研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。
植物基因功能诠释研究方法的新进展 (东北农业大学，150030) 摘要：本文通过阅读大量的文献，总结了植物基因功能注释研究方法的最新进展。对每种方法的原理及优缺点做了综述，拟供初学者和作相关研究者参考。 关键词：基因功能；研究方法；新进展 基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(struc tural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组(functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。功能基因组学(functional genomics)又往往被称为后基因组学(postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。[1,2]这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析，cDNA微阵列，DNA芯片等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异，因此需要建立模式生物体。 自华大基因启动“千种动植物基因组参考序列谱构建计划”和“千种植物转录组研究”以来，已完成水稻、黄瓜、马铃薯、白菜等植物的基因组序列图谱绘制，并通过对大豆的重测序研究建立了高密度分子标记图谱。这将是21世纪生命科学研究的重要领域。[3]本文将对研究基因功能的新技术及其新进展作一综述。 1 利用生物信息学方法分析基因的功能 生物信息学是利用生物信息学和电子技术(互联网技术)寻找并克隆新的未知功能的基因,着重于技术和操作层面,利用生物信息学对新基因进行电子克隆,及克隆该新基因的序列后对其进行简单的功能分析,如基因的编码区、启动子区、内含子/外显子、翻译启始位点和翻译终止信号预测,基因的同源比对,编码的氨基酸辨识蛋白质,蛋白质的物理性质,蛋白质的二级/三级结构、特殊局部结构以及功能预测等[4]。 1.1 通过序列比对预测基因功能
研究基因功能的“四大绝招”（初步总结版） 生命科学的研究有很大一部分集中于研究基因及其产物的功能。到底有哪些方法可以用来研究基因功能呢？本文初步总结为“四大绝招”。 第一招：患得患失 得，指的是基因的过表达（Overexpression）；失，指的是基因敲除（Knockout）或者低表达（Under-expression）。例如研究的假说是基因A与记忆力呈正相关，那么可以这样设计实验：先过表达基因A，预期结果是记忆力增强，再降低基因A的表达水平，或者完全敲除（如果不是lethal的话），预期结果是记忆力减弱。一个高质量的实验设计，一般应该“患得患失”，两方面的实验都要做。 我们不仅要“患得患失”，还要“斤斤计较”。因为过表达或低表达的水平不同，表型改变可能也不同，甚至看不到表型改变。例如，用RNAi Knockdown一个基因的表达水平的70%也许看不到任何变化，但是Knockdown 90%就能观察到表型改变了。所以，当过表达或者低表达研究基因却没有得到预期结果的时候，就需要考虑基因表达水平的变化是否不足。 有时即使完全敲除一个基因也看不到任何表型的改变，此时也不能下“研究基因与研究表型无关”的结论。这就好比一个桥有十个桥墩，如果只去除掉桥墩4，在非过负荷的情况下，桥可能不会倒塌，可以正常通车。可是，如果先去除掉桥墩5，再去除桥墩4，桥就会倒塌了。我们能够认为桥墩4是无用的吗？当然不能。桥墩在这里好比处于同一个通路具有相似功能的基因，桥是否可以通车好比基因的表型是否正常。所以，在敲除一个基因A看不到表型改变的情况下，可以在基因B（与A的功能具有相似性，或者是上下游的基因）敲除的动物模型上敲除基因A，观察敲除后是否有变化。 有时候，全身性的过表达、低表达或者基因敲除会出现我们不想要的结果。例如，全身性的基因敲除会致命。为了解决这个问题，现已开发出许多种组织特异性和时间特异性的过表达、低表达和基因敲除技术，使得基因调控更加准确。 第二招：上下求索 基因需要经过转录为RNA、翻译为蛋白质至少两步才能发挥功能。所以，研究一个基因的功能，就可以在DNA、RNA和蛋白质的水平分别进行研究。DNA 的水平相同，不代表RNA的水平相同；同样，RNA的水平相同，不代表在蛋白质的水平相同。哪怕就是在RNA水平，还有不同的剪切的可能。 一个基因翻译成蛋白质之后，常常需要同其它的基因及其产物相互作用才能发
转基因研究的现状及发展 转基因作物是当今世界各国现代生物技术产业研究的热点，中国的转基因生物技术发展一、我国转基因作物的发展现状迅速，由于科学界对转基因作物对人类及生态环世界上最早的转基因作物诞生于年，是一境利与弊的争论，措政府应制定相应的政策、施对到种含有抗生素药类抗体的烟草。世纪年代，其进行安全管理。本文论述了转基因作物在国际农业生物技术已逐渐成为各国现代生物技术产业研国内的发展现状，分析了转基因作物对人类及生态环境的利与弊以及关于我国转基因作物安全管究的热点。 转基因技术的应用 1．在畜牧兽医中的应用 应用于动物抗病育种转基因技术可以用于动物抗病育种，通过克隆特定基因组中的某些编码片段，对之加以一定形式的修饰以后转入畜禽基因组，如果转基因在宿主基因组能得以表达，那么畜禽对该种病毒的感染应具有一定的抵抗能力，或者应能够减轻该种病毒侵染时对机体带来的危害。（其用于遗传育种，不仅可以加速改良的进程，使选择的效率提高，改良的机会增多，并且不会受到有性繁殖的限制。）例如Clements等将绵羊髓鞘脱落病毒的表壳蛋白基因转入绵羊，获得的转基因动物抗病力明显提高；丘才良把一种寒带比目鱼抗冻基因成功地转移到大西洋鲑中，为提高某些鱼类的抗寒能力做了积极的尝试。 2．在医学领域中的应用 用于生产药用蛋白用转基因动物的乳腺生产重组蛋白（乳腺生物反应器）可能是转基因动物的最大应用，这也是世界范围内转基因研究的热点之一。Swamdom （1992）用β-球蛋白的4个核酸酶I的高敏位点与人的两个基因相连，融合基因产生的转基因猪与鼠的原型相似。目前，把转基因动物当作生物反应器来生产药用蛋白已经受到国际社会的极大关注，不仅各国政府投资，一些私人集团也不惜投入大量资金加以研究和开发。 3．转基因的应用存在的问题及展望 （1）转基因表达水平低，许多转基因的表达强烈地位受着其宿主染色体上整合位点的影响，往往出现异位表达和个体发育不适宜阶段表达，影响转基因表达能力或基因表达的组织特异性，从而使大部分转基因表达水平极低，极少部分基因表达水平过高。 （2）难以控制转基因在宿主基因组中的行为，转基因随机整合于动物的基因组中，可能会引起宿生细胞染色体的插入突变，还会造成插入位点的基因片段丢失，插入位点周围序列的倍增及基因的转移，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因。 （3）不了解哪些基因控制多数生理过程，不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制的机制。 （4）制作转基因动物的效率低，这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题，也是制约着这项技术广泛应用的关键。 （5）对传统伦理是一种挑战，对人类的生存有一定的负面作用等。 当然，我们不能因为这些缺点的存在就否定转基因技术的研究价值。因为它作为一种新兴的生物技术，配合其他相关的生物技术将具有广阔的应用前景。随着这一技术日趋成熟，许多问题有望逐步得到解决。
转基因动物技术应用研究进展 摘要：本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述，重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述，最后对转基因技术的发展前景作了展望。 关键字：动物转基因技术；应用；展望 Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals And their Application Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods.The application and prospect of transgenic technology was also discussed. Key words: animal gene transfer technique; application;prospect 动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达。自Palmiter等[1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。 1 转基因动物技术 1.1 显微注射法 这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法,创始人是Jaenisch和Mintz等,Gorden等[2]和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中DNA的复制过程,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。 1.2 逆转录病毒载体导入法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,
宏基因组学的一般研究策略 摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。 关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略 Strategies for accessing metagenomics for desired applications Abstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field. Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies 大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%[1]。宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA, 避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用[2]。本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。 1 宏基因组学研究策略 1.1宏基因组学概要 宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的[3], 可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究[4]。其主要过程包括样品和基因的富集和提取; 宏基因组文库的构建; 目的基因的筛选; 目的基因活性产物的表达(图1)。 1.2 微生物及其基因的富集 在文库筛选过程中由于目的基因比例较小, 对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker 等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5 ]，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物, 常
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
基因功能的研究思路主要包括: 1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度, 不同组织/器官)表达谱; 2.基因在转录水平的调控(可以通过genome walking PCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域, 通过单杂交或ChIP等技术, 寻找该基因的转录调控蛋白) 3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交, GST pulldown, co-IP, BRET, FRET, BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位) 4.gain-of-function & loss-of-function: 也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout), 从表型分析该基因的功能. 功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究, 综合分析. 关于基因的表达和定位，可以这样去做： 1. mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或real time RT-PCR，检测基因的表达情况/变化。 （或者以northern blot、Rnase protection assay方法，检测基因的mRNA表达情况/变化。）2. 蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Western blot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。 3. 检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。 1 首先应当表达该基因，原核基因最好原核表达，真核基因最好真核表达。 2 蛋白质的功能首先观察这种蛋白是膜蛋白还是分泌型蛋白，通过软件分析都可以预测。 3 功能分析可以通过基因树，探究此基因与其他基因的同源性，然后用表达的蛋白进行分析。 4 再有考虑到蛋白相互作用往往介导了蛋白的功能，可以应用酵母双杂交技术和噬菌体展示技术筛选能与此基因表达的蛋白相互作用的蛋白。 5 发现与其相互作用的蛋白后可以通过与其相互作用蛋白的功能推测。 6 可以通过体外过表达此基因观察各种信号通路的改变从而推测其功能
植物功能基因组学概述 XXX* (XXXXX) 摘要：植物功能基因组学是从整体水平研究基因的功能及表达规律的科学。对植物功能基因组学的研究将助于我们对基因功能的理解和对植物性状的定性改造和利用。本文简要介绍了植物功能基因组学的概念、研究内容和研究方法。 关键词：植物；功能基因组学；ESTs；SAGE Summarize of Plant Functional Genomics XXX （XXXXX） Abstract：Plant functional genomics studies provide a novel approach to the identification of genome-wide gene expression. It is currently being widely focused on the gene expression by transcript profiling and takes us rapidly forward in our understanding of plant biological traits. In this review, comprehensive of concepts, research contents and methodologies regarding plant functional genomics and transcript profiling are described. Key words: Plant; functional genomics; ESTs; SAGE 1 植物功能基因组学 基因组学(Genomics)是20世纪最后10年研究最活跃的领域之一。基因组学是指对所有基因的结构和功能进行分析的一门学科, 1986年由美国科学家Thomas Roderick提出, 兴起于20世纪90年代[1]。基因组学研究分为结构基因组学( structural genomics) 和功能基因组学( functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段, 以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主, 以研究基因序列为目标。功能基因组学(Functional genomics)的研究又被称为后基因组学(Post genomics)研究，它是利用结构基因组学提供的信息和产物，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向对多个基因或蛋白质同时进行系统研究。 植物功能基因组学是植物后基因时代研究的核心内容,它强调发展和应用整体的(基因 组水平或系统水平)实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能,其特点是采用高通量的实验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究。基本策略是从研究单一基因或蛋白质上升到从系统角度研究所有基因或蛋白质。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是两种最常用的模式植物。目前, 功能基因组学在水稻、拟南芥等模式植物中取得了较快进展, 主要原因在于这两种植物已完成全基因组测序工作[2], 获得了结构基因组数据, 且遗传背景清楚, 易于开展分子生物学研究, 已率先步入后基因组时代。 2 植物功能基因组学研究内容 2、1基因组多样性研究[1] *联系人Tel：XXXXX；E-mail：XXXXX
转基因动物及其在医学中的应用 转基因动物是指通过加减特定的DNA片段而改变了基因构成和性状 的动物，也可以认为是指体内基因组中稳定地整合有外源基因的动物。该项技术始于80年代初，很快便成为研究动物基因表达特性及其功能的重要手段，在基因表达的调控机制等方面的基础理论研究、家畜家禽的遗传性状改造、培育能为人类提供器官移植材料的家畜、培育人类疾病的模型动物、作为生物反应器主产工业和医学所需要的珍贵生物活性蛋白等方面被广泛应用。本文主要对其在人类医学方面的应用现状及前景作以论述。 1转基因动物的制备技术 用以培育转基因动物的技术叫做转基因技术或基因转移。其总体过程是：首先从某种动物分离目的基因或人工构建该目的基因，把该目的基因在体外进行重组和扩增，然后再把加工好的目的基因设法导入另一个同种或异种动物受精卵的原核内（或细胞质内），使其稳定地整合到受体细胞的基因组中，最后使该受精卵发育成携带外源目的基因的个体，即产生了转基因动物。目前常用的转基因技术主要有： 1）原核内显微注射法是将在体外构建的目的基因，在显微操作仪下用极细的微吸管注射到处于原核时期的受精卵的原核中，让这种外源基因通过某种方式整合到受体细胞的基因组中去，以实现转基因的目的。 2）转染技术主要以RNA病毒或DNA病毒为载体，在体外将目的基因或连同启动子等序列一同重组到病毒的核酸载体上。再让该病毒感染受精卵或胚胎于细胞，利用载体病毒具有主动整合到受体细胞基因组中去的特性，让其连同所携带的目的基因等也一同整合到受体细胞的基因组上去。 90年代后又出现了两种较新的方法，即基因剔除和基因楔入技术。 3）细胞载体技术主要使用胚胎干细胞（ES）作为操作对象。胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团中分离得到的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能分化的潜能，一旦回复到适当的环境条件下即可形成胚系集落。可以用转基因技术将外源目的基因转移到胚胎干细胞中，通过同源重组或转换的方法使外源基因整合到胚胎干细胞的基因组中。而且，还可以根据由于外源基因的插入所产生的基因表达方面的改变，来对胚胎干细胞进行预筛选，从而大大提高转基因的成功率。被转基因后的胚胎干细胞经鉴定后可被移植到正常发育的囊胚中，再将囊胚导入假孕的代理母亲子宫内发育而产生出嵌合体动物，然后与正常的雄性动物交配即可获得生殖系携带外源基因的纯合转基因动物。 目前还有用快速分裂的哺乳动物乳腺肌上皮细胞或小鼠精子作为细胞载体。 2转基因动物在医学中的应用
植物功能基因组学研究技术的发展 摘要：随着植物基因组学的发展，植物研究的热点转向了功能基因组学。如何确定大量的基因序列的功能，并进而了解基因与基因之间通过其代谢产物而形成的控制生物体代谢和发育的调控网络是功能基因组学研究的核心问题。在植物功能基因组学研究中，多摒弃原来传统的技术而采用新发展的方法，既省力又节源的研究基因的功能。 关键词：功能基因组学；表达序列标签技术；代谢组学；RNA干扰 二十一世纪以来，基因组学在各种模式生物基因组测序的完成的基础上发展迅速。基因组学已经产生很多个分支，比如结构基因组学，功能基因组学，比较基因组学等。其中，结构基因组学是基因组学发展的初级阶段，以建立生物的高分辨率遗传图和物理图为主。功能基因组学则代表基因组学发展的新阶段，是利用结构基因组学所提供的信息，发展和应用新的研究方法，从单一基因或蛋白质的研究转向多基因和多蛋白质的综合研究的一门学科，又被称为“后基因组学”。植物功能基因组学是植物后基因时代研究的核心内容，它强调发展和应用整体的实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能，其特点是采用高通量的实验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是两种最常用的模式生物，近年来小麦的功能基因组学研究也在进行，主要集中于基因组中转录表达的部分。 1 植物功能基因组学中的分子标记 如何快速高效的从基因组中获取生物信息，是一个急迫并且有挑战性的课题。然而，表达序列标签（Express Sequence Tags，EST）的出现成为结构基因组学和功能基因组学连接重要依据。EST是从cDNA序列中获得的有特异性特征，能特指某个基因，它的发展成为功能基因组学发展的基础，Genbank中积累的大量EST序列不仅为新基因的发现提供帮助，而且为开发基于PCR的各种分子标记提供资源，如EST-SSR，CAPS，SNP，SRAP和TRAP等。截止2000年数据库dbEST中的主要信息统计如表1所示。
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常见问题 ◆创新性不够。 ◆立题依据不充分。 ◆实验设计不合理。 ◆如何做好预实验。 ◆如何获得一个好基因。 让我们用心，换取您的放心！
典型基金精要 A基因通过调控B信号通路影响C肿瘤的D功能
A基因通过调控B信号通路影响C肿瘤的D功能 1. 相关性研究: A--C 组织水平：肿瘤组织样本基因的表达情况 临床水平：基因表达水平与各种临床特点（恶性程度，转移与否，耐药性，生存率等）的相关性 2.功能研究: A--D 细胞水平：生长，凋亡，转移，侵润，血管新生，耐药 细胞水平：生长凋亡转移侵润血管新生耐药 动物水平：成瘤，转移，药物敏感 3. 机制研究: A--B 3机制研究:A B 分子水平：相互结合，表达调控，翻译后修饰前，降解调控，剪切调控，胞内定位，激酶信号传导等 3
肿瘤基因功能研究流程推进 第一步：由特定肿瘤找出相关基因 肿瘤 表达检测 基因常规方法：表达芯片，等 目的：通过筛选，找出在肿瘤组织中有表达，和肿瘤的 目的通过筛选找出在肿瘤组织中有表达和肿瘤的 临床特征有相关性的基因 功能意义：研究的应用性以及临床相关性 意义研究的应用性以及临床相关性 机制 让我们用心，换取您的放心！
肿瘤基因功能研究流程推进 第二步确定候选基因的生物学功能 肿瘤第二步：确定候选基因的生物学功能基本逻辑：改变基因状态后检测细胞模型、动物模型 的表型变化 基因基因操作基因操作常规方法：过表达，RNAi 功能检测功能检测方向：增殖凋亡，转移，血管新生等 功能目标确定候选肿瘤相关基因的生物学功能机制 目标：确定候选肿瘤相关基因的生物学功能 意义：研究的重要性让我们用心，换取您的放心！
转基因动物制药 20世纪70年代后期，随着DNA重组技术的问世，诞生了基因工程药物或称基因药物。高产值、高效率的基因药物的出现给药物生产带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展、极大地加速了基因工程药物的研制进程。 1 转基因动物概述 转基因动物（transgenic animals）就是用实验室方法将人们需要的目的基因导入其基因组，使外源基因与动物本身的基因整合在一起，并随细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，并能稳定地遗传给后代的动物，且使遗传信息得到表达。整合到动物基因组上的外来结构基因称为转基因，由转基因编码的蛋白质称为转基因产品，通过转基因产品影响动物性状。如果转基因能够遗传给子代，就会形成转基因动物系或群体。 目前一般使用逆转录病毒载体法（应用较为成功的方法）、显微注射法、精子载体法及等来制作转基因动物。 2 生物制药产业的发展 生物医药产业的发展经历了3个不同的历史阶段。早期是天然药物，如中草药（或加工成中成药）。但人类并不满足于此，以后通过化学方法合成新的药物。合成的药物成分单纯，有些是天然药物没有的，有些是对天然药物的改进，使它更为有效。到20世纪70 年代后期，随着DNA重组技术的问世，诞生了基因工程药物或称基因药物。 3 转基因动物制药 基因工程药物的发展经历了三个阶段：第一阶段是细菌基因工程，第二阶段是细胞基因工程，第三阶段就是用转基因动物来生产药用蛋白。 3.1转基因动物制药的应用 转基因动物在生物制药中的应用主要包括以下几个方面：改良动物品种和生产性能；生产人药用蛋白和营养保健蛋白；生产人用器官移植的异种供体；建立疾病和药物的筛选模型；生产新型生物材料等。 1）利用转基因动物生产药用蛋白
研究基因功能的“七大绝招”与“三板斧” 2011.12.6-12.8 （说明：本文是对大约一年前的博文《研究基因功能的“四大绝招”（初步总结版）》的修改和补充，仍存在继续修改的可能。本文可能适合的读者是生物医学的科研新手和非生物医学领域的人。） 生命科学的研究有很大一部分集中于研究基因及其产物的功能。到底有哪些方法可以用来研究基因功能呢？本文初步总结为“七大绝招”和“三板斧”。掌握了这“七大绝招”和“三板斧”，设计实验更容易，看文献听学术报告也更轻松。 第一招：天地人合 无论是学习还是研究，必须遵循的一个原则是“从生活中来，到生活中去”。学习的时候，如果与日常生活中熟悉的、简单的事情结合起来理解，就可以化繁为简，化难为易。学习的目的是为了应用，学到的东西，必须应用到日常生活中去。 怎样研究基因的功能？要回答这个问题，我们先看怎样研究人的功能。假如你是男生，喜欢上了一个“女生”，可是这个“女生”长得扑朔迷离，帅气中带着妩媚，羞涩中透出豪爽。所以，你面临的第一个问题就是：TA到底是男还是女？第二个问题是：TA是不是学生？如果是的话，是本校的吗？你不认识TA的任何朋友，所以也没法打听。为了回答这几个问题，你决定翘课跟踪TA。你发现，白天的大多数时间，TA去了本校教学楼的教室。你守在教室的洗手间旁边，观察TA下课的时候上洗手间，去的是男洗手间还是女洗手间。高兴的是，你发现 TA去了女洗手间（终于松了一口气）。不过你比较小心，为防万一，你又跟 踪她，看她晚上回宿舍去的是男生宿舍还是女生宿舍。不出所料，她去了本校的女生宿舍。这下你终于放心了：她是本校的一个女生。
因为她去女洗手间和女生宿舍，提示她是女的。因为她白天去本校教室，晚上去本校女生宿舍，提示她是本校女生。上述事例告诉我们：一个人什么时候，在哪里活动可以提示其身份。同样，基因表达的时间和部位，常常可以提示其功能。例如，如果基因A在胚胎发育过程中表达，成年后不表达，则提示该基因与发育有关。基因B在在大脑的海马中表达，而海马与记忆有关，那么这个基因可能与记忆有关。 接下来的问题就是：她是哪个系的？她有什么兴趣爱好？你发现，她有两个个形影不离的好朋友。你恰好有同学认识她的这两个朋友。同学告诉你：她两个好朋友都是中文系的，都喜欢打羽毛球。这时，你基本上就可以认为这个女生是中文系的，爱好之一是羽毛球了。 以上所述可以归纳为三点：天时，地利，人和。“天时”指基因及其产物什么时候表达，“地利”指的是基因及其产物表达于哪个部位。“人和”可以进一步引申为两点：1. 近朱者赤，近墨者黑。就是说一个人会与他经常接近的人相似。基因也是如此，相互作用的一些基因常常具有类似的功能，它们为了完成同一个功能而通力合作。例如，如果实验发现蛋白C与蛋白D相互结合，而基因D是某一信号通路的受体，则基因C可能也是该信号通路的成员。2. 近猪者吃，近墨者喝。就是说一个人不仅会经常接触与自己类似的人，还经常接触自己的工作对象。例如，一个经常与学生接触的人，既可能是学生（近朱者赤），也可能是老师（近猪者吃）。同理，与一个基因接触的其它基因或者物质，也可能是其作用的对象。例如，如果蛋白质F与DNA结合在一起，则提示其对DNA发挥作用，可能参与DNA复制、转录等。 “合”指的是合理。亿万年的进化使不合理的基因基本上都被淘汰了，所以存在的基因其功能必定是合理的，至少具有合理性的一面。合理的表现就是能够促进个体的生存和繁衍。合理遵循两个原则：一，经济原则。生物不会浪费物质和能量在一个无用或者冗余的基因上。凡是一个基因可以实现的功能，没有必要用两个基因。二，有效原则。基因的功能应该促进而不是损害生物的生存和繁衍。根据合理性原则，无需任何实验证据，我们不难想到非编码DNA序列是有用的，不是无用的垃圾。 第二招：患得患失
转基因动物的研究及其应用综述 [摘要] 转基因动物是现代生物技术中一个极其重要的研究领域, 目前已经有转基因小鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、鸡和鱼等多种转基因动物问世。本文综述了转基因动物应用研究以及所取得的重要成就, 并指出了转基因动物存在的主要问题, 展望了其发展前景。 [关键词]转基因动物; 基因转移;基因打靶;显微注射；核移植 [中图分类号]S811. 5 转基因动物技术始于 20 世纪 80 年代，近 30多年来，随着研究的深入，转基因动物的研究工作取得了突破性的发展，并且是目前生物技术领域研究的热点之一，具有重大的科学意义和应用价值。这项技术是继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四项技术。转基因动物是通过向受精卵或早期胚胎中导入外源基因，有目的地对生物的遗传物质基础进行修饰改造培育新的品系。若外源基因与动物本身的基因（染色体）整合在一起，外源基因就能随生物的分裂而增殖，在体内得到表达，并能稳定地遗传给后代。 转基因技术是将外源基因通过载体导入受体生物体内，让其获得新特性的一门复杂技术。转基因技术在定向改造生物体中有着无法可比的优越性。随着生物技术的发展转基因技术相继在微生物、植物、动物中取得了成功。目前，已经有转基因小鼠兔绵羊、山羊、猪、牛、鸡和鱼等多种转基因动物问世。 1．转基因动物的研究概况 现代转基因动物研究始于 20 世纪 80 年代以后。1980 年, Go rdon 等[ 1 ]首次获得转基因小鼠。1982 年, Palm iter 等[ 2 ]分别将小鼠金属硫蛋白基因启动子(M T 21)与大鼠生长激素( rGH)结构基因和人生长激素(hGH )结构基因融合并导入小鼠受精卵中, 获得了生长超过正常小鼠的超级小白鼠, 其中一只阳性鼠生后74 d 的体重达到同窝非转基因小鼠平均体重的 1. 87 倍, 这便是著名的“巨型小鼠”事件, 是转基因动物发展史上的一个里程碑。目前除转基因小鼠外, 转基因兔、绵羊、猪及转基因山羊, 转基因鸡[ 3 ], 转基因大鼠及转基因鱼[ 4 ], 转基因牛[ 5 ], 转基因猴[ 6 ]等陆续育成。我国转基因动物研究起步较晚, 但已取得一定进展。中科院发育所与扬州大学合作, 将EPO 基因(促红细胞生成素) 和人乙型肝炎表面抗原(HBSA g)导入山羊, 获得两种乳腺特异性表达的转基因山羊[ 7 ], 同时也获得许多重要的基因重组表达产品[ 4 ], 标志着我国转基因技术进入了新的阶段。 2．转基因动物的原理 转基因动物（transgenic animal）指通过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、早期胚胎干细胞和早期胚胎，并整合到受体细胞的基因组中，它们经过各种发育途径形成所有细胞都包含目的基因的个体，称转基因动物（也称个体表达系统）。导入的基因称为转入基因(transgene)，而整个技术则称为转基因技术(transgenic technology或 transgenesis)。 利用转基因技术，人们可以在动物基因组特定的位点引入所设计的基因突变，模拟造成人类遗传性疾病的基因结构或数量异常；可以通过对基因结构进行修饰，在动物发生、发育的全过程研究体内基因的功能极其结构功能的关系；可以在动物基因组引入病毒基因组以模拟病毒性疾病的发病过程；可以通过引入具有重要药用价值蛋白的编码基因，使动物成为该药物蛋白的生产场所；可以将所引入的DNA片段作为环境诱变剂作用的靶DNA，通过对它回收后的结构分析，研究诱变剂造成的DNA损伤和诱发基因突变的规律。转基因动物技术不仅在生命科学研究中的应用越来越广，技术本身发展也越来越快，逐步逼近修饰的精确性与可调性。 转基因动物技术已经经历了近二十年的发展，从原理、技术及在生命科学研究领域中的应用来看，可将转基因动物研究大致分为以下3个部分：（1）上游部分克隆目的基因，分析基因的结构并在体外或其他系统中进行功能研究；（2）中游部分：设计遗传修饰策略（包括载体系统的构建等），选择适当的靶细胞进行基因转移和鉴定，在此基础上将遗传修饰由细胞向整体动物过渡，实现对整体动物基因组进行认为修饰的目的；（3）下游部分：按育种程序进行工程动物的选育和建系，在整体动物的背景上对目的基因的功能进行详细的研究，并进一步地开发利用符合设计要求的遗传工程动物。 转基因动物的遗传修饰策略包括：（1）导致产生新功能的基因组修饰（gain of function, GOF），主要有普通转基因及基因重复；（2）导致功能丢失的基因组修饰（loss of function, LOF），主要有插入突变、大片段缺失突变、点突变及条件性基因缺失突变；（3）导致基因替换的基因组修饰，主要利用基因打靶技术
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。 〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子
新基因功能研究的整体策略 张岚,李庆章 (东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030) 摘要:随着生命科学的发展及研究领域的不断开拓,越来越多的未知新基因和基因的新功能被发现,这些基因功能的研究成为了后基因组时代的首要任务。作者对新基因的研究策略作了一个较为系统全面的综述。 关键词:新基因功能研究;功能预测;基因转导;蛋白质相互作用 中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2011)05 0109 05 随着人类基因组计划(H GP)和其它模式生物基因组计划的相继完成,生命科学已经进入了后基因组学时代(post geno mics)。在对基因组结构进一步了解的同时,功能基因组学逐渐成为核心内容(徐子勤,2007)。基因组序列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步,更大的挑战在于如何确定基因的功能和阐述其调控的机制与表达规律。因而,基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题,它将是21世纪生命科学研究的重要领域(李新枝等, 2007)。那么,对于一个未知的新基因,如何对它制定基因功能的研究方案从而进行全面、系统的研究是每个基因功能研究者面临的首要问题。目前基因功能的基本策略包括:通过生物信息学的方法对新基因进行结构和功能的预测;通过试验方法进行基因功能的验证,包括功能获得策略和功能失活策略;基因编码产物相互作用蛋白的研究。作者结合国内外基因功能研究方法的新进展,对基因功能研究的策略进行了一个系统的综述。 1 新基因全长cDNA的克隆策略 在研究新基因的功能之前,首先要通过基因克隆试验得到新基因全长cDNA序列。所有的基因克隆都包括4个步骤,依次为产生DNA片段、连接至载体、转化到受体细胞中扩增和目的序列的筛选鉴别。如果一个基因的完整序列已经被报道,可以 收稿日期:2010 10 18 作者简介:张岚(1980-),女,黑龙江人,硕士,研究方向:乳腺发育功能基因功能。 通信作者:李庆章(1953-),男,河北人,教授,博士生导师,研究方向:泌乳生物学与乳腺功能调控。E mail:qing zhangLi@h https://www.doczj.com/doc/2115349953.html,;T el:0451 ********基金项目:国家重点基础研究发展(973)计划(2011CB100800); 东北农业大学创新团队项目(CXT005 1 1/CXT005 1 2)。根据已知序列设计特异引物,通过PCR技术获得目标DNA片段。如果一个或多个物种的某种基因已经被分离,可以根据同源性比对找到的保守性序列合成探针或简并引物,通过文库筛选或PCR反应从另一个新物种中分离功能相似的基因。如果只知道某个基因的一段碱基序列,可以采用RA CE(cDNA 末端快速扩增)或反向PCR和锚定PCR方法克隆该基因的cDNA全长序列;也可以将已知序列制备成探针对cDNA文库进行筛选,获得cDNA克隆后利用载体上的引物进行序列分析。此外,转座子示踪技术可用于酵母和植物的克隆;基于图谱的基因克隆方法(m ap based clo ning)依赖于遗传图谱和物理图谱,可用来分离与已知分子标记紧密连锁的基因,包括染色体跳查和染色体歩查;硅片克隆(silico cloning),即不经过实验室工作,将网络中的数据资料进行整理分析和拼接,得到新基因的全长序列(樊红等,2002)。基因的克隆有多种不同策略,研究者应根据自己的实际情况,采取适合的方法。 2 通过生物信息学预测新基因的功能 目前,生物信息学分析已成为新基因功能研究的首选和必用方法,具有方便、快捷、经济等优点。研究者往往可以从中得到与新基因功能有关的重要信息,初步推测基因的可能功能,进而制定出进一步的实验室研究方案(Kim,2004;Mo unt,2004)。 2.1 编码产物预测分析 研究者往往最开始得到有价值的EST序列,进而通过电子延伸或和相关试验方法获取其全长cDNA。在这种情况下,首先要进行全长cDNA序列的开放阅读框查找,推导其编码蛋白质的氨基酸序列。然后,进行信号肽序列预测分析(http://genome.cbs.dtu.dk/services/ Sing nalP/),初步判定其亚细胞定位(Bendtsen等, 2004)。再进行蛋白质的基本理化性质分析,包括氨基酸组成、分子质量、等电点、亲/疏水性等。最后,