TCP/IP设置；单击“确定”完成设置。 IP地址：192.168.1.10 子网掩码：255.255.255.0 默认网关：192.168.1.1 3、验证测试： 在STA 1命令行下输入“ipconfig”，察看本地连接的IP设置，配置如下： IP Address：192.168.1.10 Subnet Mask：255.255.255.0 Default Gateway：192.168.1.1 第二步：配置RG-WG54P，搭建基础结构（Infrastructure）模式无线网络 1、STA 1登陆RG-WG54P管理页面（http://192.168.1.1，默认密码：default）；396
分子克隆主要技术： （1）限制性内切酶酶切与连接 基因克隆也叫DNA分子克隆，即在体外重组DNA分子，而实现该技术的关键是一种被称作限制性核酸内切酶的工具酶。每一种限制性核酸内切酶可以识别DNA分子上特定的碱基序列，切断DNA分子。依据碱基互补的原理，在DNA连接酶的作用下可以把切开的DNA片段连接起来，因此可以把目的片段连接到合适的载体上形成重组子。 （2）转化与转染 作为表达载体，必须具有复制起始序列、多克隆位点及选择标记，可以在宿主细胞中进行自我复制或整合到宿主基因组中进行复制。作为宿主的工程菌或细胞在某些化学条件或物理刺激下会改变其细胞膜的通透性，从而易于将细胞表面附着的外源基因吸收到胞内，这一过程即转化（工程菌）或转染（细胞）。 利用选择标记可以很容易鉴别成功导入目的基因的工程菌或细胞，比如抗生素抗性筛选—凡是成功导入重组载体的工程菌或细胞均获得某种抗生素抗性，而未导入的工程菌或细胞则不能在含该抗生素的培养基中生长。 （3）聚合酶链式反应 聚合酶链式反应，即PCR。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃（具体退火温度根据引物的Tm值确定）左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。