植物基因功能诠释研究方法的新进展
(东北农业大学，150030)
摘要：本文通过阅读大量的文献，总结了植物基因功能注释研究方法的最新进展。对每种方法的原理及优缺点做了综述，拟供初学者和作相关研究者参考。
关键词：基因功能；研究方法；新进展
基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(struc tural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组(functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。功能基因组学(functional genomics)又往往被称为后基因组学(postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。[1,2]这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析，cDNA微阵列，DNA芯片等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异，因此需要建立模式生物体。
自华大基因启动“千种动植物基因组参考序列谱构建计划”和“千种植物转录组研究”以来，已完成水稻、黄瓜、马铃薯、白菜等植物的基因组序列图谱绘制，并通过对大豆的重测序研究建立了高密度分子标记图谱。这将是21世纪生命科学研究的重要领域。[3]本文将对研究基因功能的新技术及其新进展作一综述。
1 利用生物信息学方法分析基因的功能
生物信息学是利用生物信息学和电子技术(互联网技术)寻找并克隆新的未知功能的基因,着重于技术和操作层面,利用生物信息学对新基因进行电子克隆,及克隆该新基因的序列后对其进行简单的功能分析,如基因的编码区、启动子区、内含子/外显子、翻译启始位点和翻译终止信号预测,基因的同源比对,编码的氨基酸辨识蛋白质,蛋白质的物理性质,蛋白质的二级/三级结构、特殊局部结构以及功能预测等[4]。
1.1 通过序列比对预测基因功能
序列比对是生物信息学最基本的分析技术之一，最常用的方法是将目的DNA或蛋白质序列与已知的DNA和蛋白质序列数据库进行比对，搜索到与目的序列高度同源的功能已知的基因或蛋白质，用这些基因和蛋白质预测目的基因和蛋白质的功能。局部比对搜索工具BLAST是进行序列比对的基本工具，它允许用户选择一条查询序列与一个数据库进行比对，找到数据库中与输入的查询序列相匹配的项。BLAST 是一个序列数据库搜索程序家族，其中包括许多有特定用途的程序。
1.2 利用生物信息学方法分析基因芯片数据
1.2.1 差异表达分析（又称基因表达差异分析）
识别两个条件下表达差异显著的基因，即一个基因在两个条件中的表达水平，在排除各种偏差后，其差异具有统计学意义
1.2.2 聚类分析
若组内基因具有相似的表达模式，则它们可能具有相似的功能，例如受共同的转录因子调控的基因，或者产物构成同一个蛋白复合体的基因，或者参与相同调控路径的基因。在具体应用中可按照相似的表达谱对基因进行聚类，从而预测组内未知基因的功能。目前已经有很多种聚类的方法应用到基因芯片的研究当中，如层次聚类(Hierarchical clustering)、K 均值聚类(K-means clustering)、自组织映射(self organizing map)、PCA (principlecomponet analysis)等。
1.3 通过生物信息学方法分析蛋白质结构来预测蛋白质功能
在氨基酸序列整体同源性不明显的情况下，对蛋白质的功能域进行分析将对预测基因功能提供极其有价值的信息。目前已通过多序列比对将蛋白质的同源序列收集在一起，确定了大量蕴藏于蛋白质结构中的保守区域或序列，如结构域（domain）和模体（motif），这些共享结构域和保守模体通常与特定的生物学活性相关，反映了蛋白质分子的一些重要功能。
2 实验分析确定基因功能
2.1 基因失活在基因功能分析的作用
基因失活是基因功能分析的主要手段。基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系列生理生化反应过程。现在的基因功能研究与传统的遗传分析正好相反，传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因（正向遗传学），而在基因组计划中研究基因功能则是从基因出发，最终到达表型（反向遗传学）。因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基因相关的表型
2.1.1 基因剔除（knock-out）
基因剔除（knock-out）：最简单的基因失活方法，将一段无关的DNA片段用来取代目标基因。
原理:在一段无关DNA 片段的两侧连接与代换基因两侧相同的顺序,将这一构建导入目的细胞,由于同源片段之间的重组,可使无关片段取代靶基因,整合到染色体中.为了便于筛选,用于取代的外源DNA中含有报告基因. 如果该基因所控制的表型变化了，就从反面验证了目标基因的功能。
优缺点：即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。
2.1.2 反义RNA技术
原理：反义RNA由基因的负链（模板链的互补链）编码，可以与由功能基因转录而成的正义RNA形成双链结构，干扰mRNA的翻译，从而干扰基因的表达。将基因的编码序列反向插入表达载体，转化目标生物，获得转基因个体或品系后，进一步分析表达的反义RNA在生理生化或形态发生中所起的作用，由此判别目标基因的功能。干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。；与mRNA 的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻译无法启动；反义RNA与mRNA 形成双链分子后，使RNA多聚酶脱离模板,转录终止。
2.1.3 插入突变
可分为T—DNA插入突变，转座子插入突变。
T—DNA插入突变原理：以农杆菌(A_grobacterium)介导的转化为基础的一种插入突变研究方法。插入突变是将某些DNA元件插人到植物基因组中后，相应位点的基因的表达就可能受到抑制，利用插入元件作为标签，在插入位点处贴了一个标签，使得植物基因组的插入位点容易辨认。根据插入位点的基因序列与植物表型变异等的相互关系可以从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。[5]
优缺点：T-DNA插入突变具有其他插入突变方法没有的优点，在转基因植物中一般只有1～2个拷贝，可以作为突变源引发致变效应。此外，T—DNA在其基因组中的插入位点有一定的偏向性，偏向插入到基因密度较高的区域、基因的非翻译区及启动子区，T—DNA插入对特定的基因类别没有明显的偏向性。农杆菌介导的T-DNA也有不足之处，首先，T-NA的整合是一个复杂的过程，易产生直接的串联，反向重复和边界缺失，这将会影响到随后的分子分析。其次，T—DNA方法具有很大的宿主范围限制，仅对那些可快速有效进行农杆菌转化的生物体非常有效。对传统T-DNA插入突变技术的一些改进，如激活标签(activationtagging)和捕获标签(entrapmenttagging)技术在一定程度上解决了上述问题。
转座子插入突变原理：转座子插入宿主DNA的随机性导致产生大量的突变体，这些突变体可用于分析某特殊功能或过程的丢失、减弱的原因。许多转座系统已被应用于基因组水平的功能研究，尤其被着重用于研究与生物生存十分重要的基因的鉴定和结构分析。转座子(transposon)是染色体上一段可移动的DNA
片段，它可从染色体的一个位置“跳到”另一个位置。当转座子插入到某个功能基因时，会引起该基因的失活并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得到恢复。[6]
2.1.4 RNA干扰
原理：RNAi干扰是通过双链RNA的介导,特异性地降解相应序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默机制。
优缺点：RNAi最根本的特点是特异性。RNAi具有特殊的穿越能力,如将双链RNA注射在线虫性腺里,它也会干扰到体细胞里的基因表达,而且干扰作用会传给后代;对一些低水平表达的基因，RNAi现象并不明显RNAi能同时作用于几个有相同或相似序列的基因。
2.2 基因的超表达用于功能检测
原理：超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。重要逆境调控基因微小的表达变化就可以引起下游基因的积累效应，有可能使生物体表型发生可评估的变化，使其功能凸现。
优缺点：超量表达的技术规范已经相当成熟，与RNAi相比，目的基因超量表达后的表达量更易检测，但其与反义抑制和共抑制一样，均会导致转基因植株的致死效应或强烈的多重效应。
2.3 杂交原理的方法检测mRNA表达水平
2.3.1 DNA微阵列
原理:基因芯片（gene chip）又称DNA微阵列(DNA microarray)、DNA芯片（DNA chip）, 是将大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、microRNA等) 集成在同一基片上，组成密集分子排列，通过与标记样品进行杂交，检测、获取细胞或组织的基因信息。其中基因表达谱（expression prifile）分析是目前基因芯片应用最多的一个方面，主要采用cDNA芯片，基因表达谱芯片便于对不同状态（如生理和病理条件）下的基因表达谱进行比较，揭示转录组（transcriptome）差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义[7,8]。
优缺点:缺点在于它是一个“封闭系统”, 它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变异)。优势在于它是一个“开放系统”, 它的发现能力和寻找新信息的能力从本质上高于芯片技术。
2.3.2 Northern印迹（Northern blot）
既可分析mRNA表达又可验证cDNA新序列,是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种RNA 分析技术。
2.3.3RT-PCR方法
2.3.3.1反转录PCR
可用于mRNA的半定量分析,反转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）是一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方法。它是以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。
该方法适合对待测样品进行初步筛选，目前已广泛被实时定量PCR替代。
2.3.3.2实时定量PCR
常用于mRNA的定量分析实时定量PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)是定量分析mRNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。
2.3.4原位杂交（in situ hybridization，ISH）
可对mRNA进行区域定位, 是利用杂交原理建立的组织原位mRNA检测技术，可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位。同时也可作为定量分析的补充, 通过设计与目标mRNA 碱基序列互补的寡核苷酸序列，标记后作为探针；该探针能够特异性地与目标靶序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。
优缺点: 虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。
3 结语
基因功能的研究是科学研究的重要内容，也是一项复杂的工程。除了以上的研究方法外，还有许多其他的方法可用于基因功能的研究。在实际工作中，研究者需要根据具体情况制定某一特定基因功能的研究方案，且对一个特定基因功能进行全面、系统的研究。相信通过广大研究者的努力创新、国际间的广泛合作以及新技术新方法的开创和应用，还会有更多更好的方法出现。在不久的将来，我们能够更全面了解基因组的功能，完成生命周期表的制作，认识人类基因组中约 3 万个基因是如何在人类的生长、发育、疾病、衰老、死亡等过程中发挥功能及相互协调，解密生命的奥秘。
参考文献
[1]李子银，陈受宜.植物的功能基因组学研究进展[J].遗传.2000,22(1):57-60
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[4]张业勤.生物信息学在搜索水稻新基因及其功能预测中的运用[J].贵州师范大学学报（自然科学版），2011,24（3）：106-110
[5]苏红，印莉萍.插入突变在水稻功能基因组学中的研究进展[J].生物技术通报，2009,5:1-4
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[8]Schena M , Heller RA , Theriault TP ,et al. TIB Tech ,1998 , 16 (3) :
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植物基因功能诠释研究方法的新进展 (东北农业大学，150030) 摘要：本文通过阅读大量的文献，总结了植物基因功能注释研究方法的最新进展。对每种方法的原理及优缺点做了综述，拟供初学者和作相关研究者参考。 关键词：基因功能；研究方法；新进展 基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(struc tural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组(functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。功能基因组学(functional genomics)又往往被称为后基因组学(postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。[1,2]这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析，cDNA微阵列，DNA芯片等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异，因此需要建立模式生物体。 自华大基因启动“千种动植物基因组参考序列谱构建计划”和“千种植物转录组研究”以来，已完成水稻、黄瓜、马铃薯、白菜等植物的基因组序列图谱绘制，并通过对大豆的重测序研究建立了高密度分子标记图谱。这将是21世纪生命科学研究的重要领域。[3]本文将对研究基因功能的新技术及其新进展作一综述。 1 利用生物信息学方法分析基因的功能 生物信息学是利用生物信息学和电子技术(互联网技术)寻找并克隆新的未知功能的基因,着重于技术和操作层面,利用生物信息学对新基因进行电子克隆,及克隆该新基因的序列后对其进行简单的功能分析,如基因的编码区、启动子区、内含子/外显子、翻译启始位点和翻译终止信号预测,基因的同源比对,编码的氨基酸辨识蛋白质,蛋白质的物理性质,蛋白质的二级/三级结构、特殊局部结构以及功能预测等[4]。 1.1 通过序列比对预测基因功能
兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述 题目：基因敲除技术研究进展 作者：王振宇 学号：201207744 指导教师：谢放 完成日期：2014-7-16
基因敲除技术研究进展 摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、
程论文（作业）封面（2011 至2012 学年度第 2 学期）课程名称：_ ___ 课程编号：___________ 学生姓名：__ ________ 学号：_______ 年级：__ ___________ 任课教师: _ ____________ 提交日期：年月日成绩：__________________ 教师签字：__________________ 开课---结课：第周---第周评阅日期：年月日
植物的功能基因组学研究进展 摘要:基因组研究计划包括以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为 目标的功能基因组学两方面的内容。目前基因功能鉴定的方法主要有:基因表达的系统分析(SAGE) 、cDNA 微阵列、DNA(基因) 芯片、蛋白组技术以及基于转座子标签和T-DNA 标签的反求遗传学技术等。本文对上述各种技术的优缺点以及它们在植物基因功能鉴定中的应用进行了综述。 关键词:功能基因组学; 基因表达的系统分析;cDNA 微阵列;DNA 芯片;蛋白组 以拟南芥和水稻为代表的植物基因组研究已取得了迅速的进展,到目前为止,占拟南芥基因组(100Mb) 近三分之一的DNA 序列已被测定并在GenBank 数据库中登记注册,预期到2001 年通过全球合作将完成拟南芥全基因组的序列测定工作。随着植物基因组计划的实施和进展,GenBank 中累积了大量的未知功能的DNA 序列,如何鉴定出这些基因的功能将成为基因组研究的重点课题, 因此, 基因组研究应该包括两方面的内容: 以全基因组测序为目标的结构基因组学(structural genomics) 和以基因功能鉴定为目标的功能基因组研究, 后者往往又被称为后基因组研究。功能基因组研究的内容是利用结构基因组所提供的信息, 发展和应用新的实验手段系统地分析基因的功能〔1 〕。目前人类和酵母的功能基因组研究已经全面展开, 尤其是对已完成全基因组测序的酵母来说, 其功能基因组研究任务更加紧迫。植物的基因组研究虽然起步较晚, 但由于吸取了人类基因组研究中积累的一些经验, 所以进展也相当迅速, 对植物功能基因组学的研究目前也已经受到重视, 在1998 年12月出版的最新一期Plant Cell (10 :1771) 和Plant Physiol . (118 :713) 上均编发了关于植物功能基因组学研究的编者按, 并由Bouchez 和Hofte (1998) 〔2 〕综述了植物尤其是拟南芥功能基因组学研究的现状, 本文在此基础上综述了目前植物功能基因组学研究中使用的主要技术手段以及最新的研究进展。 1 基因功能的含义 基因的功能主要包括: 生物化学功能, 如作为蛋白质激酶对特异的蛋白质进行磷酸化修饰; 细胞学功能, 如参与细胞间和细胞内的信号传递途径; 发育上的功能, 如参与形态建成等。目前,获得一段DNA 序列的功能信息的最简单的方法是将该DNA 序列与GenBank 中公布的基因序列进行同源性比较,如利用BLASTn 和BLASTx 两种软件分别进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较等。同源性比较的结果大体可以分为如下类型: 与生化和生理功能均已知的基因具同源性; 与生化功能已知的基因具同源性, 但该基因的生理功能未知;与其它物种中生化和生理功能均未知的基因具同源性; 虽与生化和生理功能均已知的基因具同源性, 但对该基因功能的了解尚不深入, 仍停留在表观现象上。上述同源性检索分析方法仅仅为该DNA 片段的功能提供了间接的证据,对基因功能的直接证据还需要实验上的数据。Bouchez 和Hofte (1998)〔2 〕将所需要的实验证据归纳如下: (1) 通过研究基因的时空表达模式确定其在细胞学或发育上的功能, 如在不同细胞类型、不同发育阶段、不同环境条件下以及病原菌侵染过程中mRNA 和/ 或蛋白质的表达的差异等。(2) 研究基因在亚细胞内的定位和蛋白质的翻译后调控等。(3) 利用基因敲除(knock - out) 技术进行功能丧分析或通过基因的过量表达(转基因) 进行功能获(gain2of2function) 分析,进而研究目的基因与表型性状间的关系。(4) 通过比较研究自发或诱发突变体与其野生型植株在特定环境条件下基因表达的差异来获取基因功能的可能信息。 2 植物的表达序列标记(EST) 与基因组大规模测序 通过从cDNA 文库中随机挑取的克隆进行测序所获得的部分cDNA 的5′或3′端序列称为表达序列标记( EST) ,一般长300～500bp 左右, 利用EST作为标记所构建的分子遗传图
转基因动物技术应用研究进展 摘要：本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述，重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述，最后对转基因技术的发展前景作了展望。 关键字：动物转基因技术；应用；展望 Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals And their Application Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods.The application and prospect of transgenic technology was also discussed. Key words: animal gene transfer technique; application;prospect 动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达。自Palmiter等[1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。 1 转基因动物技术 1.1 显微注射法 这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法,创始人是Jaenisch和Mintz等,Gorden等[2]和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中DNA的复制过程,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。 1.2 逆转录病毒载体导入法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,
植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (2): 200?207, https://www.doczj.com/doc/0213292238.html, 收稿日期: 2006-05-26; 接受日期: 2006-08-26 * 通讯作者。E-mail: yuanbeauty@https://www.doczj.com/doc/0213292238.html, .专题介绍. 芸薹属植物比较基因组学研究进展 李媛媛, 傅廷栋, 马朝芝* 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 武汉 430070 摘要 芸薹属(Brassica )植物是双子叶植物比较基因组学研究的重点对象。经过十几年的研究, 芸薹属植物比较基因组学研究已取得很大进展。宏观共线性和微观共线性两个层次的研究均发现, 芸薹属植物之间以及芸薹属和拟南芥之间都存在广泛的共线性, 表明拟南芥信息在芸薹属中具有重要应用价值。芸薹属作物基因组内存在着多个拷贝的共线性区域, 支持二倍体芸薹属作物起源于多倍体祖先的假设。 关键词 芸薹属, 比较基因组, 拟南芥, 宏观共线性, 微观共线性 李媛媛, 傅廷栋, 马朝芝 (2007). 芸薹属植物比较基因组学研究进展. 植物学通报 24, 200?207. 比较基因组学(comparative genomics)又称比较遗传学, 是指在不同物种之间利用共同的标记构建图谱或对不同物种基因组相应部分(或全部)区域进行测序, 比较它们之间的基因数目、相对位置、结构关系等, 以揭示不同物种之间的基因家族成员数目和排列顺序的异同。一般来讲, 比较基因组学主要包括两个方面: 基于遗传图谱的宏观共线性和基于物理图谱或测序的微观共线性。目前, 禾本科植物的比较基因组研究最为透彻,而芸薹属(Brassica )植物则是双子叶植物比较基因组学研究的重点对象。从20世纪90年代至今, 经过十几年的历程, 芸薹属植物比较基因组学研究已在宏观共线性和微观共线性两方面都取得了较大进展。 1 芸薹属植物基因组概况 芸薹属是十字花科(Cruciferae)植物中最重要的一个属,包含许多有重要经济价值的油料、蔬菜和饲料作物。从细胞遗传学角度讲, 芸薹属栽培种包括白菜(B. rapa ;AA , 2n = 20)、甘蓝(B. oleracea ; CC , 2n = 18)和黑芥(B. nigra ; BB , 2n = 16) 3个二倍体基本种以及甘蓝型油菜(B. napus ; AACC , 2n = 38)、芥菜型油菜(B.juncea ; AABB , 2n = 36)和埃塞俄比亚芥(B. carinata ; BBCC , 2n = 34) 3个四倍体复合种。种间人工合成的研究结果表明, 白菜、甘蓝和黑芥为3个基本染色体种,它们通过相互杂交和自然加倍而形成了现在的四倍体种,这就是著名的禹氏三角(U, 1935)。通过对核DNA 含量的计算, 推测二倍体芸薹属基因组约为拟南芥基因组(125 Mb)的3－5倍, 而四倍体芸薹属基因组则是拟南芥基因组的10倍左右(Bennett and Sm ith, 1976;Arumuganathan and Earle, 1991)。 2 芸薹属植物比较遗传图谱 比较遗传作图是利用一个种的基因或者基因的部分片段或者遗传标记, 通过遗传学的方法在其它的物种中寻找其同源序列及构建相应的遗传标记图。芸薹属植物比较遗传图谱研究可对芸薹属植物之间的结构、亲缘关系及其进化演变提供分子水平的证据; 特别是芸薹属和拟南芥的比较遗传作图, 将大大增加芸薹属中可供利用的遗传标记。近年来, 芸薹属植物之间以及芸薹属植物与拟南芥之间的比较遗传作图研究都取得了一些重要结果。 2.1 芸薹属植物之间的比较作图 芸薹属不同种基因组的比较研究首先是在白菜和甘蓝之
第9卷 第1期2007年3月 衡水学院学报 J o u r n a l o f H e n g s h u i U n i v e r s i t y V o l.9,N o.1 Ma r.2007植物功能基因组学及其研究技术 崔兴国 (衡水学院 生命科学系,河北 衡水053000) 摘 要:植物基因组的研究已经由以全基因组测序为目标的结构基因组学转向以基因功能鉴定为目标的功能基因组学研究.植物功能基因组学研究是利用结构基因组学积累的数据,从中得到有价值的信息,阐述D N A序列的功能,从而对所有基因如何行使其职能并控制各种生命现象的问题作出回答.近年来植物功能基因组学的研究技术主要包括表达序列标签、基因表达的系列分析、D N A微阵列和反向遗传学等.对植物功能基因组学的研究将有利于我们对基因功能的理解和对植物形状的定性改造和利用. 关键词:植物;功能基因组学;研究技术 中图分类号:Q3-3 文献标识码:A 文章编号:1673-2065(2007)01-0023-04 基因是细胞的遗传物质,决定细胞的生物学形状,细胞的生物学功能最终是由大量的基因表达完成的.随着人类基因组“工作框架图”的完成,生命科学研究的重点已经从结构基因组学转移到了功能基因组学的研究,特别是模式植物拟南芥(A r a b i d o p-s i s t h a l i a n a)和水稻(O r y z a s a t i v a)基因组测序的完成,公共数据库中已经积累了大量基因序列信息,获得了许多与植物发育相关的功能基因,在此基础上应用实验分析方法并结合统计和计算机分析来研究基因的表达、调控与功能,并相应诞生和发展了一批新的研究技术,为功能基因组学的研究提供了必要而有效的技术支撑.功能基因组学研究的最终目标是解析所有基因的功能,即从基因水平上大规模批量鉴定基因的功能,进而全面研究控制植物生长发育及响应环境变化的遗传机制,在基因组序列与细胞学行为之间起到桥梁作用,共同承担起从整体水平上解析生命现象的重任. 1 植物功能基因组学研究 植物的生长和发育是一个有机体或有机体的一部分形态建成和功能按一定次序而进行的一系列生化代谢反应的总合,反应在分子水平上,它要求相应的遗传代谢途径必须按照特定的时空次序严格进行以保证正常发育.植物功能基因组研究就是要利用植物全基因组序列的信息,通过发展和应用系统基因组水平的实验方法来研究和鉴别基因组序列的作用;研究基因组的结构、组织与植物功能在细胞、有机体和进化上的关系以及基因与基因间的调控关系;从表达时间、表达部位和表达水平3个方面对目的基因在植物中的精细调控进行系统研究.当前植物功能基因组学研究主要集中于一年生的拟南芥与水稻两个物种上,这主要是由于它们的遗传背景清楚,基因组较小,基因结构简单而且易于进行分子生物学操作.拟南芥研究组“2010计划”的宏伟目标是充分利用拟南芥基因组计划获得的序列信息并结合功能基因组研究技术来获知其25000个基因的全部功能,例如开花的诱导过程是植物生活周期中最奇妙的过程,目前从拟南芥中鉴定了提早开花和延迟开花的多种突变体,显示植物开花受多个遗传基因的控制,如延迟开花的两个突变体是由等位基因 C O(C O N S T A N S)和L D(C O L D L U M I N I D E P E N- D E N S)突变引起,这两个基因均已被克隆,并使其在转基因植物的叶片中进行表达,将C O基因转移到拟南芥中,高效表达C O蛋白的转基因植株即使处于短日照条件下也会开花,这说明C O基因具有激活开花基因的作用.对模式植物功能基因组的研究将有助于整个植物基因组学的研究. 目前的功能基因组研究主要包括以下几个方面:(1)c D N A全长克隆与测序;(2)获得D N A芯片 ①收稿日期:2006-10-12 作者简介:崔兴国(1963-),女,河北冀州市人,衡水学院生命科学系副教授.
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
植物功能基因组学概述 XXX* (XXXXX) 摘要：植物功能基因组学是从整体水平研究基因的功能及表达规律的科学。对植物功能基因组学的研究将助于我们对基因功能的理解和对植物性状的定性改造和利用。本文简要介绍了植物功能基因组学的概念、研究内容和研究方法。 关键词：植物；功能基因组学；ESTs；SAGE Summarize of Plant Functional Genomics XXX （XXXXX） Abstract：Plant functional genomics studies provide a novel approach to the identification of genome-wide gene expression. It is currently being widely focused on the gene expression by transcript profiling and takes us rapidly forward in our understanding of plant biological traits. In this review, comprehensive of concepts, research contents and methodologies regarding plant functional genomics and transcript profiling are described. Key words: Plant; functional genomics; ESTs; SAGE 1 植物功能基因组学 基因组学(Genomics)是20世纪最后10年研究最活跃的领域之一。基因组学是指对所有基因的结构和功能进行分析的一门学科, 1986年由美国科学家Thomas Roderick提出, 兴起于20世纪90年代[1]。基因组学研究分为结构基因组学( structural genomics) 和功能基因组学( functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段, 以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主, 以研究基因序列为目标。功能基因组学(Functional genomics)的研究又被称为后基因组学(Post genomics)研究，它是利用结构基因组学提供的信息和产物，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向对多个基因或蛋白质同时进行系统研究。 植物功能基因组学是植物后基因时代研究的核心内容,它强调发展和应用整体的(基因 组水平或系统水平)实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能,其特点是采用高通量的实验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究。基本策略是从研究单一基因或蛋白质上升到从系统角度研究所有基因或蛋白质。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是两种最常用的模式植物。目前, 功能基因组学在水稻、拟南芥等模式植物中取得了较快进展, 主要原因在于这两种植物已完成全基因组测序工作[2], 获得了结构基因组数据, 且遗传背景清楚, 易于开展分子生物学研究, 已率先步入后基因组时代。 2 植物功能基因组学研究内容 2、1基因组多样性研究[1] *联系人Tel：XXXXX；E-mail：XXXXX
基因组学课程论文 题目：植物基因组学的的研究进展姓名：秦冉 学号：11316040
植物基因组学的的研究进展 摘要：随着模式植物——拟南芥和水稻基因组测序的完成，近年来关于植物基因组学的研究越来越多。本文主要对拟南芥、水稻2种重要的模式植物在结构基因组学、比较基因组学、功能基因组学等领域的研究进展以及研究所使用的技术方法进行简单介绍。 关键词：植物；基因组学；研究进展 The recent progress in plant genomics research Abstract: With the completion of genome sequencing ofthe model plant-- Arabid opsis and rice，more and more researches on plant genomics emerge in recent yea rs. The research progress of the 2 important model plant--Arabidopsis and rice in structural genomics,comparative genomics,functional genomics and technology methods used in this research are introduced briefly in this paper. Keywords:plant; genomics; research advances 前言 基因组是1924年提出用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。1986年由美国科学家Thomas Roderick提出的基因组学是指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱）、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学。自从1990年人类基因组计划实施以来，基因组学发生了翻天覆地的变化，已发展成了一门生命科学的前沿和热点领域。而植物基因组研究与其他真核生物和人类基因组研究有很大的不同。首先，不同植物的基因组大小即使在亲缘关系非常近的种类之间差别也很大; 其次，很多植物是异源多倍体，即便是二倍体植物中有些种类也存在较为广泛的体细胞内多倍化( endopolyp loidy）现象[1]。基因组研究主要包括三个层次:①结构基因组学，以全序列测序为目标，构建高分辨率的以染色体重组交换为基础的遗传图谱和以DNA 的核苷酸序列为基础的物理图谱。②功能基因组学，即“后基因组计划”，是结构基因组研究的延伸，利用结构基因组提供的遗传信息，利用表达序列标签，建立以转录图谱为基础的功能图谱( 基因组表达图谱），系统研究基因的功能，植物功能基因组学是当前植物学最前沿的领域之一。③蛋白质组学，是功能基因组学的深入，因为基因的功能最终将以蛋白质的形式体现。 近来，以水稻( Oryza sativa）和拟南芥(Arabadopsis thaliana）为代表的植物基因组研究取得了很大进展，如植物分子连锁遗传图谱的构建，在此基础上，已经在植物基因组的组织结构和基因组进化等方面得到了有重要价值的结论; 植物基因组物理作图和序列测定的研究集中于拟南芥和水稻上; 植物比较基因组作图证实在许多近缘植物甚至整个植物界的部分染色体区段或整个基因组中都存在着广泛的基因共线性，使得我们可以利用同源性对各种植物的基因组结构进行研究、分析和利用。本文主要对拟南芥、水稻2种重要的模
基因打靶技术 【摘要】基因打靶技术是建立在同源重组技术之上,可对基因组进行定位修饰的实验方法。本文简述了基因敲除技术的基本原理、打靶策略、筛选机制,在动植物和微生物中常用的基因敲除方法以及基因打靶的应用。 基因敲除技术是研究功能基因作用的重要方法, 是后基因组时代的重要研究内容。 。 【关键词】基因打靶;同源重组;打靶策略;筛选机制 一．前言 发展历史： 基因敲除（gene knockout）又称基因打靶（Gene targeting） 是自20 世纪80 年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，。早在80年代初,人们就开始研究在哺乳动物基因组中,存在使外源DNA与现存同源序列同源重组 的可能性。1985年, Smithies及其同事的研究使之得到确证。同期的相关研究证明了鼠多能 干细胞系具有诱发小鼠产生种系组织的能力,甚至在长期培养后仍存在,导入这些细胞器系的突变可以传给后代。其传统概念是指同源重组敲除技术即利用DNA 转化技术，将构建的打靶载体导入靶细胞后，通过载体DNA 序列与靶细胞内染色体上同源DNA 序列间的重组，将载体DNA 定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或 与靶细胞基因组上某一确定片段置换，从而达到基因敲除的目的[5]。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功 的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。所以，基因敲除的基本原理是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的一种分子生 物学技术。 二．主题 1基因打靶的基本原理 绝大多数的基因打靶策略都是基于同源重组( homologous recombination)的机制。同 源重组是指发生在非姐妹染色单体( sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序 列的DNA分子之间或分子之内的重新组合,普遍存在于噬菌体、细菌和真核生物中。
1.基因组的结构和变异 2.分子标记连锁图谱构建基因 3.QTL定位的原理和方法 4.QTL精细定位 5.基因和QTL的可隆 5.1插入突变方法 5.2图位克隆的方法(含比较图位克隆) 5.3候选基因法 6.资源评估和利用 7.分子标记辅助选择(含分子设计育种) 8.转基因 8.1转基因体系和实证研究 8.2转基因的生态学安全研究 9.比较基因组 9.1标记水平比较基因组 9.2序列水平的比较研究 9.3性状水平的比较研究 9.4功能比较研究 10.***优势研究 10.1遗传学解释 10.2分子生物学解释 11.分子进化(主要是玉米进化) 12.基于连锁不平衡的关联分析 12.1实证研究 12.2方法学研究 13.基因组研究中的一些新技术运用 13.1DNA芯片技术 13.2 DNA shuffling 13.3Gene Trap 13.4 Gene therapy in plants 13.5 TILLING 技术 1.植物基因组的结构和变异 在越来越多的植物基因组被测完后,该研究的重要性逐渐显现,该方面的文章可以说是汗牛充栋.在玉米方面该领域的大牛是Buckler, ES; Messing, J, Dooner HK, Doebley J ; Gaut, BS. 1. Buckler, E. S., Gaut, B. S. and McMullen, M. D. (2006) Molecular and functional diversity of maize. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 172-176 这是关于玉米基因组结构的REVIEW文章,先了解大概,在细读研究文章.其任何2个玉米自交系之间的遗传变异大于人和大猩猩之间的差异的经典论断充分说明玉米变异的广泛性.最近因为人类基因组研究的进展而似乎可以改写. 2.Messing J, Dooner HK. Organization and variability of the maize genome. Curr Opin Plant Biol.
四川大学实验报告 题目：的提取与检测植物基因组DNA一、实验目的 1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理； 2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。 二、实验原理 1.在液氮中对植物组织进行研磨，破碎细胞； 2.SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来； 3.苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质； 4.上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA溶； 5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 三、实验材料 1.设备 移液器，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心管 2.材料 植物幼嫩叶片 3.试剂 （1）细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇（去除酚类） （2）氯仿:异戊醇（24:1） （3）其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液 四、方法和步骤 0C水浴（金属浴）中加热备用；μ500L细胞提取液于651、取2、研钵用液氮预冷，新鲜植物叶片（自来水清洗，蒸馏水冲洗干），去除叶脉，剪成细条状，置于研钵中研磨成粉末状（越细越好）； 0C预热的细胞提取液中，迅速摇匀，65500、取0.1g粉末（大约两勺半）转移至
植物功能基因组学研究技术的发展 摘要：随着植物基因组学的发展，植物研究的热点转向了功能基因组学。如何确定大量的基因序列的功能，并进而了解基因与基因之间通过其代谢产物而形成的控制生物体代谢和发育的调控网络是功能基因组学研究的核心问题。在植物功能基因组学研究中，多摒弃原来传统的技术而采用新发展的方法，既省力又节源的研究基因的功能。 关键词：功能基因组学；表达序列标签技术；代谢组学；RNA干扰 二十一世纪以来，基因组学在各种模式生物基因组测序的完成的基础上发展迅速。基因组学已经产生很多个分支，比如结构基因组学，功能基因组学，比较基因组学等。其中，结构基因组学是基因组学发展的初级阶段，以建立生物的高分辨率遗传图和物理图为主。功能基因组学则代表基因组学发展的新阶段，是利用结构基因组学所提供的信息，发展和应用新的研究方法，从单一基因或蛋白质的研究转向多基因和多蛋白质的综合研究的一门学科，又被称为“后基因组学”。植物功能基因组学是植物后基因时代研究的核心内容，它强调发展和应用整体的实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能，其特点是采用高通量的实验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是两种最常用的模式生物，近年来小麦的功能基因组学研究也在进行，主要集中于基因组中转录表达的部分。 1 植物功能基因组学中的分子标记 如何快速高效的从基因组中获取生物信息，是一个急迫并且有挑战性的课题。然而，表达序列标签（Express Sequence Tags，EST）的出现成为结构基因组学和功能基因组学连接重要依据。EST是从cDNA序列中获得的有特异性特征，能特指某个基因，它的发展成为功能基因组学发展的基础，Genbank中积累的大量EST序列不仅为新基因的发现提供帮助，而且为开发基于PCR的各种分子标记提供资源，如EST-SSR，CAPS，SNP，SRAP和TRAP等。截止2000年数据库dbEST中的主要信息统计如表1所示。
植物抗逆基因研究进展 杨 柳1,2,张振乾1,2,宋继金3,谭太龙1,2,官春云1,2,刘忠松1,2 (1湖南农业大学农学院,长沙410128;2国家油料改良中心湖南分中心,长沙410128; 3芷江县农业局粮油站,湖南芷江419100) 摘 要:干旱、高温、低温、高盐等极端条件对植物生长造成严重的危害,对农业生产造成相当大的影响。为了减轻其不利影响,目前采用分子生物学的方法,在基因组成、表达调控及信号转导等分子水平上认识植物抗逆机理,通过基因工程手段导入抗逆相关基因,改良作物的胁迫抗性。综述了植物抗逆相关基因的克隆、功能验证以及应用等方面的进展。 关键词:植物;抗逆性;基因工程 中图分类号:Q789 文献标识码:A 文章编号:1001-5280(2010)02-0126-04 干旱、盐碱、金属离子和低温等逆境条件严重抑制植物生长发育,会引起植物植株生理生化、形态等方面的变化,甚至死亡。因此,开展抗逆研究、提高作物抗逆能力,能够使作物增产稳产。随着分子生物学的发展,借助分子生物学手段,从基因组成、表达调控及信号转导等方面进行深入研究,揭示抗逆的分子机理,并导入相关基因改良作物的胁迫抗性,近年来取得较大进展,在农作物抗逆育种上展示出了广阔的应用前景。 1 抗旱 当植物耗水大于吸水时,会使组织内水分亏缺,过度水分亏缺的现象称为干旱。旱害则是指土壤水分缺乏或大气相对湿度过低对植物的危害。干旱对植物生产的不利影响主要有:(1)降低细胞含水量,破坏细胞膜系统;(2)增加透性,降低光合作用;(3)使植物的物质代谢紊乱,生长发育迟缓、死亡。干旱胁迫可激活相关基因,如LEA蛋白、抗氧化酶和水孔蛋白等的转录,并导致编码蛋白的积累。植物抵抗旱害的能力称为抗旱性。 1.1 晚期胚胎发生富集蛋白(LEA蛋白) LEA蛋白在植物胚胎发育后期的种子中大量积累,低温、重金属、高盐,特别是干旱等逆境刺激均能诱导其转录和累积。LEA蛋白在逆境中有脱水保护、渗透调节和清除自由基活性等作用[1,2]。LEA蛋白有LEA1～LE A66类,其中LE A1～LEA3与植物抗逆 收稿日期:2010-04-24 作者简介:杨 柳(1982-),女,湖南岳阳人,硕士,从事油菜育种研究。通讯作者:刘忠松。 基金项目:国家科技支撑计划项目(2009BAD A8B01)。性相关。 Cheng等[1]利用基因枪法转化水稻成熟胚愈伤组织,获得转基因水稻株系,分析表明LEA2有较强的抗脱水作用。Stra ub等[3]研究发现,大麦HV A1(LEA3同源蛋白)与种子的干旱脱水有关,且干旱、极端温度及盐胁迫均可诱导其迅速在幼苗中表达。Xu等[4]研究转HV A1基因水稻发现,T2代对快速水分胁迫和高盐的耐受性较强,且与HV A1蛋白积累水平呈正相关,说明H V A1蛋白可防止干旱胁迫对细胞膜的损伤[5],有潜在的抗旱作用[6,7]。 1.2 水分通道蛋白(Aquaporin) 水孔蛋白存在于所有器官组织中,可分为4类[8],同一器官可表达多种不同类型的水孔蛋白[9]。水孔蛋白表达具有组织特异性,并受发育阶段和环境因素的调节。 野生马铃薯水孔蛋白ScP IP2a基因m RN A与果实成熟中细胞的扩张作用相一致[10],冰草M IP2A可能控制水分从木质部薄壁细胞流向木质部导管腔[11]。向日葵液泡水孔蛋白SunTIP7转录物在干旱胁迫下积累,表明其与干旱有关[12]。Kaldenhoff等[13]利用反义基因技术抑制拟南芥质膜PIP1b的表达,PIP1a的表达也被抑制,原生质体透性降低为对照的1/3,而根量增加5倍,说明根量的增加弥补了水孔蛋白数量的不足和导水率的降低。PIP2在拟南芥根皮层中大量表达导致根皮层水导度、渗透作用及伤流降低[14]。 1.3 Rubisco活化酶 Rubisco活化酶表达量的增加也可增强植物的抗旱性能[15]。干旱情况下,植物体内的ATP含量降低, Rubisco活化酶活性也随之降低,为减小干旱造成的不利影响,Rubisco活化酶的表达增强[16]。
TILLING技术 姓名：罗洁学号：M201071486 院系：生命科学与技术学院 摘要：TILLING技术是一种全新的反向遗传学研究方法，它提供了一种高通量，低成本，规模化和高效筛选化学诱变剂EMS诱发产生点突变的技术。本文简要介绍了TILLING技术的原理和特点，并对其在植物功能基因组学，作物品种改良和在生物进化及检测多态性中的应用作了初步探讨。 Abstract: TILLING technology is a kind of brand-new reverse genetics study method, it provides a high throughput, low cost, scalization and efficient screening chemical mutagen EMS induced produce point mutations of technology. This paper briefly introduced the TILLING technology principle and characteristics of plants, and in its functional genomics, crop cultivar improvement and in biological evolution and testing polymorphism application was discussed 关键词：TILLING技术反向遗传学点突变 前言 随着越来越多的植物的基因组测序的完成，以表型筛选为主的正向遗传学方法正逐步被反向遗传学方法替代而成为功能基因组学研究的主要方法。反义RNA抑制、RNAi和插入突变是植物中常用的用于反向遗传学研究的方法，但这3种技术均需复杂繁琐的植物转基因表达载体构建过程以及组织培养、基因转化和周期极长的转基因植物筛选过程，作为常规方法仅限应用于极少数物种[1]。 基因组靶向定位诱导损伤技术(targeting induced local lesions in genomes，简称TILLING)是美国华盛顿Hutchinson癌症研究中心以Henikoff为首的科学家发展建立的[2]。它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和Li—Cor公司生产的4300DNA遗传分析系统的双色红外荧光高通量检测技术有效结合，快速有效地从化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)诱变产生的突变群体中鉴定出点突变，这一全新的、高通量、低成本的反向遗传学研究方法大大地方便了植物基因组学的研究。在TILLING技术基础上发展起来的Ecotilling(ecotypic TILI ING)技术不用化学诱变，可以直接探知存在于特定群体中某个基因或基因群的多态性(等位基因)，识别单碱基突变(SNP)、小片段插入、微卫星重复等，为基因功能研究和生物进化提供重要信息[3]。 最初的TILLING是利用DHPLC对DNA池中的突变进行检测（McCallum et al., 2000a; 2000b）。为了进一步提高这个方法的效率，适应大规模筛选的要求，Colbert 等（2001）对TILLING 作了改进。他们将所获PCR 片段先用特异性识别错配碱基的内切酶酶切异源双链核酸分子，再用变性的序列胶电泳分离酶切产物，用标准的图像处理程序分析点突变的存在。有几种酶已经被用于错配碱基的特异性识别、切割，包括S1 核酸酶（Howard et al., 1999）和T4核酸内切酶Ⅶ（Youil et al., 1996）。目前，使用较多的是S1核酸内切酶家族中的CELI酶，它是一种从芹菜（celery）中分离出的植物所特有的核酸内切酶（Oleykowski et al.,1998）。CELI 酶能够识别错配碱基并在错配碱基的3' 端进行切割，再用变性的序列胶（PAGE）分离酶切产物，能够将超过1kb的PCR扩增产物内的点突变定位在几个碱基对内。因此，改进的TILLING 充分运用了CELI 酶和凝胶电泳技术，从而使其成为一个低成本、高通量的筛选突变基因的技术平台。 TILLING技术的基本原理是：首先是运用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变而获得突变群体，提取DNA并把多个待测样品DNA混合建立突变群体及其DNA池，然后利用特异性引物对特定DNA区段进行PCR扩增，通过变性和复性过程得到异质双链。如果有突变发生，那