微核试验
摘要：利用大蒜根尖细胞微核染色与计数技术测定不同浓度6价铬和1.2,4-三氯苯以及它们的不同浓度混合液对大蒜根尖分生区细胞微核率和细胞分裂各期的影响。以蒸馏水为对照组，设置的实验组为3组不同浓度的6价铬和三氯苯以及它们的混合液。用孚尔根染液法对不同试剂及各浓度的处理的根尖进行染色。在显微镜下观察各试剂各浓度处理下的微核率以及不同分裂期细胞的比例。
关键字：孚尔根染色法、微核、微核率、分裂期细胞
Abstract:Use of garlic root tip cell micronucleus dyeing and counting technology . Different concentrations of chromium 6 and 1,2, 4 - t hree hlorobenzene as well as their different concentration mixture to garlic root tip meristematic cells in the areas of micronucleus rate and the influence of each stage of cell division.With distilled water as control group, the group set up for the three groups of different concentrations of chromium 6 and 3 chlorobenzene and their https://www.doczj.com/doc/2314058667.html,efu's root dye solution for different reagent and the concentration of the treatment of root tip for dyeing. Under the microscope to observe the reagent concentration under the treatment of micronucleus rate and different proportion of split phase cells
Key Words：Fu's root staining method、micronucleus、Micronucleus rate、Split phase cells
一、研究的目的与意义：
1：知道微核产生的原理。
2：学会识别微核以及计算微核率。
3：学用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤。
4：了解不同化学试剂对细胞各个分裂期的影响。
由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。真核测试系统能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害。利用微核实验这种遗传毒性试验方法可以检测检测染色体或者有丝分裂器损伤，计数细胞的微核率。检测已存在或潜在的危害。
二、研究进展
微核( micronucleus, 简称MCN) , 是真核生物细胞中的一种异常结构, 是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。一般认为, 微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体片断产生的。在细胞有丝分裂时, 受到有害理化因子的损伤, 染
色体发生断裂, 在下一次分裂后期, 丧失着丝粒的染色体片断行动滞后, 不能进
入子细胞的主核, 形成滞留在核外的微小染色质块, 即微核。有些研究者认为, 微核可以是细胞凋亡的产物, 当致畸因素导致凋亡基因激活, 内切酶激活, 切割DNA, 形成细胞核碎片, 最终导致产生许多微核[1]。
微核试验广泛应用于药品、食品添加剂、农药、化妆品、工业化学品、环境污染物等遗传毒性的检测、安全性评价和遗传损害的监测, 为接触有害物质的人群提供遗传损害检测和工作环境监测, 为行政管理部门的决策、立法奠定理论依据。
污染物对人体或生物产生的损害可以方便快速地通过微核检测出来。蚕豆根尖微核技术作为水污染检测方法, 早在1988 年就被国家环保局批准, 由许多研究表明, 蚕豆根尖微核技术在检测流域或湖泊水污染方面, 有非常好的效果, 有关这方面的研究较多。
氯苯类化合物是一类普遍存在于环境中的有毒有机污染物, 由于其具有致突变、致癌、致畸特征及其在环境中残留持久, 美国国家环保局所列129种优先控制污染物中氯苯类化合物占25种之多[2]。以未经适当处理的废水、垃圾、废气和废渣排放是向环境释放氯苯类化合物的重要污染源.。我国该类化合物污染也相当严重, 在沈阳等大城市及其周边地区的土壤及地下水检测浓度均较高。农作物受到氯苯类化合物污染后, 不仅影响其产量和质量, 更为严重的是氯苯类化合物经食物链进入人体, 并在人体内富集, 危害人体健康。因此, 研究这些污染物对生态系统可能带来的负面影响及其机理具有重要的理论和现实意义。
研究表明,TCB是细胞膜上Ca2+ 通道的抑制剂, 通过降低细胞质中Ca2+浓度, 阻止微管蛋白聚合而抑制微管的装配, 从而损害纺锤体的形成和功能, 导致染色体被阻止而停留在该分裂时期, 或使染色体不分离而形成多倍化细胞。结果表明, 随TCB 浓度增加和处理时间延长, 蚕豆幼苗根长的生长及根尖细胞有丝分裂指数降低甚至停止。TCB 诱发蚕豆根尖细胞有丝分裂过程中染色体数目畸变和结构畸变[3]。
铬以Cr-2 到Cr+6等多种氧化态存在自然中，其中以三价和六价铬最稳定。铬的价态不一样，毒性也不一样。在一定的阈值内，三价铬是人和哺乳动物的必需元素，六价铬则有潜在的致癌性。由于铬的硬度大、抗腐蚀性能强，可与其他金属形成合金，因此，铬被广泛应用于国防、冶金、化学等行业。这些活动不可避免地导致大量含铬弃物排放，而这些废弃物主要是六价铬化合物，以铬酸根离子［（CrO4）2-］存在，严重污染水、大气和土壤。据不完全统计，国内受铬严重污的土壤已愈1250万ｔ。铬污染土壤具有隐蔽性、滞后性、累积性和不可逆转等特性。进入土壤的铬具有较高的生物有效性，易被植物根系吸收并积累在植物体内，对植物产生严重的生理毒害作用，不仅影响其生长和发育，可通过食链最终影响人类健康。因此，研究铬污染对生态系统可能带来的负面影响及其作用机制具有重要的理论和实际意义。研究表明低质量浓度Cr6+促进蚕豆种子萌发，而高质量浓度Cr6+有抑制作用，并且随处理时间的延长，其最适质量浓度降低。当Cr6+质量浓度≤100㎎/L时，随着质量浓度的增加和处理时间的延长，蚕豆根尖细胞微核率增加。当Cr6+质量浓度为200㎎/L，处理超过48h后，随着处理时间的延长，其微核率反而下降[4]。
本实验根据前人的实验经验为前提采用大蒜根尖代替蚕豆根尖作为微核试验的材料，研究了不同浓度的1,2,4-三氯苯这一典型氯苯类化合物和不同浓度重铬酸钾溶液以及重铬酸钾和1,2,4-三氯苯的联合作用对大蒜根尖细胞有丝分裂指数及染色体畸变率的影响,旨在探讨铬离子对植物体的细胞毒性和遗传。
三、研究内容与技术路线
3.1 研究内容：
通过观察不同浓度的1,2,4-三氯苯和铬以及它们的交互作用对大蒜根尖细胞微核率以及不同分裂期细胞的比例的影响，来判断其遗传毒性。
3.2 技术路线：
冷冻保存
大蒜根尖培养处理24h 剪根固定解离染色制片观察
孚尔根染液配制
四、实验方法
4.1实验材料
大蒜、甲醇、冰乙酸、碱性品红、偏重亚硫酸钠、比重1.18的浓盐酸、蒸馏水、酒精、重铬酸钾、氯苯、丙酮、显微镜、载玻片、盖玻片、定性滤纸、烧杯、100毫升容量瓶、200毫升容量瓶、镊子、刀片、纱布、青霉素小瓶、移液管、试管
4.2试剂准备：
1、1mol/LHCl：用10mL移液管量取8.69mL浓盐酸加入100mL容量瓶，用在蒸馏水定容至100mL。
2、50mg/L、100mg/L、150mg/L Gr6+：称取170mg重铬酸钾，加水溶解，在200mL容量瓶中定容，配制300mg/L的Gr6+母液，然后稀释到50mg/L、100mg/L、150mg/L
3、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L 1,2,4-三氯苯：称取将1,2,4-三氯苯用少量丙酮溶解，配制1000mg/L 1,2,4-三氯苯母液，然后将稀释到浓度30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L
4、卡诺式固定液：将甲醇：冰乙酸按3:1比例混合配制
5、Schiff氏试剂：称取0.5g碱性品红加入到100mL煮沸的蒸馏水中，时时振荡，继续煮5min，使碱性品红充分溶解。冷却致50℃，用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/LHCl，冷却致25℃，加入1.5g偏重亚硫酸钠，充分振荡，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h，用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封瓶塞，外包黑纸。贮存于冷暗处（4℃冰箱中）备用。
4.3实验过程：
4.3.1、材料准备：
将大蒜剥皮后放进垫了滤纸的培养基中，加入清水，放进25℃恒温培养箱中2~3天，催化大蒜生根。
选择根长0.5~1cm且不定根生长情况差不多的大蒜分为10组
4.3.2、Schiff氏试剂检验：
在大蒜生根之后，先选取一些根尖放进卡诺式固定液中固定3个小时，用Schiff氏试剂染色，镜检，观察染色体是否能染上色以及染色效果。若染色效果不行，则重新配制Schiff氏试剂，直至染色效果良好，然后将其贮存于4℃冰箱中准备使用。
4.3.3、大蒜根尖处理：
将分好组的大蒜分别用清水、50mg/L Gr6+、100mg/L Gr6+、150mg/L Gr6+、30 mg/L 1,2,4-三氯苯、40 mg/L 1,2,4-三氯苯、50 mg/L 1,2,4-三氯苯、浓度分别为50mg/L Gr6+和30 mg/L 1,2,4-三氯苯的混合液、100mg/L Gr6+和40 mg/L 1,2,4-三氯苯的混合液、150mg/L Gr6+和50 mg/L 1,2,4-三氯苯的混合液培养24小时。清水组为对照组。
4.3.4、固定：
在早上有丝分裂旺盛的时候，将处理过的大蒜根尖剪下，分别放入青霉素小瓶中，加入卡诺氏固定液固定3个小时，然后放入4℃冰箱内保存，以备使用。
4.3.5、解离：
取出部分经过固定的根尖先用酒精和清水洗涤，加入1mol/LHCl覆盖根尖，放入60摄氏度水浴锅内水浴加热7~10分钟，取出用清水洗涤3次，每次5分钟。
4.3.6、染色制片：
取出解离后的根尖，放在载玻片上，用刀片切下根尖乳白色的分生区部分，滴加1滴Schiff氏试剂染色10分钟，然后盖上盖玻片，吸干染液，并用镊子钝的一端在盖玻片上轻轻敲击，将细胞打散。
4.3.7、镜检:
将制备好的根尖放在显微镜下观察，统计微核数目、以及有丝分裂间期、前期、中期、后期、末期细胞数目并计算有丝分裂指数以及微核率。每组浓度细胞计数4000个。
微核识别标准：
（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。
（2）小核着色与主核相当或稍浅。
（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。
五、试验结果分析
赤道板偏移有丝分裂前期
微核核崩解
有丝分裂末期有丝分裂后期
双核有丝分裂中期
图5-1
5.1、Gr6+和1,2,4-三氯苯对大蒜根尖细胞有丝分裂的影响和微核率的影响
如图5-1所示，单独使用1,2,4-三氯苯处理大蒜根尖的实验组，有丝分裂指数先降低后增大，在浓度为40mg/L的时候达到最小值，可见，1,2,4-三氯苯对大蒜根尖分生细胞有丝分裂有着显著地影响，但是要受到1,2,4-三氯苯浓度的限制，浓度40mg/L的时候对有丝分裂指数的影响最大。同时，随着1,2,4-三氯苯浓度的增加，微核率逐步下降，浓度分别为30 mg/L、40mg/L、50mg/L的1,2,4-三氯苯处理过的微核率分别为0.2%、0.15%、0.12%，清水对照组的为0.078%，与清水对照组相比，经过1,2,4-三氯苯处理过的根尖的微核率有显著提高。
单独使用Gr6+处理打算根尖的实验组，，随着Gr6+浓度增加，细胞有丝分裂指数呈逐步递减状态，且在浓度为50mg/L的时候，细胞有丝分裂指数为最大值为0.16%，但是，与清水对照组0.36%的有丝分裂指数相比，大蒜根尖有丝分裂指数明显降低，意味着Gr6+能有效的抑制大蒜根尖细胞的有丝分裂。随着处理物质Gr6+浓度的增加，大蒜根尖细胞的微核率呈现增大再减小状态，在100mg/L的时候，微核率达到最大。浓度分别为50 mg/L、100mg/L、150mg/L的Gr6+处理过
Gr6+处理过的根尖的微核率有显著提高。
在Gr6+与1,2,4-三氯苯共同作用的实验组，随着Gr6+与1,2,4-三氯苯处理浓度的增加，微核率先增后减，在处理浓度为100mg/L Gr6+ 和40mg/L 1,2,4-三
氯苯的时候，微核率达到最大值，大蒜根尖分生细胞有丝分裂指数逐步下降，浓度为50mg/L Gr6+和30mg/L 1,2,4-三氯苯、100mg/L Gr6+ 和40mg/L 1,2,4-三氯苯150mg/L Gr6+ 和50mg/L 1,2,4-三氯苯处理的大蒜根尖有丝分裂指数为0.34%、0.12%、0.025%，微核率为0.17%、0.19%、0.1%。微核率提高，有丝分裂指数下降。
大蒜根尖经过1,2,4-三氯苯处理，在形成微核同时，存在很多双核细胞这表明，1,2,4-三氯苯可以破坏细胞有丝分裂纺锤题的形成，从而导致染色体畸变。经过Gr6+处理微核率，细胞有丝分裂遭到阻滞，细胞基本处于有丝分裂间期，分裂期的细胞很少，微核率提高，同时产生大量的双核细胞、核崩解细胞以及赤道板偏移等畸变，染色体畸变严重。
在Gr6+与1,2,4-三氯苯共同作用下，阻滞细胞有丝分裂的情况更加明显，与清水对照组相比，微核率也提高；与单独使用Gr6+处理相比，微核率降低；与单独使用1,2,4-三氯苯处理相比，微核率增加。表明对于阻滞大蒜根尖细胞有丝分裂，Gr6+和1,2,4-三氯苯有协同作用，对于细胞微核率，有相互抑制作用。
5.2、Gr6+和1,2,4-三氯苯对大蒜根尖细胞有丝分裂分裂周期的影响
12345678910
组别
图5-2
组别：1为清水，2、3、4分别为50、100、150mg/LGr6+，5、6、7分别为30、40、50mg/L1,2,4-三氯苯，8、9、10分别为Gr6+和1,2,4-三氯苯混合物
在经过24h处理之后，Gr6+组的细胞有丝分裂各期比例明显降低，1,2,4-三氯苯组分裂前期细胞比例基本不变，但是处于后、末期的细胞比例明显增大，分裂期中处于细胞后、末期时间延长。Gr6+和1,2,4-三氯苯混合浓度有丝分裂各期所占比例随着处理浓度的增加而递减，有丝分裂的阻滞作用越来越明显。
六、讨论
1、初步观察结果
经过初步观察统计，经1，2，4-三氯苯溶液处理过的根尖细胞，微核等染色体变异现象较少，且处于分裂期的细胞较少（与空白组比较）；Cr6+溶液处理过的根尖细胞，微核、双核、赤道板偏移等变异现象出现率均有所提高，但几乎找不到处于细胞分裂中期的细胞。
2、后面几组染色效果偏差：
在对根尖进行染色时，由于染色用的Schiff试剂已经配制了接近7天，染色能力可能有所下降，经染色的细胞核呈较淡的橘红色，并非明显的紫红色，染色的模糊可能会影响对高度螺旋的染色体的观察，导致观察Cr6+溶液处理的根尖细胞时，难以分辨出分裂期细胞，影响实验结果。还有一种情况就是解离过度，破坏了细胞结构，染色效果下降。
七、小结
两个星期的实验说长不长，说短不短，但却是我的大学学习中非常有意义的一次实验实践。通过大蒜根尖的培养、染毒、解离、染色、显微镜观察等一系列实验步骤，我掌握熟练了大蒜根尖的诱导培养方法、电子天平的使用和一些操作技巧、孚尔根染液的配制、大蒜根尖的解离制片的方法、显微镜的操作技巧以及相关软件的使用等一系列实验技巧。此外在师兄师姐的帮助指导下学会了pH计、分光光度计、浊度计等实验仪器的使用方法。
八、心得体会
两个星期的起早摸黑，我们付出的不过是少睡几个懒觉，晚点吃饭，但在这期间我们收获的却是比这些付出更有价值有意义的实验经验和心得体会。我认为此次实验的目的不在于实验结果，而在你是否认真亲自动手，在于自身在实验期间所掌握的实验技巧以及实验期间的点滴体会。
我的第一个体会便是关于实验器材的整理保管问题。我在此次创新实验之前除了课程所要求的实验外，基本没接触过其他的实验，更没有跟老师做项目的经验。所以对实验室非常的陌生，以至于在实验刚开始时连简单的实验器材都找不到更别说做实验了，最后还是老师帮我们订购了才得以继续实验。其实想想也是
实验室就那么大，一二十个人在做实验，你自己的实验器材不保管好别人就会拿去用，几经转手之后，你自己想做实验的时候反而找不着了。这样不仅实验效率低，还浪费钱，浪费时间。我想这是老师给我们上的第一节课吧。自己的实验器材不用的时候要清洗好，贴好标签，保管好。我想这样不仅能提高实验器材的使用寿命，还能提高实验的效率以及实验结果的精确度。
我的第二点体会是实验是一项耐心活，细心活。实验溶液的配置是实验的基础，实验溶液的好坏直接影响到实验结果，而溶液的配备并非把几种试剂混合在一起拌匀了那么简单。在配置孚尔根染液的过程中，由于盐酸浓度的计算错误，我们配置出来的孚尔根染液很刺鼻，染色效果不是很好。但我们并没有因此而将就使用，而是经过一次次计算后，再耐心的重配，前后共重配了4次，每配一次就会要一个下午的时间。但我觉得这都不算什么，实验就是一个不断探索的过程，哪
怕是在一件很小的事上。实验是需要耐心和细心的，这是一个合格的实验者的必备品质。
参考文献：
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植物染色体制片与观察实验报告（洋葱组） 姓名：蔡梦雅 1230170010 同组成员：曹鉴云陈锦容刘艳马彦霞 一、中文摘要：染色体（Chromosome），是细胞内具有遗传性质的物体，易被碱性染料染成深色，又叫染色质。其本质是脱氧核甘酸，是细胞核内由核蛋白组成、能用碱性染料染色、有结构的线状体，是遗传物质基因的载体。这里我们用洋葱染色体作为代表使用压片法制片并且进行观察。 二、关键词：染色体洋葱压片法 三、引言：洋葱（onion）是百合科（Liliaceae）葱属中以肉质鳞片和鳞芽构成鳞芽的2年生草本植物，其学名为Allium cepa L，染色体数为2n=2x=16。由表1和图1可见,洋葱的8对染色体中,有7对(第1~7对)染色体,臂比在1·01~1·70之间,为中部着丝点染色体,1对(第8对),臂比为4·74,为近端部着丝点且带随体的染色体;依据STEB-BINS[4]的核型分类标准,洋葱的染色体核型在遗传进化上属较古老的2A型。100多年来有关染色体与染色体组结构功能的研究一直是生命科学最活跃的研究领域之一，现今人们完成基因组测序后回到对染色体上进行基因定位和作图，因此有关染色体的研究在基因组合功能基因组时代都有重要意义，陈瑞阳教授历时25年的研究完成的《中国主要植物染色体研究》对我国2834种植物染色体数目进行了报道，完成了1045种植物的核型分析，积累了宝贵的染色体基础数据创建了我国植物染色体研究信息平台。研究染色体进化与生物进化的有不可分割的关系,国际对染色体的化学成分,DNA含量,碱基组成和以染色体数目、形态、结构、大小等为特征的核型进化与物种形成和演化关系的研究,为揭示生物进化趋势提供染色体方面的科学资料，总的来说对染色体的研究在各类学科领域内都有着重要的意义。国内外对洋葱的研究主要在其成分和药用方面，在细胞遗传上张自力和陈瑞阳等对洋葱的C带显示法进行过研究，田秋元等对洋葱的核型分析及有关制片方法进行了探讨。植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞核染色体。我们设计了不同的实验方案探究如何制作优良的植物染色体玻片，掌握染色体技术。 四、材料与方法： 1.取材 洋葱（Aillum cepa）的鳞茎 2.实验器具和药品 2.1器具 a.载玻片 b.盖玻片 c.烧杯 d.量筒 e.培养皿 f.滤纸 g.玻璃棒 h.镊子i.手术刀 2.2药品 a.0.1mol/L醋酸钠溶液 b.0.25%秋水仙素 c.冰醋酸 d.无水乙醇 e.1mol/LHcl f.纤维素酶 g.果胶酶 h.卡宝品红 2.3试剂配制 卡诺固定液：用3份无水酒精，加入1份冰醋酸（现配现用）。 酸解液：一份无水乙醇与一份1mol/L 盐酸1:1进行配制。 酶解液：用0.4g的纤维素酶和0.15g的果胶酶溶解在20ml蒸馏水里。
外源化学物：指存在于人类生活的外界环境中，可能与机体接触并进入机体，在体内呈现一定生物学作用的一些化学物质。 内源化学物：指机体内原已存在的和代谢过程中形成的产物或中间产物。 食品毒理学：是借用毒理学的基本原理和方法，研究食品中外源化学物的性质、来源与形成，以及它们的不良作用和可能的有益作用的机制，并确定这些物质的安全限量和评定食品安全性的一门科学。 毒物：指在一定条件下，较小剂量即能够对机体产生损害作用或使机体出现异常反应的外源化学物。 毒性：指外源化学物质与机体接触或者进入机体内的易感部位后，能引起损害作用的相对能力，包括一般性的损害及致畸、致突变和致癌的能力等。 毒效应谱：指机体接触外源化学物后，根据外源化学物的性质和剂量，可引起多种变化。 靶器官：指化学物质被吸收后可随血流分布到全身各个组织器官，但直接发挥作用的部位往往只限于一个或多个组织器官，该类组织器官称为靶器官。 生物学标志：指针对通过生物学屏障进入组织或体液的化学物质及其代谢产物，以及它们所引起的生物学效应而采用的检测指标。 接触生物学标志：对各种组织、体液或排泄物中存在的化学物质及其代谢产物，或它们与内源性物质作用的反应产物的测定值。 效应生物学标志：可以测出机体生理、生化、行为等方面的异常或病理组织学方面的改变，反映与不同靶剂量的化学物质或其代谢产物有关的健康有害效应的信息。 易感性生物学标志：反映机体对化学物质毒作用敏感程度的指标。 量反应：指反应属于计量资料，有强度和性质的差别，可用某种测量数值表示。 质反应：指反应属于计数资料，没有强度的差别，不能以具体数值表示，而只能以阴性或阳性、有或无表示。 剂量—量反应关系：表示化学物质的剂量与个体中发生的量反应强度之间的关系。 剂量—质反应关系：表示化学物质的剂量与某一群体中质反应发生率之间的关系。
洋葱根尖染色体有丝分裂观察与多倍体诱导 一、实验目的 1、掌握洋葱培养的方法，掌握利用秋水仙素诱导植物多倍体的方法。 2、掌握洋葱根尖制片的方法，复习染色、压片的基本操作。 3、通过对于有丝分裂相的观察，统计洋葱染色体数目，加深对于细胞有丝分裂过程的理解。 4、对比进行多倍体诱导前后的洋葱根尖，理解四倍体与二倍体的区别。 二、实验原理 （一）有丝分裂 完整的有丝分裂相包括G1期（合成前期）、S期（合成期）、G2期（合成后期）和M期（分裂期），其中G1期、S期和G2期合称间期，细胞完成DNA的复制以及有丝分裂的准备，而M期又可以分为前期、中期、后期和末期，为了形态 观察的方便，本实验采用后一种分法。 观察有丝分裂，重点在于观察 染色体的形态。在细胞分裂前期，细 胞核解体，染色质凝聚显现出染色体 的形态；在前中期，染色体散乱地分 布于细胞的中部；在中期，纺锤体形 成，染色体受到微管的牵引，着丝粒 成行排列于赤道板上；在后期，染色 体受到动粒微管的牵引，向细胞两级 运动；在末期，染色体重新解螺旋， 细胞核重新形成。 （二）洋葱的根尖 洋葱根尖的整体结构如右图，其中只有分生区的初生分生组织由于细胞始终处于持久而强烈的有丝分裂之中而作为我们的观察对象，其余部分在制片时都应当尽量剔除来保证观察效果。 （三）多倍体的诱导 多倍体的诱导使用秋水仙素，秋水仙素可以阻止微管蛋白的聚合，从而使有丝分裂中期纺锤体不能正常形成，但是姐妹染色单体照常想成，只是没有被拉向两级，于是染色体数目加倍。 （四）各步骤的作用 1.固定液可以迅速杀死细胞，保持细胞形态在有丝分裂相。 2.解离可以破坏细胞的胞间层（果胶），使细胞之间的联系变 松散，有利于压片和染色。
食品毒理学实验指导 食品毒理学实验 （一）毒理学实验的目的和要求 食品毒理学实验的目的是通过实验掌握有关的毒理学实验技术和方法，培养分析问题和解决问题的能力。 为了提高实验效率，特作如下要求： １．课前预习实验指导，对实验目的、方法、步骤应有充分了解，明确本次实验的目的和理论根据，作到心中有数，避免实验中出现忙乱和差错。 ２．进入实验室后，首先检查实验桌面上的仪器、器皿、药品等实验器材是否齐全及有无损坏。 ３．实验时务必安静，不能喧哗，作到整齐整洁，有条有理。严格按照实验指导的步骤进行操作，准确计算用药量，注意爱护实验动物，节约实验材料和药品。 ４．仔细阅读实验指导，根据实验指导进行小组分工，尽可能每人都有操作机会。 ５．及时地、准确地将观察到的数据和反应如实记录。实验完毕，根据实验结果写出实验报告。 ６．实验后整理实验器材，作好实验室的清洁卫生工作。 实验室规则 １．实验室须保持安静、整齐和清洁。 ２．实验完毕将实验台、桌、仪器、用具等擦洗干净。仪器、用具如有损坏，应报告老师，各组轮流打扫实验室。关好门窗，切断水源及电源。 ３．节约实验用品，爱护器材及动物。 ４．随时注意安全操作。 实验一、食品毒理学实验基础 常用实验动物的捉取方法 小鼠：用右手提起尾部，放在鼠笼盖上或其他粗糙面上，向后上方轻拉，此时小鼠前肢紧紧抓住粗糙表面，迅速用左手拇指和食指捏住小鼠颈部皮肤并以小指和手掌尺侧夹持其尾根部固定手中。 兔：捉拿时一手抓其颈背部皮肤，轻轻将兔提起，另手托其臀部。 二、实验动物的选择毒理学中研究外源化学物的基础毒性主要是进行体内试验，常选用大白鼠和小白鼠、家兔。根据不同实验目的，可选用不同实验动物。例如，皮肤刺激实验，可选用家兔，因为家兔为皮肤刺激实验的敏感动物。 动物应注明来源及品系。除特殊要求外，动物年龄一般选用初成年者：大白鼠、小白鼠为出生后2～3个月左右，体重分别为180～240g和18～24g；家兔为2～2.5kg，猫为1.5～2kg；狗为出生后一年左右。实验中一般均应采用两种性别动物进行试验。所用动物进入实验室后，于实验开始前应观察一周以上，以删除不健康的动物，并使实验动物适应环境。 三、染毒途径和方式 1、经口染毒 ①灌胃灌胃体积依所用实验动物而定，小鼠一次灌胃体积在0.1～0.5ml/kg体重，大鼠在1.0ml/100g体重之内，家兔在5ml/kg体重。 ②喂饲喂饲方法染毒是将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中，使动物自行
保健食品批文转让相关流程资料 一、技术转让必备条件 1、前提条件：受让方是否有卫生许可证和保健食品GMP证书？相应剂型的生产线是否通过认证？如未GMP证，可选择以下方式合作： 1）可选择转让至有资质的企业。 二、技术转让中上报省局客户所需提交的资料 （一）保健食品技术转让产品注册申请表。 （二）身份证、营业执照或者其它机构合法登记证明文件的复印件。 （三）经公证机关公证的转让方和受让方双方签订的有效转让合同。 （四） 省级保健食品生产监督管理部门出具的受让方的保健食品卫生许可证复印件。 （五） 省级保健食品生产监督管理部门出具的受让方符合《保健食品良好生产规范》的证明文件。（六） 保健食品批准证明文件原件 （包括保健食品批准证书及其附件和保健食品变更批件）。 （七）受让方生产的连续三个批号的样品，其数量为检验所需量三倍。 1、胶囊、片剂为每批 10000粒以上，需3批样品。 2、茶剂、颗粒剂为每批5000袋以上，需3批样品。 3、口服液为每批内容液体10升以上，需3批样品。 三、技术转让申请的流程 双方签订合同－－合同公证 ―― 生产三批样品 ―― 整理资料报省局 ―― 当地疾 控中心或药检所复核检验 ―― 保国家局 ―― 行政审批 领取新的批文 四、技术转让的周期 双方商定确定合同， 合同公证 生产样品， 对样品进行自检 省局发出补充 信息通知（5日内）
省局发出受理意见书（5日内） 省局发出检验通知书（10日内） 省局指定的检验机构对样品进行检验（30日内） 国家药监局审查（20日） 制作证书，发证。 五、技术转让中签订合同所需的资料 一、申报资料及补充资料一套，内容如下： （一）国产保健食品注册申请表。 （二） 产品配方及配方依据； 原料和辅料的来源及使用依据 （卫食健字产品不用提供）； （三）功效成份、含量及功效成份的检验方法。 （四）生产工艺及简图，工艺说明、相关研究资料。 （五）产品质量标准（企业标准）及编制说明。 (六)产品设计包装（含产品标签）、产品说明书样稿 （七）可能有助于产品评审的其它资料。 (八)补充资料 注：以上资料如有电子版，请一并提交 （九）检验机构出具的检验报告。 1、卫生学 稳定性实验的报告及其申请表 2、毒理学实验报告及其申请表 3、功能学实验报告及其申请表 4、人体试食实验报告及其申请表 注：以上资料如无原件复印件需清晰 二、转让标的的国产保健食品批准证书原件及其附件，如有变更，提供变更批件的原件。 六、技术转让中办理公证所需的资料 (一) 技术转让合同 (二) 双方营业执照原件 (三) 批准证书原件 (四) 双方法人身份证原件及复印件 (五) 双方法人。如不能到场，可委托他人并出具委托书 (有的公证处委托书需要在当地公证）。 (六) 公章 注：以上为必须 (七) 双方公司章程加盖公章
剂量－效应关系：表示化学物质的剂量与个体中发生的量反应强度之间的关系。曲线基本类型是S形曲线。剂量-反应关系：表示化学物质的剂量与某一群体中质反应发生率之间的关系。替代法又称“3R”法：优化试验方法和技术，减少受试动物的数量和痛苦，取代整体动物实验的方法。 毒效应谱：①机体对外源化学物的负荷增加；②意义不明的生理和生化改变；③亚临床改变；④临床中毒；⑤甚至死亡。毒作用的类型：①速发性或迟发性作用； ②局部或全身作用；③可逆或不可逆作用；④超敏反应⑤特异质反应。 急性毒作用带：为半数致死剂量与急性阈剂量的比值，表示为：Zac=LD50/Limac。Zac值小，说明化学物质从产生轻微损害到导致急性死亡的剂量范围窄，引起死亡的危险性大；反之，则说明引起死亡的危险性小。 慢性毒作用带：为急性阈剂量与慢性阈剂量的比值，表示为：Zch= Limac /Limch。Zch值大，说明Limac 与Limch之间的剂量范围大，由极轻微的毒效应到较为明显的中毒表现之间发生发展的过程较为隐匿，易被忽视，故发生慢性中毒的危险性大；反之，则说明发生慢性中毒的危险性小。 选择性毒性：水平：可发生在物种之间、个体内（易感器官为靶器官）和群体内（易感人群为高危人群三个水平。原因：①物种和细胞学差异；②不同生物或组织器官对化学物质生物转化过程的差异；③不同组织器官对化学物质亲和力的差异；④不同组织器官对化学物质所致损害的修复能力的差异。 毒性和毒效应的区别：毒性是化学物固有的生物学性质，我们不能改变化学物的毒性。毒效应是化学物毒性在某些条件下引起机体健康有害作用的表现，改变条件就可能影响毒效应。 ADME过程：吸收：是外源化学物从机体的接触部位透过生物膜屏障进入血液的过程。分布：是指外源化学物吸收后随血液或淋巴液分散到全身组织器官的过程。代谢。排泄：外源性化学物及代谢产物由机体向外转运的过程，是机体中物质代谢过程中最后一个重要环节。 毒理学研究方法的优缺点：①流行病学研究：优：真实的暴露条件；在各化学物之间发生相互作用；测定在人群的作用；表示全部的人敏感性。缺：耗资、耗时多；无健康保护；难以确定暴露，有混杂暴露问题；可检测的危险性增加必需达到2倍以上；测定指标较粗。②受控的临床研究：优：规定的限定暴露条件；在人群中测定反应；对某组人群(如哮喘)的研究是有力的；能测定效应的强度。缺：耗资多；较低浓度和较短时间的暴露；限于较少量的人群(一般＜50)；限于暂时、微小、可逆的效应；一般不适于研究最敏感的人群。③体内试验：优：易于控制暴露条件；能测定多种效应；能评价宿主持征的作用；能评价机制。缺：动物暴露与人暴露相关的不确定性；受控的饲养条件与人的实际情况不一致；暴露的浓度和时间的模式显著地不同于人群的暴露。④体外试验：优：影响因素少，易于控制；可进行某些深入的研究；人力物力花费较少。缺：不能全面反映毒作用，不能作为毒性评价和危险性评价的最后依据；难以观察慢性毒作用。 药物引起呼吸系统毒性的机制并举例：吗啡：引起呼吸中枢抑制；箭毒生物碱：引起呼吸肌麻痹；呋喃妥因：介导的氧化损伤；多柔比星：细胞毒药物对肺泡的直接损害；胺碘酮：细胞内磷脂的沉积；紫杉醇：介导P物质的释放；环磷酰胺：致癌变作用。 常用的致突变试验：细菌回复突变试验（Ames试验）、微核试验、染色体畸变分析、姐妹染色单体交换试验SCE、果蝇伴性隐性致死试验、显性致死试验、程序外DNA合成试验、单细胞凝胶电泳试验。
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素）DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45μm滤膜 灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 （SiO 2 -SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时 夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化 硅（SiO 2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、SiO 2 -SS-HA、DOX， 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维 细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、 SiO 2 -SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO 2-SS-HA/DOX、SiO 2 、HA、DOX药物载 体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。 ②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口
观察洋葱表皮细胞的生物实验报告 一观察洋葱表皮细胞 实验目的：通过观察洋葱表皮细胞，说明植物体是由细胞组成的实验材料：：显微镜、洋葱、镊子、滴管、水、载玻片、针、盖玻片、吸水纸、纱布。实验步骤： （一)制做临时装片。 （1）用纱布将载玻片、盖玻片擦干净。（2）用液管在载玻片上滴一滴清水。 （3）用镊子在洋葱鳞片叶上撕下一小片表皮。 （4）将撕下的表皮放入载玻片上的水滴中，用针将其展开。 （5）用镊子夹住盖玻片，先将一边接触载玻片的水滴边经再慢慢把盖玻片放平，制成临时切片。 （4）在盖玻片的翼侧滴加稀碘液，用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本的全部。 （二）安装临时装片：将临时切片放到显微镜上，调整显微镜与临时切片位置，直到可以观察到清晰的图像为止实验图像： 200 倍800倍 实验结论：洋葱表皮是由无数细胞构成的，有明显的细胞核，细胞壁，细胞质出现。 二．观察人的口腔上皮细胞的实验教案
1、学习要求： 1.制作和观察人的口腔上皮细胞临时装片。 2.认识人的口腔上皮细胞的基本结构。 2、材料用具： 生理盐水，稀碘液，消毒牙签，滴管，纱布，镊子，吸水纸，载玻片，盖玻片，显微镜。 3、实验方法和步骤： 1.用洁净的纱布将载玻片和盖玻片擦拭干。 2.在载玻片中央滴一滴生理盐水。 3.用消毒牙签在口腔内侧壁轻刮几下放在生理盐水中。 4.用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上的水滴，再将盖玻片缓缓放平盖在水滴。 5.在盖玻片的一侧滴加几滴稀碘液，用吸水纸在盖玻片的另一侧吸引，使碘液浸润标本的全部。四、总结步骤： 擦-→滴-→取-→盖-→染-→吸五、绘制人的口腔上皮细胞 三．测定某种食物中的能量 实验目标一颗花生种子含有多少能量？ 实验器材或药品水 实验探究过程现象 分析及结论 1、在锥形瓶中装30ml水 实验前水温：2、把花生固定在解剖20℃、20℃、24℃
大蒜根尖染色体实验报告 一、 实验目的与实验要求 1、掌握洋葱培养的方法，掌握利用秋水仙素诱导植物多倍体的方法。 2、掌握洋葱根尖制片的方法，复习染色、压片的基本操作。 3、通过对于有丝分裂相的观察，统计洋葱染色体数目，加深对于细胞有丝分裂过程的理解。 4、对比进行多倍体诱导前后的洋葱根尖，理解四倍体与二倍体的区别，认识微核和植物细胞分裂期的各形态特征。 5、体验开放式实验教学，培养生物实验意识，提高学习的主动性、获取实验知识的能力和撰写实验报告水平。 二、 实验方案 1、实验仪器 显微镜、载玻片、盖玻片、试管、烧杯、小塑料管、滤纸、刀片、解剖针、滤纸等 2、实验药品 新鲜、健康的洋葱鳞茎一个；0.02%秋水仙素、1mol/L HCl、醋酸洋红染液、卡诺氏固定液，碱性品红、乙酸，乙醇等。 3、实验原理 (1 洋葱的根尖 洋葱根尖的整体结构如右图，其中只有分生区的初生分生组织由于细胞始终处于持久而强烈的有丝分裂之中而作为我们的观察对象，其余部分在制片时都应当尽量剔除来保证观察效果。 (2 多倍体的诱导
多倍体的诱导使用秋水仙素，秋水仙素可以阻止微管蛋白的聚合，从而使有丝分裂中期纺锤体不能正常形成，但是姐妹染色单体照常想成，只是没有被拉向两级，于是染色体数目加倍。 各步骤的作用：固定液可以迅速杀死细胞，保持细胞形态在有丝分裂相。解离可以破坏细胞的胞间层（果胶），使细胞之间的联系变松散，有利于压片和染色。漂洗可以洗去过量的盐酸，防止解离过度 破坏细胞结构或影响染色效果（盐酸是酸性，而醋酸洋红是碱性染料）。 (3 有丝分裂 完整的有丝分裂相包括G1期（合成前期）、S 期（合成期）、G2期（合成后期）和M 期（分裂期），其中G1期、S 期和G2期合称间期，细胞完成DNA 的复制以及有丝分裂的准备，而M 期又可以分为前期、中期、后期和末期，为了形态观察的方便，本实验采用后一种分法。如表一。 表一植物有丝分裂各时期特点 4、实验步骤 (1 将大蒜剥皮后放进垫了滤纸的培养基中，加入清水，放进25℃恒温
87 BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITRO The following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalia n cell cultures followi ng con tact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or in direct patie nt con tact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specime n cannot be determ in ed, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to preve nt con tam in ati on with microorga nisms and other foreign matter. Three tests are described (i.e., the Agar Diffusi on Test , the Direct Con tact Test and the Elution Test ).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its inten ded use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; con tact ing media; in ks; adhesives; absorptio n, adsorptio n, and permeability of preservatives; and con diti ons of storage. Evaluatio n of such factors should be made by appropriate additi onal specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its in ten ded use. Materials that fail the in vitro tests are can didates for the in vivo tests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88 . USP R EFERENCE S TANDARDS 11 —USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS. Cell Culture Preparation —Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells in serum-suppleme nted minimum esse ntial medium hav ing a seedi ng den sity of about 10 5 cells per mL. Incubate the cultures at 37 1 一in a h±midified
大蒜根尖多倍体诱导与染色体观察 实验目的： 1、了解利用秋水仙素诱导植物多倍体的方法。 2、掌握大蒜根尖制片的方法。 3、通过对玻片的观察，统计染色体数目。 4、对比不同的大蒜根尖染色体数目，理解二倍体和四倍体的区别。 实验原理： 1.有丝分裂 完整的有丝分裂相包括G1期（合成前期）、S期（合成期）、G2期（合成后期）和M期（分裂期），其中G1期、S期和G2期合称间期，细胞完成DNA的复制以及有丝分裂的准备，而M期又可以分为前期、中期、后期和末期，为了形态观察的方便，本实验采用后一种分法。观察有丝分裂，重点在于观察染色体的形态。在细胞分裂前期，细胞核解体，染色质凝聚显现出染色体的形态；在前中期，染色体散乱地分布于细胞的中部；在中期，纺锤体形成，染色体受到微管的牵引，着丝粒成行排列于赤道板上；在后期，染色体受到动粒微管的牵引，向细胞两级运动；在末期，染色体重新解螺旋，细胞核重新形成。细胞染色体过程示意图见图1. 图1：细胞有丝分裂过程示意图 2.大蒜的根尖 大蒜根尖的整体结构如图2，其中只有分生区的初生分生组织由于细胞始终
处于持久而强烈的有丝分裂之中而作为我们的观察对象，其余部分在制片时都应当尽量剔除来保证观察效果。
图2：大蒜根尖结构示意图 3.多倍体诱导 秋水仙素易溶于冷水、不易溶于热水、有毒、针状结晶或淡黄色粉末，是诱导多倍体的一种常用试剂，其是从百合科植物秋水仙的鳞茎和种子中提取出来的一种生物碱。它的作用机理是与微管蛋白单体结合，抑制微管的形成，进一步抑制纺锤体的形成，使染色单体分离受阻，形成同源多倍体。因此，秋水仙素作用于正在分裂的细胞，如生长点才能产生作用，诱导多倍体的形成。秋水仙素诱导多倍体在蔬菜和观赏植物的应用非常广泛，但是在大蒜方面的报道却很少。 图3：秋水仙素的化学结构式 实验器材： 实验材料：经秋水仙素处理过的大蒜根。（秋水仙素溶液配制取秋水仙素1g（先用少量95%乙醇助溶），溶于250～500ml蒸馏水中，配成浓度为0.2～0.4%的溶液，冰箱中保存。将大蒜架在盛水的烧杯中进行水培。待根尖长到1cm时，将大蒜盛在0.4%秋水仙素溶液的瓶盖或小烧杯上，避光处理24小时，然后再水培24小时加倍后根尖很肥大。）
毒理学实验报告思考题习题答案汇总 作者：南无宝宝 实验一 1、简述常用实验动物的种类 1.科研人员用的：小白鼠、狗、兔子 2.学校教学用的：青蛙（人工繁殖的）、鱼、蚯蚓 2、选择实验动物的原则 1.根据实验的要求而选择不同的实验动物 2.选用动物的数量必须符合统计学上预计数字的需要。 3.根据实验的性质也可选不同品系的动物：其目的在于使动物试验结果有规律性、重复性和可比性。 4.由于同一种实验动物存在着个体差异，还应注意个体的选择：（1）年龄：一般均选用成年动物来进行实验。动物年龄常按其体重来估计，选用的动物体重大体上小白鼠20～30g、豚鼠500g左右、家兔2kg左右医学教|育网搜集整理。 （2）性别：在实验研究中，动物如无特殊需要，一般宜选用雌雄各半。 （3）生理状态：实验动物应证明确实健康外，雌性动物若处于怀孕、授乳期不宜采用。 3、把12只动物随机平分成三组。详细叙述分组过程
2．将实验单位随机分成三组设有动物15只，随机等分成A、B、C三组。将动物编号后，按上述方法，从随机数字表抄录15个数字，将各数一律以3除之，并以余数1、2、3代表A、B、C，结果归入A 组的动物6只，归入B组的动物4只，归入C组的动物5只，即： 动物号码１２３４５６７８９ １ ０１ １ １ ２ １ ３ １ ４ １ ５ 随机数目 １ ８６ ２ ４ ０ １ ９ １ ２ ４ ０ ８ ３ ９ ５ ３ ４ １ ９ ４ ４ ９ １ ６ ９ ０ ３ ３ ０ 除了后的 余数 ３２１１３１２２１１２１３３３归组ＣＢＡＡＣＡＢＢＡＡＢＡＣＣＣ要使三组的动物数相等，须把原归A组的6只动物中的1只改配到B组去。可以随机数字表继续按斜角线抄录一个数字，得60，以6除之，除尽（相当于余数为6），就可以把第六个A（即12号）动物改为B组。调整后各组的动物编号如下： Ａ组：３４６９１０ Ｂ组：２７８１１１２ Ｃ组：１５１３１４１５ 4、绘图，任选三个两位数字编号并画出它在小白鼠身上的染色法标记。
细胞毒性实验设计方案 1. 准备材料：DMEM高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素)DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4% 多聚甲醛指甲油6 孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45 pm滤膜 灭菌：50mL , 10mL 5mL离心管两种枪头 2. 实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 (SiO^SS-HA/DOX ,在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX 的细胞毒性。实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX空白对照组为纯细胞。培养基中含有10%(v/v) FBS和1%(w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SQ2-SS-HA/DOX SiO2、HA DOX药物载体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型： 培养基的配置：双抗1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37°C温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，力卩5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。(每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。) ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL冻存于-20 C，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%勺酒精放入超净台。
第五章第二节细胞第二课时制作临时装片，观察细胞金必行 一、教材分析 通过上节课的显微镜练习，学生已初步学会使用显微镜。这节课要求学生自己制作临时装片，寻找植物细胞和动物细胞，获得有关细胞的感性认识，从而更好地从细胞这个微观角度去认识生物的结构和功能。洋葱表皮细胞较易做成功，学生在实验中将会体验到成功的快乐。临时装片制作是〈科学〉课程标准中技能的要求，在教学中教师应严格要求学生遵守操作规范。此实验是初中生物实验的一个重要实验。 二、教学目标 1、练习使用显微镜 2、初步学会制作临时装片 3、能绘制简单的生物图 4、识别动物细胞和植物细胞 5、培养学生的观察能力和动手操作能力 三、教学重点 1、装片制作，寻找细胞 四、教学难点 1、装片制作，寻找细胞，边观察边绘制细胞图 五、引入 同学们上节课我们已初步学会显微镜的使用，这节课我们将真正尝试 做一位科学家，我们将亲自做装片，寻找植物细胞和动物细胞，看它们到底长得怎样？当然你要看到它们，你必须认真仔细地听老师的讲解。 六、教学过程 1、取镜、安放、对光 2、制作洋葱表皮细胞临时装片 （1）用洁净的沙布把载玻片和盖玻片擦干净（手要拿住玻片边缘，盖玻片很薄，注意不要弄碎） （2）把载玻片放在实验台上，用吸管在载玻片上滴一滴清水 （3）用刀切开鳞茎，使成小块，在鳞茎的凹面用刀浅切3—5mm见方，然后用镊子撕取薄膜。薄膜要薄，最好是一层细胞。 （4）把薄膜浸入水滴中，要尽量展平 （5）用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上的水滴，然后轻轻地把它盖在薄膜上（这一步很重要，尽量不要留气泡，气 泡在显微镜下有黑而粗的边缘，呈园形，里面往往是一片空白。 使气泡消除的方法是用吸水纸从盖玻片的一侧吸引，一侧加清 水） （6）用低倍物镜找到观察。并上下左右移动装片。填书本空格。 （7）染色：拿下玻片，在盖玻片的一侧滴碘液，另一侧用吸水纸吸，使染液浸润到薄膜的全部。在低倍物镜下观察。
食品中铅测定的试验设计 铅是一种毒性很强的重金属，不是人体必需的微量元素，食品中铅主要来源于原料污染和生产工艺、容器、包装、储存和运输等环节的污染，被世界卫生组织列为食品污染物加以控制。人体摄入0.04g的铅就会引起急性中毒，铅中毒具有蓄积性、持久性和不可逆性。因此，加强食品检测防止铅中毒非常重要，而使用快速、灵敏、准确的测定方法测定食品中铅显得十分必要。 1.铅的理化性质及对人体健康的影响 1.1铅的理化性质 铅是一种重金属元素，化学符号为Pb,原子序数为82，熔点327.502℃，沸 点1740℃，密度11.3437g/cm 3 ，莫氏硬度1.5，很柔软，金属铅有良好的展性， 能压成薄片，但没有延性，不能拉成丝。不与水作用，与盐酸反应时，生成溶解度小的氯化铅覆盖在铅的表面，使反应终止。与硫酸的作用和盐酸相似。能溶于 浓热的硫酸中，生成可溶性的硫酸氢铅；溶于稀硝酸，生成硝酸铅[1] ，故测定 铅含量时常配制成硝酸铅溶液。铅为重金属，可导致蛋白质性，对人体有毒。 1.2铅在人体内分布及对人体健康的影响 人体吸收的铅大部分来自食物，少部分来自污染的空气，铅通过肠道和呼吸道吸收入人体后，随血流分布到全身各器官和组织，血液中的铅部分通过肾脏由尿液排出体外，部分从大便排出，部分储存在骨骼里。人体内的铅95％以上都以不溶性磷酸盐形式沉积在骨骼中，而且很难出来再回到血液，骨骼中的铅的半衰期约为20～30年，这部分铅对人体来说相对安全。少部分储存在肝、肾、肌肉和 中枢神经系统[2] 。急性铅中毒比较少见，其毒性主要是由于铅在人体蓄积所造 成的神经性和血液性中毒[2] 。铅的毒性机理主要是对蛋白质及酶中的半胱氨酸 残基的反应。铅慢性中毒对人体危害分为三个阶段：（1）低血色素贫血导致溶血和红细胞寿命缩短，还会出现无相关的行为异常或组织功能障碍（包括消化、免疫等）；（2）中枢神经系统失调，并诱发多发性神经炎。表现为机能亢进，冲动行为、知觉紊乱和学习能力下降。在许多严重的病例中，症状包括坐立不安、易怒、头痛、肌肉震颤、运动失调和记忆力丧失；（3）肾衰竭、痉挛、昏迷甚 至死亡。对婴幼儿、儿童及孕妇的伤害尤为明显[3] 。
细胞毒性实验方案 Prepared on 22 November 2020
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素） DAPIMTT(5mg/mL)DMSOPBS4%多聚甲醛指甲油6孔培养板96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL)一包μm滤膜 灭菌：50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10%(v/v)FBS和1%(w/v)双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO2-SS-HA/DOX、SiO2、HA、DOX药物载体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗1%血清12%DMEM87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代：
一、名词解释 1、原癌基因：调控细胞生长和增殖的正常细胞基因，突变后转 化称为致癌的癌基因。 2、化学致癌：由外源化学物引起正常细胞发生恶性转化并发展 成肿瘤的过程。 3、生殖毒性：外源化学物对雄性和雌性生殖功能或能力以及对 后代产生的不良效应。 4、性腺毒性：外源性化学物质对性腺的损害作用 5、食品毒理学：是研究食品中外源性化学物的性质、来源与形 成以及它们的不良作用与可能的有益作用和机制，并确定这些物质的安全限量和评定食品安全性的一门科学。 6、毒物：在一定条件下，以较小剂量进入生物体后，能与生物 体之间发生化学作用并导致生物体器官组织功能和（或）形态结构损害性变化的化学物质。 7、毒性：外源性化学物质与机体接触或进入体内的易感部位后， 能引起损害作用的相对能力，包括一般性的损害、正在发育胎儿的损害（致畸胎）、遗传密码改变（致突变）、引发癌症（致癌性）的能 力等。 8、生物转运：化学毒物在体内的吸收、分布和排泄过程称为生 物转运。 9、生物转化：指外源化学物在机体内经过多种酶催化的代谢转化。
10、被动转运：外源性化学物质在体内由高浓度想低浓度自动转 运的过程。 11、主动转运：在载体和ATP的参与下，外源性化学物质体被有选择行的被运输的过程 12、首过效应（first pass effect）：未被代谢的化学物原形和代谢产物，不经体循环就被肝脏代谢和排泄的现象。 13、血脑屏障：指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑 细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障。 14、胎盘屏障：由位于母体血液循环系统和胚胎之间的几层细胞 构成，是胎儿胎盘与母体胎盘之间的屏障。 15、生物半衰期：进入机体的外来化学物由体内消除一半所需 的时间称为生物半衰期。 16、肠肝循环：化学毒物及其代谢物由胆汁进入肠道。一部分可 以随粪便排出，一部分由于肠液或者细菌的酶催化，增加其脂溶性而被肠道重吸收，重新返回肝脏，形成肝肠循环。 17、绝对致死量或浓度：指能引起一群机体全部死亡的最低剂量（浓度）。 18、半数致死量或浓度：在急性毒性实验中能引起一群个体50%死亡所需的剂量（浓度），也称致死中量。 19、最小致死剂量或浓度（MLD,LD01）：指一组受试实验动物中，通过实验和观察仅引起个别动物死亡的最小剂量或浓度。
MTT法测细胞毒性 试剂 MTT溶液四甲基偶氮唑盐（MTT）溶于PH7.2的磷酸盐缓冲液中，浓度为5mg/ml，除菌后2ml分装，于4℃避光保存。 含10%SDS的0.01M HCl SDS 10g 浓HCl（36%）86.2 ul 定容至100ml，过滤除菌 方法 1.将SP2/0细胞计数，调节细胞数至105/ml，制备10ml细胞悬液，加入96孔 板，100ul/孔，即细胞数104/孔。空白孔不加细胞悬液。 ,37℃条件下培养24小时。 2.5%CO 2 3.每孔加入用含5%血清的DMEM 10倍系列稀释的毒素100ul。阴性对照孔不 加毒素。 ,37℃条件下培养72小时。 4.5%CO 2 5.吸除药液120 ul, 每孔加入新鲜配制的MTT溶液20ul,即终浓度为1mg/ml， 37℃条件下培养4小时。 6.吸去上清50 ul，每孔加入150 ul含10%SDS的0.01M HCl溶液，震荡30 分钟。 7.酶标仪上测定A570。 8.计算细胞死亡率： 细胞死亡率（%）=（1-实验组A570/对照组A570）×100% 注意 1．细胞数范围：（0.5~2）×104。 2．MTT终浓度为0.5~2.5mg/ml，但一般浓度在0.5~1mg/ml就可以获得满意的结果。 3．加入MTT后，37℃条件下培养4~6小时。 4．设置空白与对照 空白孔：——+——+MTT+有机溶剂 对照孔：细胞+——+MTT+有机溶剂 5．DMSO易结冰（其溶点为18~20℃），室温偏低的条件下影响甲肷的溶解，使检测的光吸收值降低，且有机溶剂溶解的时间不能过长，如10分钟就可以获得结果。用SDS作溶剂可使所测光吸收值数日不变。
用显微镜观察洋葱表皮细胞实验步骤 实验过程 操作要求注意事项 （1）制作洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片准 备 用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干 净；用滴管在载玻片中央滴1-2滴清水。 用手捏住载玻片、盖玻片的两侧。 小心划伤。滴清水时，应滴在载 玻片中央，不宜过多。 取 材 用刀片切取一块洋葱鳞片叶（大约0 、5 平方厘米），用镊子撕取洋葱鳞片叶的内 表皮；把撕取的表皮浸入载玻片上的水滴 中，并展平。 用刀片时应小心，防止划伤。切 块时应注意切块的大小。当把表 皮在清水中展平时，有时表皮会 粘在镊子上，这时用解剖针或用 镊子在清时中轻轻晃动即可。 盖 盖 玻 片 用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载 玻片上的水滴，然后缓缓地放下，盖在要 观察的材料上。 一定让盖玻片的一边先接触水 滴，然后轻轻放下，否则会出现 大量水泡。 染 色 把一滴碘液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸 从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本 的全部。 滴加染色液时，可让载玻片一头 略高，然后用吸水纸从另一侧吸 引，连续两三次，这样才能充分 染色。 （2）用显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞取 镜 与 安 放 一手握镜臂，一手托镜座，把显微镜放在 实验台中央略偏左，距实验台边缘约7厘 米。 一定用双手，显微镜位置放正确。 对 光 上升镜筒，转动转换器，使低倍物镜对准 通光孔；一只眼注视目镜，另一只眼睁开， 同时转动反光镜，使视野明亮。 注意双眼睁开。
安放玻片将玻片轻放载物台上，标本正对通光孔； 用压片夹压住玻片的两端。 注意标本摆放的位置，一定正对 通光孔。 调焦双手转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降， 同时眼睛从侧面看着物镜下降，直到物镜 接近玻片；一只眼睛注视目镜，同时转动 粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升至视野中出 现物像，微调细准焦螺旋使物像清晰。 将物镜下降时，一定从侧面看着， 小心压破玻片。 观察移动玻片，将物像移到视野中央，在低倍 镜下观察洋葱鳞片叶表皮细胞。 视野中若出现气泡（边缘粗而黑， 压玻片时会移动或变形），此时应 移动标本。