实验一酵母细胞的固定化
1.实验目的
掌握酵母细胞的固定化方法。
2.原理
利用固定包埋法将酵母物细胞用物理的方法包埋在载体之中。这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。其理想的固定化载体应是应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化性树脂、聚乙烯醇等。
3.试剂和仪器设备
鲜酵母、海藻酸钠、无水氯化钙，烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计
4.实验步骤
（1）称取海藻酸钠0.75g于100mL烧杯中，加25mL蒸馏水搅匀，在沸水浴中溶胀15min，得A液。
（2）取一个50mL烧杯，加入鲜酵母5g和25 mL馏水，搅匀，得B液。
（3）待A液冷却后，将B液与A液混合，用尼龙布过滤，得C液。
（4）称取2.2g无水CaCl2，溶解于200 mL蒸馏水中。
（5）用注射器带7号平针头将C液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞，固化30min，过滤、洗涤，称重。
5.实验数据及其处理
记录固定化酵母细胞的质量。
固定化酵母细胞的质量为：0.75g
6.问题讨论
如何验证固定化酵母细胞的催化能力？
(1)观察制作的凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定化的酵母细胞数目较少。如果形成的凝胶珠不是圆形或者椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。
（2）观察发酵的葡萄糖溶液
利用固定酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生很多气泡，同时会闻到酒味。
（3）检查凝胶的黏性和弹性。
思想感悟
经过这次酵母细胞的固定化实验，我不仅掌握了酵母细胞的固定化方法，同时也通过对注射器的使用，明白了固定化细胞时，针头应垂直于液面且保持较近的距离，同时注射时速度应相应提高，以保证自液面下落的固定化酵母直径较小，因为缓慢低价会导致在流出针头时，由于黏弹力会使液体聚集形成较大的液滴，而快速注射形成水流则会避免该现象。
实验二蛋白的酶解及水解度的测定
1．实验目的
通过本实验，要求掌握酶水解蛋白质和测定水解度的原理，并掌握蛋白质水解度的测定方法。
2．原理
（1）蛋白质酶水解.
蛋白质的酶法水解就是利用蛋白水解酶在一定条件下对蛋白质分子进行催化水解，使蛋白质大分子降解成不同链长的小分子。与酸碱催化的水解反应相比，它的反应条件温和，副反应少，水解效率高。酶水解蛋白质主要受温度、pH值、加酶量、底物浓度及反应时间的影响。根据不同的蛋白水解酶及底物情况，可设定不同的水解条件进行反应，作比较后，选择最佳的反应条件。
（2）水解度测定方法
当蛋白质中的肽键全部被水解生成氨基酸时，则水解度为100％，没有被水解时，其水解度为0。由于蛋白质水解时每裂解一个肽键就生成一个-NH2和一个-COOH基，因此，在测定蛋白质水解度时，只要定量的测定新生成的-NH2和-COOH基的量就可以计算出h值，这样就可以算出蛋白质的水解度。常见的测定水解度的方法有甲醛固定法、茚三酮法、三硝基苯磺酸法(TNBS)、三氯乙酸法和pH-STAT法。本试验采用茚三酮法测定蛋白质的水解度，其原理如下：
茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应生成氨，茚三酮、反应产物氨和还原性茚三酮共同反应，生成紫色化合物。利用化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。
3.试剂和仪器设备
(1) 材料：地鳖酶解液
(2) 试剂：10％NaOH 溶液、标准L-亮氨酸（固体）、1％SDS溶液、0.2125M的磷酸缓冲溶
液（pH8.2）、茚三酮、KIO3、0.1N的HCl溶液、Arazyme蛋白酶(5000U/g)
(3) 仪器设备：粉碎机、磁力搅拌机，pH计、离心机、旋转式恒温振荡器、紫外可见分光
光度计、分析天平、电子秤、移液管（1mL、10mL）
4．实验步骤：
⑴试剂的配制
① 0.5mmol/L甘氨酸标准储备液制备：准确称取37.53mg甘氨酸定容至1000mL容量瓶中，于0℃条件下保存备用；甘氨酸标准使用液制备: 分别吸取上述溶液0.0、0.2、0.4、0.6、
0.8、1.0mL于试管中，用蒸馏水补足至1mL，相当于0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L；
②碘酸钾KIO3稀释液制备：称取1.0g碘酸钾溶于蒸馏水中并稀释至300mL，再加入200mL95%乙醇溶液，混匀备用；
③茚三酮显色剂制备：称取0.5g茚三酮，用95%乙醇溶解并定容至100mL，此溶液在
低温条件下用棕色试剂瓶可保存两周。
④ pH 5.4，2mol/L醋酸缓冲液：A 2mol/L醋酸 20mL冰醋酸加入到173mL蒸馏水中，混匀；B 2mol/LNaAc 50gNaAc用305mL蒸馏水溶解，混匀；用A将B调节到pH 5.4。
⑵原料处理
选取干地鳖虫或榨油后的水分含量低，用粉碎机以60目过筛对原料进行粉碎。
⑶加水调酸：每次取粉碎好的原料5.0g放入250mL的三角瓶中，按料水比1：20加蒸馏水
到三角瓶中，将料液混匀。用10％NaOH溶液调节料液的pH值到8.2，混匀。
⑷酶解：向已调pH值的料液中加入Arazyme蛋白酶0.3000g，将三角瓶置入旋转式恒温振荡器内，在37℃、150r/min进行酶解。
⑸灭酶：水解1小时后，取出三角瓶在80℃下灭酶15min。
⑹离心分离：5000r/min下离心10min，倒出上清液即水解液，稀释20倍备用。
⑺水解度的测定：
①标准曲线的制定：取25mL磨口具塞比色管6支，分别加入甘氨酸标准溶液1.0mL，再向各管分别加入pH5.4 2mol/L醋酸缓冲液，茚三酮显色剂各1.0mL，再向各管中加入蒸馏水，使各管的总体积为5.0mL，摇匀、盖塞、在沸水浴中加热15min后，取出，用冷水冷却15min，再向各管中加入5.0mL KIO3稀释液并摇匀，30min后于570nm测其吸光度。
标准曲线的绘制：
y=2.6409x-0.0544
R2=0.9322
②测定水解液的水解度：取水解液1.0mL，再向各管分别加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液，
茚三酮显色剂各1.0mL ，再向各管中加入蒸馏水，使各管的总体积为5.0mL 摇匀、盖塞、在沸水浴中加热15min 后，取出，用冷水冷却15min ，再向各管中加入5.0mLKIO 3稀释液并摇匀，30min 后于570nm 波长处测其吸光度。 5.实验数据及其处理
水解度（Degree of hydrolysis,DH ）是指蛋白质中的肽键被水解的百分数，其计算公式为：DH= h / h tot ×100% 令x=0.563 y=1.43
H= =1.91mmol/g
h - 蛋白质水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔数（mmol/g ﹒蛋白质） h tot - 每克原料蛋白中肽键的毫摩尔数（mmol/g ﹒蛋白质）
据实验结果表明，大豆蛋白（Soy protein ）, 酪蛋白（Casein ），明胶蛋白（gelatin ）中肽键的毫摩尔数各为7.75，8.0，11.1mequiv/g ，而花生蛋白或花生粕蛋白中肽键的毫摩尔数，到目前还没有实验结果的推荐值。但是，利用一种底物进行酶解，选择最佳反应条件时，h tot 是固定不变的，产生变化的是根据不同反应条件下水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔数。所以，本实验可以用h 来表示蛋白质水解程度。据测定，干地鳖虫蛋白质含量在60%以上，以60%计；花生粕的蛋白质含量为39.752%，计算时以40%来计算。 (参
考Adler-Nissen, Determination of the Degree of Hydrolysis of Food Protein Hydrolysates by Trinitrobenzensulfonic acid ,1977)
6．问题讨论
⑴ 以花生粕作为水解原料的意义在哪里？
充分利用花生压榨制油后的资源，而且花生粕蛋白质营养价值高,含量高达40%.氨基酸配比合理，富含人体必须氨基酸。
⑵ 在国内食品加工中常用的蛋白质分解酶是什么？ 胃蛋白酶，凝乳酶，胰蛋白酶、组织蛋白酶
⑶ 从韩国引进的高效蛋白质分解酶Arazyme 的特点是什么？
Arazyme 酶是蜘蛛肠道中分离出的共生微生物所分泌的一种高效金属蛋白酶。
1*401*100310*43.13
-
特点：蛋白分解能力，更有效的分解动植物蛋白质，耐受高温，低温、较宽的PH范围；具
有一定的抗菌活性；有高效率的催化能力，具有高度专一性，作用条件较温和，生物效应是
瞬时的。
⑷本实验中的注意事项是什么？
1.实验中要用具塞比色管的目的是为了加热时确保安全。
2.使用醋酸缓冲液是为了给显色反应创造环境。
3.花生粕的蛋白质含量为39.752%，计算时以40%来计算
思想感悟
经过这次蛋白的酶解及水解度的测定实验，我不仅学到了酶水解蛋白质和测定水解度的原理，还学到了蛋白质水解度的测定方法。蛋白的酶法水解就是利用蛋白水解酶催化水解，使蛋白质大分子降解成不同链长的小分子。而测定其水解度则需要依靠茚三酮法，生成的紫色化合物在570nm下测定的光密度，得出氨基酸的含量。另外，绘制标准曲线时，为了获得更为准确的标准线，需要舍去误差较大的数据，为今后的实验数据处理积累了经验，而使用醋酸缓冲液创造显色环境也为提供了一定的参考。
实验三酶解物肽含量的测定
1.实验目的
随着对多肽生理功能认识的深入，多肽的提取及含量的测定也具有重要的意义。本实验
主要目的是掌握利用BCA法测定肽含量的方法及原理。
2．实验原理
二价铜离子在碱性条件下可以被蛋白质分子中的肽键还原成一价铜离子，一价铜离子
和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一
个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光
度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。
3.试剂和仪器设备
（1）原料和试剂
原料：地鳖虫酶解物或花生粕酶解物，BCA蛋白质定量试剂盒，蒸馏水
试剂：①0.9% NaCl：称取2.25gNaCl，用蒸馏水定容至250mL；
②0.5mg/mL BSA标准液移取2.5mL 5mg/mL的BSA标准品，加入0.9%NaCl稀释至25mL，既得0.5mg/mL的BSA标准液；
③稀释酶液：取地鳖酶解液（工艺同实验三）加入，加入等体积的10%TCA混匀，静置10min，3000rpm离心15min，取上清液，稀释10倍，备用。
（2）仪器设备
恒温水浴锅、分光光度计、pH计、移液枪、分析天平、秒表或定时钟。
4.实验步骤：
（1）将试剂A摇匀，用10mL移液管移取10mL试剂A到小试剂瓶中，用移液枪向其中加
入200uL的试剂B（即试剂A与试剂B的量要满足A:B=50:1）,充分混匀。BCA工作液在
室温24小时内稳定。
（2）取0.5mg/mL的BSA标准液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加0.9%NaCl补足1mL。
即得0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mLBSA标准液。
（3）取各标准液100uL，加入1mLBCA工作液，充分混匀，于37O C水浴中放置60min，取出
后在562nm波长下读其吸光值，做标准曲线。
（4）样品液测定：取3支试管，1号加入100uL蒸馏水，2、3号试管加入100 uL稀释后样
品，再向其中分别加入1mL BCA工作液，充分混匀。将试管于37O C水浴中放置60min，取出
后在562nm波长下读其吸光值，根据标准曲线测定含量。
5.实验数据及处理
肽含量根据样品液的吸光值及BCA的标准曲线计算。
标准曲线:
y=1.1218X+0.02
R2=0.9602
令X=0.596
则y=1.1218×0.596+0.02=0.689
6.问题讨论
（1）测定肽含量的意义在哪里？
多肽是由三个或三个以上氨基酸分子脱水缩合而成的化合物，测定其含量可以得知多
肽的氨基酸种类及数量，从而分析其生理功能；
（2）BCA试剂混合时注意事项有哪些？
1.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA
工作液，充分混匀。
2.BCA工作液室温24小时内稳定。
3.为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当的用微波炉加热，但是切勿过热。
附录：注意事项：
1、蛋白标准应在充分混匀后在稀释成不同浓度的标准液。
2、由于在做标准曲线时吸取量非常小，要注意移液枪加液的精确。
3、试剂A和试剂B混合成工作液时，可能会有混浊，但充分混匀后就会消失，成为淡蓝色的透明溶液。
4、BCA蛋白定量试剂盒受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保无EGTA，EDTA低于10mM，二硫苏糖醇低于1mM，B-基乙醇低于1mM。不适用BCA法时建议使用Bradford法蛋白定量试剂盒。还可以考虑用超纯水稀释，透析或除盐，ACETONE/TCA沉淀蛋白后重溶于超纯水等方法来消除干扰物质的影响。
5、为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当的用微波炉加热，但是切勿过热。
6、如果发现样品稀释液或裂解液本身就有较高背景，应考虑使用Bradford法蛋白定量试剂盒。
思想感悟
经过这次酶解物肽含量的测定实验，我学到了利用BCA法测定肽含量的方法。从而也了解到，蛋白质作为人体的组成成分，作为人体必需的营养素之一，其强大功能的背后是氨基酸的多样性，本次实验测定肽含量就为了解分析蛋白质的功能特性提供了方法，同时，本次试验中使用了移液枪，也使我熟悉了移液枪的使用方法。
实验四、蛋白酶活力的测定（Folin-酚法）
1．实验目的
掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法。
2．原理
蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。
酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1微克酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。
3．主要仪器和试剂
（1）试剂和溶液
① 0.1mol/L HCl：取浓盐酸17mL，加水稀释并定容至100mL，即为2mol/L盐酸溶液；取100mL 2 mol/L盐酸溶液，定容2000mL，即为0.1mol/L盐酸溶液；
② 1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液
精确称取预先于105 o C干燥至恒重的L-酪氨酸0.5g，用适量盐酸溶解后，再用蒸馏水定容至500mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液；
L-酪氨酸标准使用溶液
吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.0 mL用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL,即得到100 μg/mL L-酪氨酸标准液。分别吸取100μg/mL L-酪氨酸标准液 0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL于10mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成L-酪氨酸浓度分别为0、
10、20、30、40、50μg/mL的标准溶液。
③ 0.55mol/L NaCO3：称取29.2057g NaCO3定容至500mL容量瓶中；
④福林（Folin）试剂：使用时，以1份原Folin试剂与2份蒸馏水混匀，制成稀Folin 试剂；
⑤ PBS缓冲液（pH 7.6）：NaH2PO4溶液：准确称取0.6060g NaH2PO4,用蒸馏水定容至100mL，Na2HPO4溶液：准确称取1.7924gNa2HPO4,用蒸馏水定容至250mL；将NaH2PO4溶液缓慢滴入Na2HPO4溶液中用磁力搅拌器搅拌，用pH计测其pH值至7.6；
⑥ 1mol/L NaOH：准确称取2.0833g NaOH,用蒸馏水定容至50mL；
⑦ Casein溶液：称取1.21gCasein加入到PBS缓冲液160mL，在50-60o C水浴中搅拌，
加重蒸水定容至200mL ，用1N NaOH 调节溶液pH 至8.5；
⑧ 6M 醋酸：准确移取17.257mL 冰乙酸，重蒸水定容至50mL ；
⑨ TCA 溶液：TCA 1.8g ，无水醋酸钠1.8g ，6M 醋酸5.5mL ，重蒸水定容至100mL ； ⑩ 待测酶液的制备：称取1.0g Arazyme 酶溶于100mL 蒸馏水中，稀释100倍备用。 （2）仪器、设备
恒温水浴锅、分光光度计、pH 计、分析天平、秒表或定时钟。 4．实验步骤 （1）标准曲线绘制
按照表1分别吸取不同浓度的酪氨酸标准溶液、0.55mol/L 碳酸钠溶液和稀Folin 试剂于各管中，混匀。将各管同时置于37o
C 水浴，反应30min ，取出，迅速冷却至室温，以空白管（0号管）为参比，在660nm 测吸光度。以酪氨酸量为横座标，吸光度为纵座标，绘制标准曲线。当吸光度为1时的酪氨酸量（μg ）即为比色常数K 值。
线性回归系数（r ）应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。对每个新配制的Folin 试剂制作新的标准曲线。
表1 酪氨酸标准曲线
2．样品的测定
取三支15×150mm 试管（一支空白管，二支样品管）。分别向三支试管中准确加入5mL casein 基质液，将三支试管放入37o
C 水浴中预热5min ，分别向二支样品管加入1.0mL 稀释酶溶液，准确计时，反应30min ，取出。迅速准确向三支试管中加入5mL TCA ，空白管先加TCA 再加稀释酶溶液，摇匀。将三支试管继续置37o
C 水浴中放置30min ，取出，迅速冷却至
管 号
标准酪氨酸使用溶液
0.55mol/L 碳酸钠溶液(mL)
稀Folin 试剂
(mL) 浓度（μg/mL ）
吸取量（mL ）
0 0 2.0 5.0 1.0 1 10 2.0 5.0 1.0 2 20 2.0 5.0 1.0 3 30 2.0 5.0 1.0 4 40 2.0 5.0 1.0 5
50
2.0
5.0
1.0
室温。三支试管中反应液用滤纸（Whatman4号滤纸）过滤。另取三支15×150mm的试管（一支空白，二支样品管）分别吸取上述相应的滤出液2.0mL，0.55mol/L碳酸钠溶液5.0mL，稀Foiln试剂1.0mL，摇匀，置37o C水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。以空白管（对照）调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿，分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出生成的酪氨酸的含量。
标准曲线：
5．实验数据及其处理
按照下式计算蛋白酶活力：
X1(u/g)＝ A× K ×（11/2）×(1/10)×(1/W) ×N
=(136.19×0.039－0.004)×1/0.01×1/20×11/2×100
=1.4595×104
式中：X1―蛋白酶活力，u/g；
A―样品与空白的的吸光度差
K―比色常数；
11―酶反应体系总体积（mL）；
2―参与反应的酶量（mL）；
N―酶样品稀释时的稀释倍数；
W―样品重量（g/mL）；
10―反应时间（min）。
6．思考题
（1）比色常数K的含义是什么？
当吸光度为1时的酪氨酸量（μg）
(2) 绘制标准曲线应注意哪几点？
1.仪器校验好，容器清洗干净
2.称量准确，所用标准品最好是新打开的，纯度较高的固体或溶液，防止污染
3.移液时迅速准确，尽可能用一根移液管
思想感悟
经过本次蛋白酶活力的测定的实验，我学到了用Folin-酚法测定蛋白酶活力。蛋白质的水解产物氨基酸在碱性条件下，还原福林试剂并生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。则在660nm下测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，从而计算出蛋白酶活力。在反复的试验中，强化了对移液管和显色仪的使用。
2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化
1.文献综述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地
亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。
现代生物学实验技术实验报告 实验一、超薄切片 一、实验目的 学习掌握常规生物样品前处理技术及样品包埋块的制备技术。 二、实验材料 植物幼嫩叶片、小鼠肝脏细胞 三、实验试剂 2.5％戊二醛、PBS、1％锇酸、30％丙酮、100％丙酮、 Epon812包埋液、蜡油 四、实验器材 离心管、玻璃棒、滴管、移液枪、刀片、镊子、牙签、烘箱、切片机、 五、实验步骤 1、取材固定：从植株上取叶片或者取小鼠肝脏细胞，切取 1mm3左右大小的组织块，立即放入PBS（pH7.2)配制 的2.5%戊二醛中固定1小时。 2、用0.1molPBS缓冲液冲洗三次每次3～5分钟。 3、1％锇酸固定1小时，然后用缓冲液冲洗三次每次3～5 分钟。 4、丙酮脱水：30％－50％－70％－80％－90％－100％－ 100％每级5～10分钟
5、浸透：脱水剂：包埋剂=3：1 1小时 脱水剂：包埋剂=1：3 过夜 6、聚合：45 ℃12h 60 ℃24h 磷酸缓冲液0.2molL-1 PBS 配制 A液：Na2HPO4 .2H2O 35.61g 加DDW 至1000ml B液：NaH2PO4 .H2O 27.6g 加DDW 至1000ml 不同pH磷酸缓冲液的配制 pH 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 A液(ml) 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 43.5 B液(ml) 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 6.5 Epon812包埋液的配制 Epon812树脂20ml DDSA 4.6ml MNA 15.3ml DMP-30 0.8ml
2、支持膜的制备 将一个干净的载玻片垂直放入含有0.3~0.5%氯仿配制的聚乙烯醇缩甲醛制模剂中，放置两三秒后将载玻片垂直取出。用刀片在含有膜的载玻片上划出所需要的正方形，然后将载玻片45度倾斜放入水溶液中，使膜飘在水面上，选取厚薄合适的膜，将膜放在载网上，以备后面用。 3、切片 首先制刀，将玻璃片制成梯形的刀片，以备切片时使用。将包埋块置于显微镜下进行修整，将其修为最上端为正方体。在切片机上进行切片操作，使切下来的样品片漂浮在水槽中。对切下来的样品块进行染色并观察。 六、注意事项 1、取材的时候动作要迅速，组织离体后应将其快速放入 固定液中。并且要尽量减少损伤，减少牵拉或挤压组 织。组织块的大小一般为1mm3。 2、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真 空的方法让样品沉入溶液中。 3、饿酸为剧毒、极易挥发的试剂，使用时要注意安全。 4、脱水时要逐级脱水，而不能急剧脱水，更换液体时动 作要快，不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产 生气泡。
生物学实验常用技术一、分子方面 1、基因工程 1)PCR (Polymerase Chain Reaction) (二楼PCR仪器全部会用) 2)RT-PCR;Q-PCR 3)琼脂糖凝胶电泳;胶回收 4)酶切/链接 5)转化 6)固体/液体LB培养基配制 (高压蒸汽灭菌锅使用方法) 7)质粒大/小抽原理及步骤 (手提、溶液I、II、III作用) 8)基因组DNA抽提 9)RNA提取; 2、蛋白质工程 1)蛋白收集 (蛋白裂解液+PMSF; 1×Loading 裂解(推荐)) 2)SDS-PAGE(电泳胶的配制) 2)考马斯亮蓝染色,银染 3)Western blot 4)蛋白定量常用的方法及原理, 以及熟练操作Bradford法蛋 白定量 (TRIZOL法原理、注意事项及步骤) 二、细胞方面 1)细胞培养、传代 2)细胞冻存与复苏 冻存液配制: (1)DMSO:血清=1:9(推荐)
(2)DMSO:培养基:血清=1:3:6 均可 DMSO为细胞专用型;现用现配,效果最好;冻存时细胞在-80℃中不要超过一周,最好在24-48h内放入液氮罐中保存。 3)细胞培养基配制(过滤除菌)、胰酶配制(过滤除菌),PBS配制(灭菌);(不同培养基的区别;谷氨酰胺(提供氮源),2周补充一次) 4)转染 5)MTT原理及操作(检测细胞存活率或死亡率) 6)碱性磷酸酶实验(ALP,检测细胞分化) (5、6 需学会SPSS软件及graphpad prism5软件使用) 7)Hoechst染色 8)结晶紫染色(不推荐) 9)苏木精/伊红染色 (9可以替代8,以后实验推荐使用9,图片漂亮) 10)荧光显微镜的使用 11)激光共聚焦显微镜样品制备(细胞固定,染色,洗脱) (7、8、9、10、11需学会Photoshop常用工具处理数据) 12)流式细胞仪样品制备(包括:转染效率与细胞凋亡染色标记)以及仪器操作(需学会FlowJo软件分析流式结果) 三、动物实验 1)小鼠的定制: 常见的小鼠: ICR小鼠(正常),9元/只
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
2012级制药专业 工业微生物学实验报告 姓名: 刘甜甜学号: 2012304090 班级: 制药12-2班指导老师：王健 日期：2014.6.11
一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。 二、实验内容 1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征 1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。 1.2 实验步骤： 1.2.1.制片：○1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥； ②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面； 1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域； ②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗； ③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗； ④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗； ⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥； 1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。 图1：Gram’s stain（1000×）图2：染色试验 三、分离培养 1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
生物技术大实验 一、核酸凝胶电泳的基本原理是什么？ （1）核酸分子糖—磷酸骨架中的磷酸集团，呈负离子化状态；核酸分子在一定电场强度的电场中，他们会向正极移动。 （2）电泳中使用无反应活性的稳定支持介质，电泳迁移率与与分子摩擦系数成反比。物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下分离出不同分子量大小或相同分子量而构型有差异的核酸分子。 二、CTAB法提取植物总DNA中CTAB的中文名称及其作用原理是什么？ CTAB的全称是十六烷基三甲基溴化铵 基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。 三、SDS-PAGE电泳的基本原理是什么？ SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，SDS能断裂分子内和分子间氢键，使蛋白变性，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 用SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的分子量和纯度。在4%浓缩胶和12%分离胶上，以标准分子量蛋白（Protein Marker,High 29-205 kDa）为对照，电泳分离。经考马斯亮蓝-R250染色和脱色液脱色后，比较样品与标准分子量蛋白的迁移率，确定蛋白质的分子量及酶制剂纯度。 四、RNA提取过程中的注意事项有哪些？ RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。 注意事项 1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
生物技术专业介绍 生物技术专业是于2000年设立并正式开始招生，经过多年的建设，现已成为学校的优势专业，是山东省特色专业，又是山东省应用型特色名校工程重点建设专业。 一、人才培养目标 培养德、智、体、美全面发展，系统掌握农业生物技术的基本理论、基本知识、基本技能，具有较强的自主学习能力、实践能力、创新能力，能够支撑现代农业生物技术产业体系，服务于山东区域经济社会发展的高素质应用型人才。 二、特色和优势 1. 构建了一支高学历、教学经验丰富、科研能力强的一支师资队伍。本专业现有专职教师70人，其中正高职称22人、副高职称28人，讲师20人，高级职称教师占71.4%；具有博士学位的教师57人，占专职教师的81.4%；具有国外学习和研修经历的19人；泰山学者海外特聘专家3人、山东省教学名师2人、国务院特殊津贴获得者1人、“留学回国人员成就奖” 获得者1人、博士生导师4人。 2. 具有生物学科特色。本专业具有植物学、动物学、微生物学、生理学、遗传学等多学科支撑，以及生物化学与分子生物学省级重点学科支撑，生物学科特色鲜明。我们在生物技术专业的建设中，以厚基础，宽口径为前提，在课程体系与教学内容上力求突出自身的学科优势，形成专业特色，培养高素质应用型生物技术专业人才。 3. 以科研促教学，提高人才培养质量。（1）通过科研，提高教师自身素质，为提高教学质量提供了重要保证；（2）科研促进了教学条件的建设。在投资1000多万购置实验仪器的基础上，目前又新组建了科研用组培室与炼苗室各1间及教学用组培室与炼苗室各1间，极大充实了教学条件；（3）科研充实了教学内容。通过科研，提高教师学术水平，把新知识、新观点及时充实到教学中，激发学生对学科的兴趣，切实提高教学质量；（4）科研培养学生动手能力、创新思维。本专业于2003年率先在全校实施了“本科生导师制”制度，使学生从大二开始进入实验室，参与教师的科研活动，独立设计试验并完成科研任务，切实提高学生独立操作能力及创新能力。 三、学科建设 本专业为山东省特色专业，先后获得生物化学与分子生物学、遗传学、植物
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
生物制药技术中心实验室 建 设 方 案 为进一步提高实验实训教学质量的水平，推进实验实训教学的改革和建设，贯彻落实教育部关于实验室工作“巩固、深化、提高、发展”的要求，引入有效的竞争激
励机制，充分调动实验技术人员的积极性和创造性，构建高水平的实验技术平台，特制定本建设方案。 一、建设背景与目标 2006年12月学院为了适应21世生物应用技术人才的培养和资源共享理念的需要，在学校高校中率先对管理体制进行改革，成立了详详细细学院实验实训中心，将原生物科学系中心实验室更名为生物技术应用中心实验室并隶属该实验实训中心管理。 生物技术应用中心实验室下设化学、生物化学、畜牧业生产技术应用、生物化学制药与检测技术、园艺技术应用、食品营养与检测技术、生物技术应用等6大类18 个实验室，承担我院生物制药、食品营养与检测、畜牧兽医、园林和园艺5个专业、多层次的生物技术实验教学任务。并利用该中心实验室，开展了食品检验工、花卉工、园艺工、动物疫病防治员、动物检验检疫员、药物分析工和药物制剂工的职业技能培训与鉴定工作。每年接纳学生约2000人，年均总实验人时数在109500万左右。 中心实验室累计投入170万元购置了一大批先进教学仪器设备，增强了实验教学手段，改善了教学环境，提高了实验技术水平，为培养适应21世纪国家建设与社会 发展需要的、具有高技能、高素质创新、实践性生物技术人才创造条件，提供良好的实验教学技术平台。 中心实验室形成了独立设课与管理的运转模式。各实验室由生物技术应用中心实验室实行统一管理和调配，仪器设备共享，全面负责生物科学系各专业专业基础、专业课的实验教学和各专业的职业技能鉴定培训与鉴定工作。同时，不断增加从事实验教学的高职称、高学历的教师，优化实验教学体系、调整实验内容，学生通过实验课程的学习获得了良好的技能训练，他们的动手能力，创新思维，综合技能能得到显著提高。 通过院系的共同建设和发展，先后取得了具有积极示范推广意义的科技成果，即xxx省科技进步三等奖和xxx市科技进步二等奖。在理论与实践教学改革中勇于探索 和创新，获xxx省教学成果一等奖。突出的实验教学改革成果促进了畜牧兽医专业精品课程的建设(《xxxx》和《xxxx》于2004年和2006年分获省级精品课程)。本中心设施齐全先进、实验教学团队优秀、管理体制规范高效、环境人文安全，实验教学成绩显著，2004年和2006年度被评为xx省优秀实验室。经过多年的改革与建设，生 物技术应用中心实验将向海南省实验教学示范中心的目标迈进。
实验一：感受态细胞的制备 1.原理： 当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则需要该技术进行细菌的转化，以大量获得这一质粒。转化细菌的方式有很多种，如电转化法、脂质体转染法、显微注射法、CaCl2处理法制备感受态细胞等。一般的实验室都应用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可在抗菌素培养基上生长形成菌落。这一方法是分子生物学常用实验方法。 2.实验材料 2.1LB液体培养基 2.20.1mol/L CaCl2溶液：称取1.1g无水CaCl2，溶于90ml双蒸去离子水中， 定容至100ml，用0.22μm滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4℃保存。 2.3 DH5α菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml离心管，枪头（以上需灭菌）； 移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，普通冰箱，-70℃冰箱 3.操作方法 3.1从37℃培养12—16h的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到含有3ml LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。次日取菌液1ml，接种到含有100ml LB培养基的500 ml烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约2—3h（振摇速度为200—300r/min），待OD600值达到0.3—0.4时，将烧瓶取出立即置冰浴10—15min。 3.2自该步骤起皆需无菌操作。在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的、冰预冷的50 ml离心管中。 3.34℃离心，4000g×5min回收细胞。 3.4弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。 3.5加入冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。 3.64℃离心，4000g×5min,弃去上清液，倒置于滤纸1min。 3.7再加4ml用冰预冷的0.1mol CaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。 3.8置4℃冰箱置12—24h，即可应用于转化。 思考题： 制备感受态细胞时加入CaCl2的作用是什么？ 钙离子结合于细胞膜上，使细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，细胞膜的通透性发生变化，使外源DNA进入。
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
实验一酵母细胞的固定化 1.实验目的 掌握酵母细胞的固定化方法。 2.原理 利用固定包埋法将酵母物细胞用物理的方法包埋在载体之中。这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。其理想的固定化载体应是应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化性树脂、聚乙烯醇等。 3.试剂和仪器设备 鲜酵母、海藻酸钠、无水氯化钙，烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计 4.实验步骤 （1）称取海藻酸钠0.75g于100mL烧杯中，加25mL蒸馏水搅匀，在沸水浴中溶胀15min，得A液。 （2）取一个50mL烧杯，加入鲜酵母5g和25 mL馏水，搅匀，得B液。 （3）待A液冷却后，将B液与A液混合，用尼龙布过滤，得C液。 （4）称取2.2g无水CaCl2，溶解于200 mL蒸馏水中。 （5）用注射器带7号平针头将C液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞，固化30min，过滤、洗涤，称重。 5.实验数据及其处理 记录固定化酵母细胞的质量。 固定化酵母细胞的质量为：0.75g 6.问题讨论 如何验证固定化酵母细胞的催化能力？ (1)观察制作的凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定化的酵母细胞数目较少。如果形成的凝胶珠不是圆形或者椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。 （2）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生很多气泡，同时会闻到酒味。 （3）检查凝胶的黏性和弹性。
生物技术实验报告 篇一：生物技术实验报告 组别：第六组 组员：苏琳伟、陈治、陈家和、陈硅 报告人：陈硅 学号：10349069 词汇&释义： Parafilm 封口膜 Chloroform 氯仿（三氯甲烷） Isopropanol 异丙醇 DEPC 焦碳酸二乙酯 TRIZOLa mono-phasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate Phenol苯酚 isthiocyanate 异硫氰酸胍 MCS multiple cloning site （polycloning site） 注：MSC是DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有
多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 实验任务： 1. 从猪肌肉纤维中提取RNA; 2. 2对RNA上EGFP基因密码子片段进行RT-PCR扩增; 3. 将经RT-PCR技术扩增的cDNA与插入载体质粒，并将其转化入大肠杆菌进行克隆； 4. 从大肠杆菌中提取含目的基因的载体质粒。 实验目的: 1.掌握提取纯化总RNA的原理和技术； 2.掌握RT-PCR原理和技术； 3.掌握TA克隆原理和技术。 实验原理： A．总RNA提取和纯化 RNA 分离的最关键因素是尽量减少RNA 酶的污染。但RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA 酶外，环境中也存在大量RNA 酶。因此在提取RNA 时，应尽量创造一个无RNA 酶的环境，包括去除外源性RNA 酶污染和抑制内源性RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去
除外源性RNA 酶，通过RNA 酶的阻抑蛋白Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA 酶。 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，是一种由苯酚和异硫氰酸胍组成的单相溶液它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品最大使用量（1ml Trizol），动物组织( 50mg)，植物组织(100 mg)，丝状真菌( 100mg)，动物细胞(5×106～1×107)，酵母(1×107) 。 TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA 的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA 条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其
生物技术综合大实验——原核系统表达的 绿色荧光蛋白的纯化 宋捷（69）纪成功孔令浩王玉康王鹏程董奉新 （西北农林科技大学） 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。 关键词：GFP 蛋白提纯疏水层析离子交换层析凝胶过滤层析 — 1.介绍：GFP最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发 现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团］，三维结构为β圆柱，圆柱两端由一些较短的α螺旋盖住，圆柱中央是几段α螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。 2.材料和方法 2.1.pGFP质粒克隆及提取 质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于离心管，1000rpm离心30s，弃上清——加入100μl提质粒溶液I，震荡混匀——加入200μl溶液II，温和混匀置至于冰上5min——加入150μl溶液III，混匀，置于冰上5min——1000rpm 离心3min，转移上清于另一新离心管，加入900μl无水乙醇，混匀，室温静置3min ——12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥——于30μl TE中溶解，冰上暂存。 2.2.转化 取 OD600 ~ BL21，冰浴30min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2——悬浮沉淀，冰浴15min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2悬浮沉淀，备用。取1μl质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min——42°C水浴锅，热击45-60s——冰浴10min——加入900μl LB培养基，37°C，150rpm震荡培养30min——涂板（LBp/ara），37°C温育过夜。 2.3.筛选重组子及扩大培养 <
……………………….…………………………………………………………………………………姓名：杜宗飞专业：生物实验技术专业 院校：浙江大学学历：本科……………………….…………………………………………………………………………………手机：×××E – mail：×××地址：浙江大学
自荐信 尊敬的领导： 您好！今天我怀着对人生事业的追求，怀着激动的心情向您毛遂自荐，希望您在百忙之中给予我片刻的关注。 我是生物实验技术专业的2014届毕业生。大学四年的熏陶，让我形成了严谨求学的态度、稳重踏实的作风；同时激烈的竞争让我敢于不断挑战自己，形成了积极向上的人生态度和生活理想。 在大学四年里，我积极参加生物实验技术专业学科相关的竞赛，并获得过多次奖项。在各占学科竞赛中我养成了求真务实、努力拼搏的精神，并在实践中，加强自己的创新能力和实际操作动手能力。 在大学就读期间，刻苦进取，兢兢业业，每个学期成绩能名列前茅。特别是在生物实验技术专业必修课都力求达到90分以上。在平时，自学一些关于本专业相关知识，并在实践中锻炼自己。在工作上，我担任生物实验技术01班班级班长、学习委员、协会部长等职务，从中锻炼自己的社会工作能力。 我的座右铭是“我相信执着不一定能感动上苍，但坚持一定能创出奇迹”！求学的艰辛磨砺出我坚韧的品质，不断的努力造就我扎实的知识，传统的熏陶塑造我朴实的作风，青春的朝气赋予我满怀的激情。手捧菲薄求职之书，心怀自信诚挚之念，期待贵单位给我一个机会，我会倍加珍惜。 下页是我的个人履历表，期待面谈。希望贵单位能够接纳我，让我有机会成为你们大家庭当中的一员，我将尽我最大的努力为贵单位发挥应有的水平与才能。 此致 敬礼！ 自荐人：××× 2014年11月12日 唯图设计因为专业，所 以精美。为您的求职锦上添花，Word 版欢迎 下载。
关于生物技术综合实验报告生物技术综合实验 甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达 学生：学号： 同实验者： 谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH 的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。 实验一甘薯叶片RNA提取 一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理； 2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。 二、实验原理 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，
核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。 三、实验材料 1. 材料 甘薯叶片，品种为徐薯18 2. 试剂 ①无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌； ② Trizol试剂； ③氯仿； ④异丙醇、75％乙醇； ⑤ TBE缓冲液； ⑥上样缓冲液 3. 仪器
细胞生物学实验报告 细胞冻存 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员：
一、实验原理 在低于-70℃的超低温条件下，由机体内部的生化反应极其缓慢，甚至终止，因此采用适当的方法将生物材料降至超低温条件，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物体恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。 冷冻保存就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保存液的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其进行长期保存的过程。水在低于零度的条件下→结冰→细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。最适冷冻速度：不同细胞的最适冷冻速度不同。标准冷冻的开始速度为－1至－2℃/min，当温度低于－25℃时，可加速，到－80℃时可直接加入液氮中（－196℃）。复苏细胞时则直接将细胞的冻存管放到40℃热水中迅速解冻。 二、实验目的 1、掌握无菌操作技术。 2、.掌握细胞冻存的一般方法与步骤。 3、掌握培养细胞的消化方法。 4、了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。 三、实验仪器、材料、试剂及用品 1、仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜 2、材料：人宫颈癌HeLa 细胞 3、试剂：胰酶、DMEM培养基、血清、DMSO、抗生素 4、用品：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯 四、实验步骤 1、穿好实验服，进入无菌室前穿鞋套、洗手。 2、倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置370C下预热。 3、无菌室及超净台紫外线照射，关闭超净台紫外灯, 打开可见光灯开关，打开抽风机，用
微生物学实验报告格式 专业学号 姓名 实验一、???培养基的配制和高压蒸汽灭菌 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际用到哪些试剂、材料、玻璃器皿等都要写出，包括数量） 四、实验步骤（按照实际步骤填写,切忌抄袭） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、简述培养基的配制原则？ 2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？ 3.高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的冷空气完全排尽？ 实验二自生固氮菌的分离纯化 （这是个综合实验，请大家回顾三周来的所有操作步骤，将其整理成连贯完整的一份报告，注意每次实验的衔接，不要把其他的实验项目写进来，但也不要漏写该实验的相关步骤。） 一、实验目的
二、实验原理 三、实验材料（整个综合实验有涉及到的材料都要列出） 四、实验步骤（详叙每周所做的相关步骤） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？ 2、如何从自然界中分离自己所需要的纯培养？ 实验三平板培养测数法 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际操作有涉及到的材料都要列出） 四、实验步骤（详叙相关步骤） 五、实验结果 六、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 七、思考题 1、平板菌落计数法中，为什么溶化后的培养基再冷却至45℃左右才能倒平板？
2、本次实验是否成功？如果失败，试分析原因。 实验四简单染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并描述所观察到的细菌的显微形态） 六、思考题 1、简单染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 实验五革兰氏染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并判断自己分离到的菌种是G还是G+-？） 六、思考题 1、革兰氏染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？