常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼
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常用的分子生物学基本技术
核酸分子杂交技术
由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。
固相杂交
固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。
斑步杂交（dot hybridization）
是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。
印迹杂交（blotting hybridization）
Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。
Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。
差异杂交（differential hybridization）
是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA 探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。
cDNA微点隈杂交（cDNA microarray hybridization）
是指将cDNA克隆或cDNA的PCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上（如：尼龙膜或活化的载玻片）以微点阵，然后用混合的不同DNA探针与微点阵上的DNA进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。
寡核苷酸微点隈杂交（oligonucleotide microarray hybridization）
是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共价结合于支持物表面，与平均长
度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应
用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测，以
区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择
性剪接。但有工作量较大、成本较高、速度较慢等弱点。
液相杂交（solution hbridization）
指使变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链（探针）在溶液中保温，
使之形成杂交复合物。反应结束后，用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交
双链分开，然后结膈后在杂妆分子中的探针量，就可推算出被测的核酸量。
递减杂交（subtractive hybridizatio）
是利用两种来源一致而功能不同的组织细胞提取mRNA（或逆转录成的cDNA）,在一
定的条件下以过量的驱动mRNA或cDNA与测试的单链cDNA或mRNA进行液相杂交，通过羟基磷灰石柱层析筛选除去两者间同源的杂交体。经多轮杂交策选、除去两者之
间相同的基因成分，保留特异表达的目的基因或工基因片段。以后者筛选cDNA文库，可获得特异表达的目的基因cDNA全长序列。
核酸原位杂交
用特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞级或组织切片中核酸进行复性杂交并对其
实行检测的方法，称为核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）。用来检测DNA在细胞核或染色休上的分布，与细胞内RNA进行杂交以研究该组织细胞中特定基因表达水闰；还用于细胞、组织中有无特异性菌、病毒检测的研究。
该法的优点是特异性高，可精确定位；能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而
不受同一组织中其他成分的影响；不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的
靶序列有极高的敏感性；并可完整地保持组织与细胞的形态。因此被广泛应用于医学
生物学的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特异基因整合部物色检测等研究。近年来由定性发展到定量，方法更为完善。
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）
在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA
分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制
性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细
菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人
工改造拼接而成。最常用的质粒是pBR322。
噬菌体（phaeg）噬菌体是感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌型及溶原型两型。用野生型λ噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线性双链DNA，基因组约为50kb，最常
用的哓菌体为λDNA及其衍生系列。
黏性质粒（cosmid）是由质粒与噬菌体λDNA组成的一种4-6kb的环状杂种DNA。
表达型载体将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核糖体的基因序列组成了表达型载体。
基因库的建造
含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造
是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选
常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定
DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出200-250个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP 中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA 片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。
化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA聚合酶，便随着M13噬菌体载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。至于RNA测序现大多采用将mRNA逆转录成cDNA后同测序，然后反推RNA序列
聚合酶链反应技术
聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列（甚至少到1个拷贝）。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增至100万-200万份拷贝。PCR反应分三步：变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过九小时的循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，这样经过数上时的循环后，可得到大量复制的特异性DNA片段。反应条件一般为94℃变性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共进行30次循环左右，最后再延伸72℃5分钟，4℃冷却终止反应。
1.逆转录PCR(RT-PCR)用来扩增RNA的方法。
2.竞争逆转录PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低丰度RNA定量的好方法。
3.多重PCR（multiples PCR）在同一PCR体系中加入多对引物可用于基天长度很长，发生多处缺失的觳狻＠┰鐾 荒０宓募父銮 颉?br>
4.多种PCR可同时加入多套以生物素标记的引物起进手PCR反应。
5.反向PCR（iverse polymerase chain reaction）对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。
6.不对称PCR在扩增循环中引入不同引物浓度，以得到单链DNA并进行列测定，以了解目的基因的序列。
7.锚定PCR（anchored polymerase chain reaction）帮助克服序列未知或序列未全知
带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内
切酶位点的锚上，在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。
8.着色互补试验或荧光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理
是用不同荧光染粒，分别标记于不同寡核苷酸引物上，同时扩增多个DNA片段，反应完毕后，利用分子筛选去多余的引物。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一DNA区带荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带荧光染色料颜色的组合，如果某一DNA
区带缺失，则会缺乏相应的颜色。
9.双温PCR（two-temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是94-95℃和46-47℃。可以提高反应的速度和特异性。
上述这些PCR技术的应用：（1）PCR技术扩增特定序列为基础，采用多种方法进行
检测，如PCR-RFLP、PCR-SSCP从已克隆的双链DNA中产生特异性序列作为分子探针；（2）通过选择性扩增cDNA中产生特异性序列作为分子探针；（2）通过选择性扩增cDNA中的特殊片段，产生针对尚未克隆的基因的探针；（3）从微量mRNA中产生cDNA文库；（4）产生大量用于序列分析的DNA；（5）分析基因突变；（6）做染
色体步移。
10.原位PCR技术：PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于
其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。而
原位PCR（In situ PCR,简称IS PCR），它可使扩增的特定DNA片段在分离细胞和组
织切片中定位，从而弥补了PCR和原位杂交的不足，具有良好的应用前景。目前，已
有多种设计的原位PCR扩增仪系统问世，使操作简便，软件灵活，已成为拉增固定细
胞和石蜡包埋组织中特定DNA和RNA序列的有用工具。
IS PCR的技术特点
（1）既具有PCR的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；（2）测到低于2个拷贝量的细胞内特定DNA序列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒DNA；（3）有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析；（4）可用于正常或恶性细胞，感染或非感染细胞的鉴定与区别。
IS PCR的基本方法
IS-PCR是PCR和原位杂交两种技术的绫事，实质是一种将靶DNA或RNA在原位扩增后再进行原位杂交的技术，操作程序基本兼有两种技术的所有过程，首先在适当处理
的细胞和组织切片上滴加PCR反应液，然后把载玻片放入热循环仪中进行扩增，最后
通过标记的探针进行原位杂交检测扩增产物。
初步应用
有关原位PCR技术应用成功的第一篇报道是对感染绵羊中枢神经系统visna病毒在绵
羊脉络从一细胞中检查，通过PCR扩增，仅用150碱基对的短探针就可通过ISH检查到了细胞内的visna病毒。从开始在试管内细胞行PCR扩增后再涂片做ISH(原位杂交)检查，已发展到用福尔马林固定、石蜡切片的常规病理组织方法做原位PCR检查。有
传统的标记探针的原位PCR法（间接法），也有将标记物先标记PCR的引物，让标记物扩增后再行ISH检查的直接法。因此，目前就原位PCR方法而言，尚未能获得统一，也即未能比较出哪一种方法最可靠简便，各家报道的原位PCR技术中，在标本处理和
种类上尚不同（细胞悬液、涂片、组织切片等），想检测的靶核酸也不同（病毒或体
细胞的DNA或mRNA），扩增的方法上有不同（单引物、多引物），最后显示的方法也不同（直接法、间接法）。这些还都有待在今后的工作中积累经验，以求一致。
原位PCR应用的课题，目前正片于开始阶段，还很局限，对人体B细胞淋巴瘤中Ig单拷贝基因重组的检查以及对人体外周血中单核细胞HLA-DQ不同亚型的测定，归纳起来，主要应用于两方面；（1）检测外源怀基因片段，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、
易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。
基因转染技术
将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本
问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。目
前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转
基因动物等研究。本部分将介绍目前基因转移的主要方法；重点介绍基因转移的病毒
方法的基因转染（transfection）技术。
基因运载系统
将某一特定的靶基因传递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概
括为两大类：非病毒辣方法和病毒方法。
1.基因转移的非病毒方法
直接注射法将含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起邻近的细胞摄入DNA燕进行
表达，在肌细胞中，基因表达可持续数月。
磷酸钙共沉淀法将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙微沉淀，附着于
细胞膜并经过细胞内吞作用耐是入细胞质。该方法的转化效率通常很低。
脂质体染法指质体能在体内或体外提供运载外源性遗传物质进入细胞的载体。脂质体介导的基因转移的最大优势在于能在活体内应用。
受体介导的基因转移依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基因。受体介导的基因转移方法是在质粒DNA和某种特异的多肽（配体）之间形成复合体，而这种多肽能为细胞表面的肥体所识别。如若将DNA在体内运送至肝内，可以选将DNA和能与肝细
胞受体特异结合的去唾液酸糖蛋白质偶联，以便通过细胞内吞过程而被摄入，这种DNA大部分被肝脏所摄取。应用该方法转移的外源基因在活体内的表达持续时间较短，在评估实际应用前影上还在一些问题。
显微注射法在显微镜下，将DNA经同细胞玻璃针地接注入细胞，该法适合于各种培养生长的细胞，但需要一定的设备和操作用支巧。
电穿孔法利用脉冲场将DNA导入培养细胞。
微粒子轰击法（基因枪）近几年发展较快的转移方法。使用高能微粒子轰击将DNA导入培胞或活的哺乳动物组织内。亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA，将这些微弹加强
速到很的速度轰击细胞。实验结果表明，用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等细胞中表达。
胚胎干细胞法胚胎干细胞是从受精卵开始分裂至4个国胞阶段未分化和具有多种潜能的生殖细胞，能在体外培养，可作为正面细胞，制备转基因动物，以研究基因定向整
合或基因剔险及基因及能。
精子载体法最近发现用精子和NDA-剂孵育，可捕获得DNA。通过受精过程，将外源
性基因导入受精卵，可捕获得物物，大大间化了转基因动物的制备过程。
2.基因转移的病毒的方法
病毒作为基因转移的是基因递送有有并工具，病毒载体的优点有：（1）在转化的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定的遗传成分；（2）在可能将有有制陷的或突变的基
因置于病毒调节信号的控制下以进行研究；（3）能将克隆的基因作为病毒微染色体的一部分，并能进分离；（4）转移效率较高。其主要缺点是病毒载体对外源基因的最
大容纳量只有2500bp。目前常用的病毒载体有下列几种。
逆转录病毒载体逆转录病毒辣为RNA病毒，它们的基因组编码在一条单链RNA他妇上，病毒进入细胞通过逆转录作用，病毒RNA即转变为双链DNA分子，DNA进入细
胞核并整合在细胞染色体中，这种整合的病毒称为原病毒。在原病毒的两端各有一长
末端重复序列（LTR）,LTR内侧还有为复制所必需的其他顺序，包括包装信号。目前
常用的逆转病毒载体有CMV和SV。
DNA病毒载体主要有腺病毒相关病毒载体，腺端正毒载体，疱疹病毒载体。对DNA 病毒载体的研究是当前基因基因治疗研究中的重点领域。
常用的基因转染技术
将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术：
靶细胞的准备被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。
靶基因质粒DNA的准备用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。
具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
转基因动物的建立和应用
转基因动物是以实验方法交源基因导入宿主受精卵或早期胚胎细胞染色体基因组内，
使其稳定整合和遗传给后代动物。它主要采用显微注射法、逆转录病毒载体感染法、
精子载体法、电转移法与胚胎干细胞法。
转基因动物模型的建立，推动了肿瘤在分子水平上的研究，它使人们认识到激活的原
癌基因的异常表达及功能失常，是肿瘤发生的初阶段。将癌基因与特定细胞的调控序
列连在一起，可使癌基因在特定细胞中表达，研究靶细胞对不同癌基因的易感性，阐
明某一癌基因对特定细胞生长、分化及功能的影响；它还可以研究多种基因的协同作用，有助于对多步骤致癌机进行深和的探讨。
转基因小鼠不但用以研究癌基因的功能，还可以通过使某一基因功能丢失（如用基因
剔除技术）研究抑癌基因在肿瘤发一中的作用。另外，转基因小鼠对致癌原的测试，
为肿瘤的预防，治疗及发现新的致癌物质都提供了有价值研究工具。
基因突变的检测方法
基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类
细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern 印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检
测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足
的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，
并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，
分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。
PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶
上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的
迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法
检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳
的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准
确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA 分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包
括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8
外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。
异源双链分析法（HA）HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变
性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所
不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。
突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，
第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生
型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。
变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达
1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程
而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法（温
度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。
化学切割错配法（chemical cleavage of mismatch,CCM）CCM为在Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的准确性可与DNA测序相仿。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俣变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化饿切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。该法检出率很高，也是检片段最长的方法，已有报功检测了1.7kb片段，如果同时对正、反义链进行分析，检出率可达100％。应用荧光检测系统可增强敏感度，可检测到10个细胞中的1个突变细胞。该法中的化学试剂有毒，又发展了碳二亚胺检测法（catodiimide,CDI）,CDI为无毒物质，也可检测大片段DNA的点突变。
等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表运河样品中存在与该ASO探针相应的点突变，ASO需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。目前已有商品化的检测盒检测部分癌基因ASO突变。
DNA芯片技术（DNA chip） DNA芯片技术是90年代后发展的一项DNA分析新技术，它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。在基因突变检测方面DNA芯片也有广阔的前景，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA发别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。
连接酶链反应（ligase chain reaction,LCR）与其他核酸扩增技术比较，其最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变，由Landegree于1988年首次应用于镰刀奖细胞贫血的分子诊断。LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5`-磷酸与另一相邻链3`-羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下，使相邻两引物的5`-磷酸与3`-羟基形成磷
酸二酯二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的
碱基存在突变则不能连接和扩增。LCR产物检测最初是通过这32p标记上游引物3`未端，经变性凝胶电泳分离后放射自显影加以鉴定，其检测敏感性达到200个靶分子。
也可设计1个横跨两引物的检测探针，用它与LCR产物进行杂交检测。近年有应用荧
光素、地高辛等非核素标记方法。Batt在1994年发展了一种更为简的方法，好微孔板夹心杂交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能检测单个碱基突变的能力，因此被应用于肿瘤基因突变的分子诊断，并与PCR结合用以提高其敏感性。
等位基因特异性扩增法（Allele-specific amplification,ASA）ASA于1989年建立，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于对已知突
变基因进行检测。该法通过设计两个5`端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3`端引物进行两个平行PCR，吸有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3`
端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。ARMS和ASPCR借鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。ASA法的检出率依赖于反应条件的
优化和可能发生的引物与靶DNA有氏配时错配延伸，特别是当错配碱基为G：T时，
这时可通过调整实验条件如引物靶DNA，Taq DNA聚合酶的浓度等来得高瓜在特异性。在反应体系中加入甲酰胺也可减少非特异性扩增。还可通过在引物3`端的第二个碱基引入一个错配碱基，使之与模板之间形成双重错配以阻止错误延伸。
RNA酶A切割法（RNase A cleavage）在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不
切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。故如果仅分析被检DNA的一个条链，突变检出率只有30％，如同时分析正义和反义二条链，检出率可达70％。该法需要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于1-2kb的大片段进行检测，并能确定突变位点。于这些优越性，它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。
染色体原位杂交（In situ hybridization of chromosome）染色体发现距今已有150多
年的历史，染色体检测被广泛用于动、植物及人类的细胞遗传学研究，随着染色体分
技术和分子生物学技术的发展。染色体研究范围也不断扩大，特别是用于肿瘤分子诊断。肿瘤细胞的染色体变化是一非常普遍的现象，可分为原发和继发两类。在肿瘤形
成的生物学基础方面，原发性的染色体变化与引起肿瘤的直接原因有关，肿瘤细胞中
可以发现各种形式的染色体畸变，如缺失、重复、易位、重排、单体断裂及核内复制等；继发性变化主要是肿瘤细胞核型的改变。染色体的检测对于肿瘤的诊断、鉴别诊断、生物学行为判别等方面都重要意义。染色体的检测方法进展很快，检测的精确率
也不断提高，这里主要介绍荧光原位杂交和PRINS法。
荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridiaation,FISH）创建于1986年。1969年Gall和Pardue首先应用核素标记核苷酸制备探针，通过放射自显影检测杂交信号。应用核素标记的探针其敏感性可以检测到中期染色体上几百
碱基的单拷贝靶核苷酸序列，敏感性虽高，但定位不够精确。FISH具有探针稳定、操作安全，可快速、多色显示多个不同探针的杂交信号等优点。FISH的灵敏感与探针标记方法和检测仪器性能有关，探针标记时掺入的修饰核苷酸比例直接影响杂交信号强度。FISH探针一般采用随机引物法或切口翻译法，如将PCR技术引入FISH探针标记，可使其灵敏度提高到0.25kb。应用慢扫描CCD配合影像处理理软件，增强信噪比，有利于检测微弱信号，如应用TSA系统（tyramide signal amplification）能将杂交信号
再放大1000倍，可用于单拷贝基因的定位。FISH分辨率大约为1-3Mb,如果应用强变性剂处理染色体，让DNA分子从蛋白质中分离出来，使双DNA完全伸展并粘附在玻
片上，经引处理后，分辨率可达1-2kb。还可采用对分裂中期染色体进行显微解剖（microdissect）法以提高分辨率。FISH的另一个特点是可以联合庆用地高辛、生物
素等多种标记系统，在一次杂交中可检测多种探针在染色体上的位置及探针间的相互关系，即多色FISH或多靶FISH。FISH技术已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等的检测，在肿瘤诊断和鉴别诊断、预后和治疗监控等方面都有重要
意义。
Klch等于1989年发明了染色体上寡核苷酸引物原位DNA合成技术（oligonucleotide primed in situ DNA synthesis,PRINS）,并成功地用于染色体特异α卫星DNA标记。其
基本原理是用非标记的寡核苷酸引物同染色体上靶序列特异性地杂交，在DNA聚合酶作用下，当引物延伸时，掺入标记的核革酸可直接或间接地检量标记位点。PRINS技
术的优点是不需克隆基因作探针，且由于杂交反应在前，标记在后，故非特异怀背景低。缺点是信号弱，灵敏度低，为克服这一制眯，Terkelsen等建立了重复引物原位标记技术（repeated PRINS）,重复进行PRINS反应，使信号号强度明显提高。基于
FISH的原理，发展了多色原位经物标记（multicolor PRINS）,可测定二个以上靶序列
在DNA分子上的相互的位置，且特异性比FISH还高。
DNA序列分析（DNA sequencing）应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置，其效率可以达到100％。现在的测序方
法已与经典的方法有了很大的不同，其基本原理虽仍是双脱氧终止法，但自动化程度
大为提高，操作更简便，测序时间也大大缩短。随着PCR技术与测序联合使用，不需
经过M13亚克隆步骤，故称为直接测序法（direct sequencing,DS）。DS法测序的模
板主主要来源于PCR，应用不对称PCR（asymmetric PCR）和基因组扩增转录同步测
序法（genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS）等，使单链产物大
大增加。近年来，PCR循环测序法的建立，使模板扩增与同步进行，引物用四种不同
前颜色的荧光标记，使每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行，
大大提高了测邓的自动化程度。目前PE公司推同出的DNA自动测序仪已发展到96泳道，并仍在不断改进。这些高度自动化的测序方法是经较理想的基因突变分析技术，
但其昂贵的费用其使用范围，所以对一些小样本或为了某些特定目的的样本分析，仍
进行经典的手工测序。
突变基因的检测方法多种多样，特别是PCR技术诞生后，许多检测技术都是在PCR基础上衍生的。由于PCR扩增南非要的模板量少，使对肿瘤的突变分析可以精确到单细胞，如霍奇金病的R-S细胞的单细胞基因突变分析。另外，应用显微解剖法（microdissection）可在组织切片上较精确地挑选需检测的靶点，其优点是可克服肿
瘤组只中间质或癌周组织的混杂，提高准确性。除上述介绍的方法外，还有多种方法
也用于基因突变的分子检测，如对未知突变基因进行分析的酶促切割错配法（enzyme mismatc cleavage,EMC）、切割片段长度多态性（cleavage fragment length polymor phism,CEFLP）、双脱氧指纹图谱法（dideoxy finger printing,ddF）、错配接合蛋白质截短测试法（protein truncation test,PTT）等。对已知突变基因进行分析的有引物延
伸法（primer extension,PEX）、寡核苷酸链接检测法（oligonucleotide ligation assay,OLA）、毛细管电泳法（capillary electrophoresis,CE）等方法。
细胞生物学实验方法与技术
当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞基因结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4) 细胞工程，包括基因工
程及体细胞核移植的研究。
一、细胞培养常用方法
1、细胞原代培养（primay culture）又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、
或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们
的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源
组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒
性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。
细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。2、细胞的传代培养当
细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响
生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传
代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。
二、器官培养方法
器官培养（organ culture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体
外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组
织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。
器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢
金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。
三、放射自显影术测定
放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密
接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。
现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组
织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学
各领域被广泛应用。
四、染色体分析技术
染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗
传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细
丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到
最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分
析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不
育和习惯性流产发生的遗传基础；3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿
出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA重组技术可以将基因定位于染色体的具体区带上。
五、电镜技术
早在1940年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜，但因分辨率低无实用价值。1965年英国剑桥科学仪器有限公司开始生产出商品扫描电镜，其以显著优点广泛用于生物学、医学、物理学、化学、电子学及勘探、冶金、国防、公安、机械与轻工业等
诸多领域，并已成为非常有用的研究工具。
电镜主要特点：1）景深大，较光学显微镜大几百倍；2）图像富有立体感，是一个具
有真实感的三维结构立体图象；3）图像放大范围大，光学显微镜有效放大倍数为
1000倍左右，透视电镜的放大倍数为几百倍至100万倍，扫描电镜可放大十几倍至几十万倍；4）分辨率高，扫描电镜可达6－3nm；5）样品可在三度空间平移和旋转，
聚焦后可以任意放大倍数，而不需调整重新聚焦。
六、细胞、细胞器、及细胞间质的分离技术、
1、细胞的分离分离不同的细胞及亚细胞组分在现代生物学研究中起着重要的作用。如研究某种药物治疗白血病的机理，需要分离培养人或动物的骨髓细胞，观察药物的
细胞作用；研究与细胞生长分化有关的生长因子的作用，需将与此类因子有关的细胞
分离出来；分离细胞膜，线粒体等细胞的亚组分，对于研究信号传递，某些遗传疾病，也都是必不可少的手段。
2、细胞膜的分离细胞内的膜系统与细胞质膜统称为生物膜（biomembrane）,他们都有共同结构和特征。首先要分离出形状完整的、具有生物活性的、高纯度的细胞膜，
用于研究细胞膜的结构和功能，以利于观察膜在细胞与环境进行能量交换及信息传递
的过程。
3、细胞核的分离细胞核作为一个功能单位，完整的保存遗传物质，幷指导RNA合成，后者为蛋白质及其它细胞组分合成所必需。因此细胞核分离是研究基因表达及细胞核
形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，用分级离心或超声波处理等方
法进行纯化。
4、溶酶体的分离溶酶体是处理细胞吞噬物的细胞器，含有高浓度的各种水解酶类，
调控细胞内的消化过程。溶酶体的分离常用于研究因溶酶体功能缺陷而引起的多种疾病。
5、线粒体的分离线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需要的能量，主要由在
线粒体内进行氧化所产生的能量供给。制备线粒体关键是保持其完整性及高纯度。
6、细胞DNA、RNA分离与纯化核酸是遗传信息及基因表达的物质基础。核酸的提取与纯化关键是保持核酸的完整性，但较困难，主要因为：一是细胞内有活性很高的核
糖核酸酶；二是酸碱等化学因素；三是高温机械损伤等物理因素，需严格遵守操作规程。
七、细胞凋亡研究方法
细胞凋亡(apoptosis),又称为程序性死亡（programmed cell death,PCD）指的是有核细胞在一定条件下，通过激活其自身内部机制，尤其是开启与关闭某些基因以及内源性DNA内切酶活化，导致产生细胞自然性死亡的过程。可以认为细胞死亡的这种方式是
一种生理性的自发过程。为此有人也称其为细胞自杀。
目前认为程序性死亡几乎和细胞的增殖同样重要，如果没有细胞凋亡，个体不能形成
与存活，或者发生疾病。只有通过细胞凋亡的发生，使特定细胞群体在特定的时间和
特定的部位死亡。从而使机体在总体上保障其细胞数量，以及形态与功能的平衡。近
年来如何用药物诱导癌细胞死亡也成为细胞凋亡的热点之一。透视电镜观察是研究细
胞凋亡的首选方法。
八、原位杂交
原位杂交技术是将分子杂交与组织化学相结合，用标记的DNA或RNA为探针，在原
位检测组织细胞内特异互补的DNA或RNA序列。它分为三类：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA。已广泛用于生物学的各个领域。原位DNA末端标记可以用于细胞凋亡的定量研究。原位杂交技术和PCR技术结合用于检测人乳头瘤病毒（HPV）
九、单克隆抗体
是1975年被描述的一种可产生无限量，并可预测其性质的抗体制备技术。该技术的关键步骤在于淋巴细胞之间的融合，所以称为“淋巴细胞杂交瘤技术”；由于杂交瘤经
过筛选可产生针对单一抗原决定簇抗体的细胞克隆，故称为单克隆抗体技术。该技术
的问世使得免疫学研究与实践发生了革命性的改观，同时还为生物学和医药学的许多
领域提供了前所未有的研究工具。人们利用其可精确地识别出极为复杂的分子，测定
出无法测定的物质，识别出新的细胞群体，揭示了以往未曾了解的细胞分化途径，为
肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等的诊断和治疗创造出令人兴奋的前景。
十、神经细胞培养神经细胞培养是指从体内取出某一种神经组织，在无菌、适当温度和一定营养条件下模拟在体生理环境，使之存活和生长，幷保持其结构和功能。
神经细胞培养按培养前切割程度分为器官培养、组织快培养和细胞分离培养。
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
1. 什么是细胞培养？ 细胞生物学实验 指从动物活体体内取出组织，并将其分散为单个细胞（机械或酶消化），在体外模拟体内的生理环境，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制以及细胞衰老过程等生命现象。 最常见的细胞一般有两种，一种是原代细胞，另一种是传代细胞。 原代细胞是指动物组织经过胰酶或胶原酶等酶类的消化，使其分散，从而获得单个细胞，再使这些单个细胞生长于培养容器中的过程。大多数组织可以制备原代细胞，但制备的方法略有不同，制备的细胞生长快慢及难易程度也不相同。 不同的原代细胞，其形态也不尽相同。一般将10代以内的细胞称之为原代细胞。 传代细胞一般指无限繁殖的细胞系，理论上这类细胞可以无限次的传代。做实验的时候也会经常使用这类细胞，如Hela、293、Vero 等细胞。 2. 细胞的生长周期 游离期：细胞刚接种到新的培养容器中到贴壁前的一段时期，这个时期的长短由细胞类型决定，从几分钟到几个小时不等。 贴壁期：细胞从游离状态变为贴附到培养器皿表面并展现出一定细胞形态的时期。 潜伏期：细胞在完成贴壁后，并不会马上进行增殖，会进行增殖所必须的物质和能量的储备，这个时候称之为潜伏期。
对数生长期：细胞在完成物质和能量储备后，开始大量的增殖的时期。这个时期的细胞活力旺盛，且状态稳定，我们所做的绝大多数实验都是在这个时期开展的。 停止期：随着细胞的生长，细胞密度越来越大，由于营养物质的消耗、细胞间的接触抑制等因素，细胞生长缓慢，甚至停止生长。这个时候，我们就要给细胞进行传代了，使细胞可以继续进行增殖，保持旺盛的活力。 3. 细胞生长所需要营养条件 细胞的培养所需要的营养成份一般来自于基础培养基（比如DMEM培养基）和血清。 基础培养基：主要是提供细胞生长所需要的氨基酸（组成蛋白质的基本单位）、维生素（细胞代谢中辅酶的组成成分）、无机离子（K+，Na+等）、碳水化合物（碳源和能量来源）和一些激素等营养物质。 血清：主要是提供一些基础培养基不能提供的生长因子和低分子的营养物质，此外它还有促进细胞的贴壁、中和有害重金属离子等作用。如果只提供基础培养基而不提供血清，绝大多数细胞是无法生长的。血清对于我们实验的重要性就不言而喻了，那么什么样的血清才算是合格的血清呢？ 合格的血清需要通过各种检测，包括无细菌，无真菌，无支原体检测，无病毒污染。血清一般呈现为淡黄色，透明状液体，由于含有大量的蛋白质等成分，会略有黏稠。以全式金公司的TransSerum EQ Fetal Bovine Serum (FS201-02)为例，它通过了牛腹泻病毒、牛副
细胞生物学实验 实验一不同显微镜的使用及细胞一般形态结构的观测[实验目的] 通过本实验，使学生巩固普通光学显微镜的使用，学习相差显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜的使用方法，学习显微测量及显微摄影的操作方法，增强对细胞的形态和真实大小的感性认识。 通过本实验操作，要求学生掌握细胞形态结构的基本观测方法与技术，为进一步的细胞生物学研究打好基础。 [实验原理] 应用显微镜的成像原理(详见翟中和等主编《细胞生物学》，第三章第一节)，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，观察细胞形态，得出细胞的大小。 该实验完成需时6学时。 [实验材料、试剂和仪器] 一、仪器 普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、显微拍摄系统、37℃温箱、镜台测微尺、目镜测微尺等。 二、材料 洋葱根尖切片标本，念珠藻永久装片，兔肝细胞标本，夹竹桃花丝毛细胞，人口腔上皮细胞等。 三、试剂 生理盐水，10μg/mL罗丹明123染液（溶于甲醇，避光于4℃保存） [实验步骤] 一、暗视野显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞 1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。 2、将上述装片置于显微镜载物台上，在10×物镜下找到夹竹桃花丝毛细胞清晰的图像。 3、换上暗视野聚光器，调节至最佳位置，通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，得到最好的暗视野图像效果。 4、观察夹竹桃花丝毛细胞内部的显微结构和细胞质环流现象，并拍照。 5、换用高倍物镜观察时，要换用与高倍镜相匹配的暗视野聚光器，重复以上调节步骤。 二、相差显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞 1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
实验室规则和要求 一般规定 1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“安全”是进行任何实验最重要的事项。 2.在实验室内请穿著实验衣（最好长及膝盖下），避免穿著凉鞋、拖鞋（脚 趾不要裸露）。留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。 3.在实验室内禁止吸烟、吃东西、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食 物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外 套及杂物等。 4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。每 组分配之仪器、耗材请在课程开始前确定清点与保管，课程结束后如数 清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用。实验前后，请把工作区域清理擦 拭，并随时保持环境清洁。 5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的 注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实 验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，适切记下 自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。 6.身体不适、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。 实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验 室。 7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验 室前记得洗手。 8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变 措施。
药品 1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、注意事项，翻阅物质安全资料， 查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。 2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、注意事项及配制日期，为避免 污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。 3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、 -巯基乙醇、甲醛、酚等）要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。 4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺（神经毒）、溴化乙啶（突变剂）、SDS（粉 尘）请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好 习惯。 5.使用后的实验试剂和材料，应放在专用的收集桶内。固体培养基、琼脂 糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。 6.使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或吸耳球。 仪器 1.使用仪器前先了解其性能、配备及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸， 勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。 2.使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，离心机未停下不得打开 盖子。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。 3.电源供应器有高电压，切勿触摸电极或电泳槽内溶液，手湿切勿开启电 源。
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导目录 一．显微镜的使用 实验一、几种光学显微镜的使用 实验二、参观电子显微镜及生物超薄切片标本制备 二．细胞形态结构 实验三、细胞大小的形态观察——测微尺的使用 实验四、细胞活体染色技术 实验五、植物细胞骨架光学显微观察 实验六、胞间连丝观察 三．细胞化学 实验七、鉴定RNA的细胞化学方法——Branchet反应 实验八、DNA显色的观察——Feulgen反应 实验九、固绿染色法鉴定细胞内酸性蛋白与碱性蛋白 实验十、多糖及过氧化酶的显示 实验十一、核仁组成区的银染显示与观察 四．细胞生理 实验十二、细胞膜的通透性 实验十三、细胞电泳 五．细胞和组织培养技术 实验十四、植物原生质体的分离和融合 实验十五、植物细胞的培养与观察 实验十六、动物细胞融合 实验十七、动物细胞的培养与观察 六．细胞化学成分的分离 实验十八、细胞器的分离、纯化——细胞分级分离 实验十九、荧光的细胞化学测定 实验二十、细胞活力的鉴别 实验一几种光学显微镜的使用
一、实验目的 了解几种光学显微镜的结构、工作原理、主要用途和使用方法；掌握使用普通显微镜提高分辨力的方法。 二、实验原理 (一)基本原理 一般实验室经常使用的光学显微镜都是由物镜、目镜、聚光器和光阑组成，普通显微镜它们的放大原理及光路图如下： AB物体．A1B l第一次成像，A2B2第二次成像，O l目镜．O2物镜， F1为O l的前焦点，F2为O2的前焦点 各种光学显微镜的光学放大原理基本相同，各种特殊用途的光镜不过只是在光源、物镜、聚光器等方面作了改动，或在其它方面增设了某些特殊的设备。 (二)几种光学显微镜 l、普通光学显微镜： 普通光学显微镜也叫复式显微镜，是最常见，最简单的显微镜。它适于观察一般固定的，有色的透明度较高的标本。其最大分辨力一般为0.2微米，从构造上可分光学、机械和电子三大系统。 2、暗视野显微镜： 暗视野显微镜是以丁达尔现象(Tyndall phenomenon)(即光的微粒散射现象)为基础设计的,它使用了特殊的聚光器进行斜射照明,因光源中心束不直入物镜，所以视野黑暗，而被检细胞器因斜射照明发生衍射和反射，所以发亮可见。暗视野显微镜可用增加光照方法增加物体与背景的反差，因而可观察到0．2—0．004微米直径的微小粒子，但它分不清被检物的细微构造，它常用于观察物体的存在与运动。而暗视野显微镜与普通光学显微镜的区别，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有别。确切地说，称暗视野显微镜为暗视野照明更为贴切。它是照明光线仅照亮被检样品而不进入物镜。使视野背景暗黑，样品明亮的照明方法。 3、相差显微镜： 相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。
实验一普通光学显微镜的构造和使用 一、目的要求 1了解显微镜的基本构造和使用方法 2 掌握油镜的原理和使用方法 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 1．显微镜的基本构造 光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。 2．显微镜的放大倍数和分辨率 放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力3．油镜的使用原理 当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、器材 1．永久切片 2. 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。 四、操作步骤 1．观察前的准备 （1）显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。 （2）调节光源 2．显微镜观察
（1）低倍镜观察 （2）高倍镜观察 （3）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3．显微镜用毕后的处理 观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。 五、思考题 1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？ 2．为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ 实验二胞间连丝的观察 一、实验目的 观察植物细胞的胞间连丝，加深对胞间连丝功能的认识． 二、实验原理 植物细胞的细胞壁上有许多原生质的细丝，称胞间连丝。相邻细胞的胞间连丝相互联接，在细胞间的物质运输与信息传递中起桥粱作用，并使细胞的各种生理活动协调一致，使植物体成为统一的有机体。用合适的植物细胞为材料，经简单处理，即能方便地看到胞间连丝。 三、实验材料 红辣椒表皮细胞临时装片、柿胚乳细胞间胞间连丝切片 四、实验步骤
细胞培养基本理论 一细胞培养概述 细胞培养（cell culture）模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 群体培养（mass culture）将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。 克隆培养（clone culture）即将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。 组织培养（tissue culture）指把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。 特点：1.，组织不失散，细胞保持原有的组织关系。2，形成生长(cut growth)或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。3，在体外生长时，细胞间呈相互依存、互相影响的关系。 器官培养（organ culture）将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。 特点：1，培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1 年。2，观察受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。 细胞培养优点：.1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后， 生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 三细胞的形态和类型由不同生长方式造成的差异 呈悬浮生长时，因生长在液体环境中，胞内渗透压高于周围液体环境，因此胞体基本呈圆形。呈贴附于支持物上生长的细胞，开始为圆形，很快过渡成扁平形，并逐渐恢复至原先的细胞形态. 细胞来源：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 细胞按生长方式：贴壁型细胞（Monolayer cells）；悬浮型细胞（Suspension cells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 贴壁型生长细胞或锚着依存性细胞 处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。分为成纤维型细胞；皮型细胞；游走型细胞；多形型细胞 贴壁型细胞形态比较 成纤维型细胞：梭形或不规则三角形；中央有卵圆形核；胞质向外伸出长短不同的突起；中胚层间质起源 上皮型细胞：扁平不规则多角形；细胞中央有圆形核；紧密相连单层膜样生长；内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等 游走型细胞：散在生长，一般不连成片；细胞质经常伸出伪足或突起；活跃的游走或变形运动；羊水细胞培养的早期 多形细胞型：难以确定规律和稳定的形态；如神经组织的细胞等
细胞生物学实验 班级：生科142 姓名：旷江 学号：10143131 组号： 2 小组成员：旷江、韦立尧、莫霞指导老师：范立强、李鹏飞 华东理工大学 应用生物学系
摘要 本次细胞生物学实验通过细胞形态与结构的观察技术，细胞化学，细胞生理，细胞培养与分析，细胞周期分析，细胞成分分离与分析，细胞增殖与染色等技术对动植物细胞进行细胞形态结构的观察、细胞生理过程的研究、细胞培养与细胞分析、细胞冻存与复苏等，以此来研究动植物细胞的结构、功能和各种生命规律。 关键词：细胞增殖、细胞染色、冻存复苏、生理过程、形态结构
Abstract The cell biology experiment was carried out by cell morphology and structure observation technique, cytochemistry, cell physiology, cell culture and analysis, cell cycle analysis, cell fractionation and analysis, cell proliferation and staining. Observation of cell physiological processes, cell culture and cell analysis, cell cryopreservation and resuscitation, in order to study the structure of animals and plants, functions and a variety of laws of life. Key words: cell proliferation, cell staining, cryopreservation, physiological processes, morphological structur
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼ 标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育 常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization）
冻存细胞的复苏 1、于液氮罐中取出冻存管。 2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。 3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。 4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。 5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。 组织块法培养骨骼肌细胞 1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。 2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。 3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。 5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 贴壁细胞的传代和冻存 1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。 2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。 3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待 见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。 4、加培养液终止消化。 5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。 6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。 7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。 8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。 9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃ 2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。 细胞计数
第二节细胞生物学实验方法与技术 细胞生物学是生命科学中的重要分支，它以生命基本单位细胞为研究对象，应用近代物理、化学和实验生物学方法，从显微、亚显微和分子水平来揭示细胞生命活动及规律，其中包括细胞的生长、发育、分裂、分化、遗传、变异（包括癌变）、兴奋、运动、代谢、衰老与死亡等基本生命现象，并且利用与调控细胞的行为活动，已达到为生产实践尤其为医药卫生事业服务。当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞基因结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4) 细胞工程，包括基因工程及体细胞核移植的研究。 一、细胞培养常用方法 1、细胞原代培养（primay culture）又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。 2、细胞的传代培养当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。 二、器官培养方法 器官培养（organ culture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。 器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。 三、放射自显影术测定 放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。 四、染色体分析技术 染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不育和习惯性流产发生的遗传基础； 3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA重组技术可以将基因定位于染色体的具体
细胞生物学实验汇总
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实验一、二：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 【基本原理】 细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。 本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。 【方法步骤】 1．制备土豆凝集素液和红细胞悬浮液，制备无血清的鸡红细胞悬液，使凝集素液和红细胞悬液混合，静置后，在光镜（低倍）下观察凝集素使红细胞凝集的现象。（以PBS 缓冲液加2％血细胞作对照实验）[土豆凝集素的制备：称取土豆去皮块茎2g , 加10 mL PBS 缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素） , 载玻片上滴一滴土豆凝集素,再滴一滴2％红细胞液,充分混匀静置20 min , 低倍显微镜下观察血球凝集现象。] 2．观察10%的鸡红细胞悬液，可见该悬液为一种不透明的红色液体 3．观察溶血现象取一支试管，再加入4ml 蒸馏水，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，混匀后注意观察溶液颜色的变化，可见溶液由不透明的红色变成透明的红色液体（可将试管贴靠在书上，隔着试管看书中的字，如发现溶血则文字可被看清）。 4．观察鸡红细胞对不同物质的通透性 （1）取一支试管，和0.17M 的Nacl 溶液4ml，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，轻轻摇匀，用上述方法观察是否出现溶血现象，如出现溶血，记下发生溶血所需要的时间（从加入4ml 溶液算起） （2）按上述方法分别加入下列9种溶液是否导致红细胞溶血并记录实验结果。 ①0.17M 氯化铵②0.17M 硝酸钠③0.17M 硫酸钠④0.17M 醋酸胺 ⑤0.17M 草酸铵⑥0.17M 葡萄糖⑦0.17M 甘油⑧0.17M 乙醇 ⑨0.17M 丙酮 【实验结果】 1、土豆凝集素能使鸡红细胞凝集，PBS 对照液中红细胞分散均匀。对照组未凝血，实验组凝血。 2、氯化钠、硝酸钠、硫酸钠溶液不溶。醋酸铵>草酸铵>氯化铵>乙醇>甘油>丙酮>葡萄糖。膜通透性大小主要取决于分子大小和分子极性。小分子比大分子容易通过，非极性比极性易通过，带电荷离子高度不透。
实验一显微镜的结构及使用 [实验目的] （一）熟悉显微镜的结构及各部件性能。 （二）掌握显微镜的使用方法。 （三）了解显微镜的维护方法。 [实验原理] 虽然显微镜的目镜和物镜的结构很复杂，但它的作用相当于一个凸透镜，其成像原理和光路图如图1所示，被检物体AB放在物镜（O1）下方的1—2倍焦距之间，则在物镜（O1）后形成一个倒立的放大实像A1B1，这个实像正好位于目镜（O2）的下焦点之内，通过目镜后形成一个放大的虚像A2B2，这个虚像通过调焦装置使其落在眼睛的明视距离处，即25cm,使所看到的物体最清晰，也就是说虚像A2B2是在眼球晶状体的两倍焦距之外，通过眼球后在视网膜形成一个倒立的A2B2缩小像A3B3。 [实验器材]擦镜纸字母装片羊毛交叉擦片普通光学显微镜二甲苯香柏油 三内容与方法： 普通光学显微镜(Microscope)的外形和结构因类型不同略有差异，但基本结构和功能是相似的。（图2） （一）微镜的基本结构及功能：光学显微镜由机械部分、照明部分和光学部分构成。1.机械部分： （1）镜座：位于底部的金属座。一般为马蹄形，用以支持和稳定整个镜体。 （2）镜柱：镜座与镜臂相连的短柱。 （3）镜臂：镜柱上方弯曲部分，是取用显微镜时握拿的部位。 （4）镜筒：在镜臂的上方倾斜的金属园筒，上端装有目镜、下端转折处装有棱镜，使光线转折450。其上有一固定螺钉将镜筒连接于镜臂上方。 （5）调节器：在镜柱两侧有大小两个螺旋，大螺旋为粗调节器，转动时能使载物台快速升降。调节范围较大，适于低倍镜调焦用。小螺旋为细调节器，转动是载物台仅缓慢升降，调节范围较小，适于调节物象的清晰度。此外，在右侧粗调节器内侧有一窄环，称粗调松紧调节轮，用以调节粗调节器的松紧度。向外转时偏紧，向内转时偏松。左侧粗调节器内侧有一粗调限位调节环凸柄，向上推紧时，镜台上的最高点被固定（这两个环一般不需调节）。（6）旋转盘：又称物镜转换器，安装在镜筒下端，为一可旋转的圆盘，上有4个圆孔，
细胞生物学实验报告 细胞凝集反应 【实验目的】 ⒈了解细胞膜的表面结构。 ⒉掌握凝集素促使细胞凝集的原理。 ⒊学习研究细胞凝集反应的方法。 【实验原理】 ⒈细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能和糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为：细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖外被有关。 ⒉凝集素（lectin）是一类含糖（少数例外）并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞外被中的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 【实验用品】 ⒈材料 土豆块茎、家兔。 ⒉试剂 ⑴PBS缓冲液 称取NaCl 7.2g、Na2HPO4 1.48g、KH2PO4 0.43g，加蒸馏水，定容至1L，调pH至7.2。 ⑵1％肝素溶液 0.1g肝素溶解于10mL0.9％氯化钠溶液中。 ⒊器材 5mL注射器、酒精棉球、双凹片、普通光学显微镜、托盘天平、滴管、离心管。 【实验程序】 ⒈以无菌方法抽取兔耳缘静脉血液（5mL注射器先吸取3mL1％肝素溶液）1mL，用0.9％氯化钠溶液洗5次，每次3000r/min离心5min，最后按沉淀的红细胞体积用0.9％氯化钠溶液配成1％红细胞悬液。 ⒉称取去皮土豆块茎2g，切成薄片，加10mLPBS缓冲溶液，浸泡2h，浸出的粗提取液中含有可溶性土豆凝集素。 ⒊用滴管吸取土豆凝集素和PBS缓冲液各一滴，置于双凹片的左右两孔内，再分别滴入一滴1％红细胞悬液，振荡10min。 4.待红细胞液发生明显凝集反应后，将双凹片置于显微镜下观察。 【实验结果】 ⒈结果 细胞凝集反应实验现象 ⒉图像
植物组织培养 一、实验目的 1、掌握植物细胞无菌培养技术。 2、了解不同激素对细胞的不同诱导作用。 二、实验原理 植物组织培养是20世纪60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官，组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整的再生植株。 植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种，幼胚培养与试管受精，抗体突变体的筛选于体细胞无体系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究与实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。 三、实验用品 1、材料 半夏无菌苗。 2、仪器 卧式灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。 3、用具 镊子、刀、牛皮纸、marker笔、棉线。 4、器皿 试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿(直径9～11cm)。 1、药品与试剂 1).药品(见下表) 2).70％酒精 四、实验方法 1、培养基的配制 配制培养基前先要配制母液。母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。(各类成分浓度、用量详见下表)。 表1 MS培养基母液配制(单位：mg) 类别成分规定量称取量母液体积(ml) 扩大倍数 配1升培养基 的吸取量(ml) 大量KNO3 1900 19000 1000 10 100 NH4NO3 1650 16500
元素MgSO4·7H2O 370 3700 KH2PO4170 1700 CaCl2·2H2O 440 4400 微量元素MgSO4·4H2O 22.30 2230 1000 100 10 ZnSO4·7H2O 8.6 860 H3BO3 6.2 620 KI 0.83 83 Na2MoO4·2H2O 0.25 25 CuSO4·5H2O 0.025 2.5 CoCl2·6H2O 0.025 2.5 铁盐Na2-EDTA 37.25 3725 1000 100 10 FeSO4·7H2O 27.85 2785 有机物质甘氨酸 2.0 100 500 100 10 盐酸硫胺素0.4 20 盐酸吡哆素0.5 25 烟酸0.5 25 肌醇100 5000 1).大量元素母液(10倍液) 分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的(60～80℃)蒸馏水中。一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。 2).微量元素母液(100倍液) 分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容至1000ml。 3).铁盐母液(100倍液) 称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。 4).有机物质母液(100倍液) 分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。 除了上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生长素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。 5).生长素 如2，4－D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml 95％乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。 6).细胞分裂素 如激动素(Kt)、6-卞基嘌呤(6-BA)。准确称取20mg，先用2ml的1mol/L HCl或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。 2、1L培养基的配制与分装 1).取1000ml烧杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml，有机物质100倍母液10ml。然后加水至800ml，加蔗糖30g，NAA终浓度0.25mg/L,6-BA0.75mg/L。待蔗糖充分溶解后用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8-6.0。 2).取一个250mL的烧杯，加200mL蒸馏水。煮沸后加8g琼脂条，待煮到一定境界后，液体为白色，
实验一：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 【基本原理】 细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。 本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。 由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。 【实验报告】 1．简图表示凝集素使血细胞凝集原理 2．怎样根据细胞膜渗透性实验结果分析确定物质进入细胞的速度？物质进入细胞的快慢有什么规律？ 实验二：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 【基本原理】 两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。 人工细胞融合开始于五十年代，六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广。细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。 细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，如研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、育种等。