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A Topological Constraints Based Sequential Data Mining Approach on Telecom Networks Alarm Data ver 4

A Topological Constraints Based Sequential Data Mining Approach on Telecom Networks Alarm Data ver 4
A Topological Constraints Based Sequential Data Mining Approach on Telecom Networks Alarm Data ver 4

A Topological Constraints Based Sequential Data Mining Approach on Telecom Network Alarm Data

Zhaogang Wang, Bin Zhang,Guohui Li

Pattern Recognition and Intelligent System Lab,

Beijing University of Posts and Telecommunications (BUPT), Beijing, China

WangZhaogang928@https://www.doczj.com/doc/20990864.html,

Abstract

The issue of fault location received extensive concern in the field of telecom network management. The data mining approaches is introduced to extract clues from the telecom alarm data for fault location. Aiming at the key problems in telecom data mining, we have made a comprehensive analysis on the telecom network and its data as well as the fault propagation,some important characteristics are discovered, a fault location oriented network model is built to serve the traditional approaches in data transforming and data mining. An enhanced data mining algorithms based on the topological constraints of the telecom network is proposed to introduce the constraints of real world to the data mining procedures. A data mining tool (PRISMiner) is implemented to benchmark the new algorithm, and our experiments shows that the new algorithm is quite effective in improving the accuracy and efficiency of the PreFixSpan mining algorithm.

1 Introduction

1.1 Backgrounds

As the evolution of the modern communication system, fault location has been focused on by many researchers. Many fault location solutions have been presented. The Expert Systems [1] and the graph theory based approaches [2] have been discussed and many of which have been adapt to industrial network management systems. The above approaches are applicable in their dissimilar fields and situations, whereas their drawbacks are also significant. To locate the root fault in the modern telecom with large network elements and different infrastructures, we need to introduce data mining approaches to fault location. The devices with faults generate many correlated alarms through the propagation path, and these correlated alarms can be extracted as frequent sequences by the data mining algorithms. The regularity of the fault propagation can be thus inferred by the frequent sequences obtained through data mining.

In telecom networks (especially mobile communication networks), the reciprocity and interaction among network devices are the root cause of fault propagation. Thus, discovering sequential patterns from alarm sequences of correlative devices seem to be more accurate and efficient [3]. Therefore, special techniques focused on data preprocessing, optimizations and constraints for mining algorithms are in demand.

1.2 Key Problems of Data Mining on Telecom Alarm Data

The data mining algorithms provide only statistical constraints to the data, neglecting the inherent relationship between the items [4]. Topologically connected devices or nodes are more likely to propagate fault than those are not. As a result, taking the actual constraints into account is a key technique to improve the accuracy and efficiency of the mining algorithms. In order to apply the constraints to telecom alarm mining, a proper model describing the topological relation of the telecom network needs to be set up in advance. This introduces a new problem: the telecom network modeling. A proper model should act like an abstract view of the network, which hides the details irrelevant to our study and emphasizes the attributes we are focused on [5].

As discussed above, an accurate and efficient telecom alarm mining system should take measures to introduce actual constraints in order to remove redundancy in pattern or sequence generation, and to build a proper telecom model to exploit the topological information of the network. Our motivation and main idea is to overcome the two key problems by proposing new approaches of constraint based mining and telecom network modeling.

1.3 Paper organization

In this section, we introduced the backgrounds of data mining for telecom network fault location and the key problems of doing that. In Section 2, a new topological constraint based mining algorithm will be proposed, including the special preprocessing approaches and the topological modeling of the telecom network. Next, in Section 3, a telecom alarm mining tool adopting the above approaches, PRISMiner, will be introduced, as well as the implementation features. A series of experiments are also designed and performed to benchmark the new approach. The future work of the mining task and fault location is discussed in the last section.

2 Topological Based Sequential Mining Algorithm on Telecom Alarm Data

The characteristics of the alarm data give us some obstacles of scanning the telecom network alarm data for clues of fault location. As a result, we proposed a particular approach for telecom network modeling and data preprocessing to overcome the difficult of the imperfection and noise of data. To improve the accuracy and efficiency of the mining algorithm, an improved PreFixSpan Algorithm equipped with the topological constraint based algorithm is proposed. The following section tries to give detailed descriptions of the network modeling, preprocessing approach, and the improved PreFixSpan.

2.1 Topological Constraints Oriented Telecom Network Modeling

According to the analysis to the telecom network structure and its fault propagation, we conclude that the alarms are propagated through the network topology. To exploit the structural information and regularity of fault propagation in preprocessing and the mining algorithm, we need to set up a model to indicate the topological relationship of the network. As we are using the model to indicate the fault propagation, the model should be an abstract of the connectivity of network elements, especially those are topologically connected. Topologically connected network element may generate alarms because of the same fault, which hence make up of the propagation path. The alarm may propagate from lower layers to higher layers, and vice versa. However, no matter how the alarms propagate, the path is limited within a network element cluster, which is defined as the set of topologically connected network elements. The network element cluster is a model of the network fault propagation path. Thus, to determine whether some specific alarms are topologically connected, is to determine whether the alarms are included in the same cluster. Our aim is to design an algorithm to generate clusters from telecom structures.

We can divide the telecom network elements into several subnets according to their functions. In fact, network elements of different subnet have different ways of inter connections. In general, network elements can be divided into two main categories: common network elements and private connected network elements. The common network elements are connected any other network elements logically or physically. On the other hand, the private connected network elements are only connected with elements of the same the subnet. Firstly, we filtered out the common network elements, whose device types are recorded to form the public connected cluster. Secondly, we come to deal with the private connected elements. The ways of connections between private connected elements differs from subnets. As for the voice subnet, which has the most numerous elements, connections doesn’t exist between any two elements, but only among specific number of elements. According to the analysis to the propagation path, we find the topologically connected elements from the lowest BTS to elements of upper layers. Each group of elements’ on the same propagation path is treated as a voice subnet cluster, leading by a BTS. The clusters are then consists of device IDs of topologically connected elements.

Subnets other than the voice subnet, such as the GPRS subnet and the Intelligent subnet has less number of elements, so they are treated as special clusters respectively. Special clusters also include those groups of elements that are probably topologically connected. For instance, the high level elements of voice subnet might be horizontally connected (not through a common fault propagation path), are thus treated as special clusters.

These categories of clusters make up the topological constraints oriented telecom network model. The model can help to determine whether some specific network elements are topologically connected via the following algorithm: Topological Constraint Algorithm:

Function IsTopoConnected

Input:Array,Precision,CommonCluster,VoiceClusters, SpecialClusters

Output: Whether the Array of elements are topologically connected

Temp ←Φ

For i ← 1 to Array.size

If (Array[i] not in CommonClusters)

Temp.add(Array[i])

N←0

For i ← 1 to Temp.size

If (Temp[i] in SpecialClusters)

N←N+1

If (N >= Temp.size * Precision)

Return true

Else

N←0

For i ← 1 to Temp.size

If (Temp[i] in VoiceClusters)

N←N+1

If (N >= Temp.size * Precision)

Return true

Else

Return false

The algorithm ignores the common cluster elements of the input elements, as they are definitely connected with other elements. The return value indicates whether the input elements are partial or completed connected within the same cluster. This algorithm can be easily used to generate transactions and sequences in data transforming as well as data mining.

3.2 Telecom Network Alarm Data Preprocessing

The raw telecom alarm data need to be transformed into well-formed data ready for mining. However, the input format of typical pattern and sequence mining algorithms are not relational. Pattern mining algorithms require transaction data while the sequence mining algorithms require sequence data.

The traditional method of transforming relational data into transactions and sequences is the fixed sliding window method. Giving a specific time window length, the alarms occurs within the time window is put into a transaction and the order of occurrence of the alarms of the same transactions are ignored. In order to avoid that some continuous alarms are separated due to the window border, the overlapped window skill are introduced. The sliding step of the fixed window is half or 1/3 of the window length, thus some alarms might occur twice in different transactions, but continuous alarms are not likely to be separated. Based on the transactions, use a smaller fixed sliding window to generate sequences. Another fixed window shorter than the transaction window is adapted inside the transaction alarms. The alarms occurred in the same small sliding window is put into an element. The order of occurrence of alarms within an element is ignored while the order of elements is not exchangeable.

The fixed sliding window is simple to implement, but might not be suitable for the telecom alarms. Although the overlapped window can avoiding adjacent alarms form being separated, yet not all the correlated are temporal adjacent. According to the analysis from the previous section, the propagation of alarms are through the topological connections between network elements, but not limited to a fixed time span. Some propagation may take a long time while some may be shorter. As a result, the selection of alarms to generate transactions and sequences should be based on the topology constraint rather than a fixed time window.

Thus, we proposed a topology based overlapped sliding window method to transform relational data into transactions, and further into sequences. The start point of the window is sliding down from the time line with a small step of time span, in order to include any possible starts of the propagation sequence. The end of each window is no longer determined by a fixed length of time window, but by the topological relationship between adjacent alarms. The newly covered alarms are included in the transaction if and only if they are topological connected with the former ones that are already included in the transactions. If the newly covered alarm are topological irrelevant, the window continue to grow until it reaches a specific threshold. Thus, the transactions only contain topological connected alarms, which are far more refined than the ones generated by the fixed window method. Same method can be adapted to transactions to generate sequences.

3.3 Topological Constraints Data Mining on Telecom Alarm Data

We exploit the data mining algorithms on telecom alarm data to extract the frequent alarm sequences to help the fault location. After the preprocessing procedure discussed above, the telecom data are ready for mining. However, the mining procedure might be very time consuming if the mining algorithm itself is inefficient. Therefore, we have to make a choice among the various mining algorithms to select the best one to fulfill the mining task.

The telecom alarm data is a sparse but large dataset. The frequent patterns are mainly short patterns, while long pattern only exist with low support. The telecom alarm data always have huge size. In China, a provincial telecom operator generates about 900,000 alarm records per week, with the size of 40MB, and about 5 millions alarm records per year, with the size of 2GB.

As for the sparse datasets, the Apriori-like algorithms [7] as well as the pattern growth based algorithms [8] are both suitable. But facing up to such huge sized database, trying to use the Apriori-like algorithms is obviously not a wise decision, as frequent database scanning can be a nightmare due to the huge size of the database. The pattern growth based algorithms do not need to scan the entire database in every step of iteration. Instead, the information of frequent patterns is stored in particular data structures whose size is always limited. The pattern growth based algorithms are much more efficient than the Apriori-like algorithms, especially in occasions with low support. All in all, we choose the PreFixSpan [9] Algorithm. The PreFixSpan algorithm is an efficient sequential mining algorithm, which exploit the projection database structure to store frequent patterns to avoid scanning the original database. Besides, PreFixSpan divide the result set into several disjoint subsets. Mining iterations within respective subset can be performed concurrently.

The main idea of PreFixSpan algorithm is to search the frequent patterns in the projection database rather than the original database. The PreFixSpan algorithm employed the pattern growth methodology and the divide-and-conquer strategy, and it’s hence very efficient. However, the PreFixSpan algorithm only obtains the statistically frequent patterns, which is only not definitely indicating meaningful rules. Some items, say noises, only happen to occur together for many times. The traditional mining algorithms, including PreFixSpan cannot distinguish the really associated items from those occasionally frequent co-occurring items. Thus, as discussed above, the constraint from real world models have to be introduced to solve the problem. We exploit the Topological Constraint Algorithm in the PreFixSpan algorithm in the following routine:

Procedure: Topological Constraint Based PreFixSpan: Input: Prefix, Projection DB, Min.Support

Output: Frequent Patterns

N ← All frequent items in Projection DB

For each item x in N

P ← Append x to Prefix

If support (p) >= Min.Support

and IsTopoConnected(p)

Output p

Call Topological Constraint Based PreFixSpan

with p, ProjectionDB w.r.t. p, Min.Support The underlined statement is the core step of our approach. Differing from the original PreFixSpan, a new frequent pattern has to be both frequent (frequent than the Minimal Support) and topologically connected, then it can grow to generate longer patterns recursively. With this added constraint, patterns from the occasionally co-occurring items are pruned in the recursive tree, thus huge computation time consumed on these meaningless patterns are saved, and the

accuracy is improved as well. In next section, experiments will be performed to benchmark the new approach.

4 Experiments and Conclusions

4.1 Introduction to the Experiment Platform

To implement and benchmark the algorithms and approach we proposed, a data mining tool is designed and developed as the experiment platform. The tool named PRISSMiner is designed to perform and benchmark data mining algorithms for fault location tasks. The tool consists of three components: data preprocessing, data mining and algorithm benchmarking.

The data preprocessing component refines the raw alarm data to remove the redundancy and noise and transform the data into the format ready for mining. The data mining components is an implementation of 6 data mining algorithms, including 4 non-sequential ones : Apriori[7], FP-Growth[8], Eclat[9], Relim[10], and 2 sequential ones: GSP[11] and PreFixSpan[12]. Each algorithm can be equipped with the Topological Constraint Algorithm if the users prefer to. The algorithms are implemented in C++, and the STL containers are employed to build the basic data structures of the algorithms. The outputs as well as the performance statistics of the algorithms are stored in specific files for benchmarking. The benchmarking component sets a unified standard to all algorithms. The outputs and the performances are listed in a predefined table to make clear comparisons. The benchmark table can be easily exported to text file for chart drawing with other tools.

The following experiment is performed with the PRISMiner to benchmark the approaches we proposed with the baseline approaches.

4.2 Experiment design and result analysis Experiment 1 Fixed sliding window vs. Topology based in data transforming

As we claimed, the sliding window method is easy to implement, but too much of the generated transactions or sequences are meaningless as they are occasionally co-occurred. The topology based method that we proposed only combines the alarms that occurred in the same fault propagation path, and is thus more reasonable. We made a comparison between the two different ways of data transforming on the same raw data table.

Table 1 shows that the topology based is more efficient than the sliding window method. The number of generated sequence by topology based method is much less than that of the fixed window. But more refined frequent patterns are mined in turn. The algorithms execution time of topology based method is much less than the fixed window method, as the meaningless sequences are suppressed.

Table 1 Fixed sliding window method vs. Topology based method Sup.

Way of

transforrm

Time for

Transform

Time for

Execution

#Original

Records

# Seqs #patterns 0.5 F.S.W 23s109ms 4m1s609ms 69715 1349 24

0.3 F.S.W 23s109ms 17m17s94ms 69715 1349 188 0.1 TopoBased 20s750ms 125ms 69713 796 13

0.05 TopoBased 20s750ms 172ms 69713 796 36

0.03 TopoBased 20s750ms 250ms 69713 796 102 0.01 TopoBased 20s750ms 704ms 69713 796 636

24

188

0013

36

102

636

100

200

300

400

500

600

700

0.50.30.10.050.030.01

#

p

a

t

t

e

r

n

s

Support

F.S.W

Figure 1 Results of PreFixSpan Using the Fixed Sliding Window Method vs. Topology Based Method for Data Transform Figure 1 shows that, as for low support mining, the topology based method generated data contribute much more patterns than the fixed window, while the latter one can hardly get any result in tolerable time. So it is more appropriate to use the constraint based method for sparse datasets as telecom alarm records.

Experiment 2 Constraint based PreFixSpan with original PreFixSpan

We made a comparison between the topological constraint based PreFixSpan with the original version on the same data set. The result is show in Table 2.

Tabl e 2 Constraint based PreFixSpan vs. Original PreFixSpan Sup. IsTopoConstraint

Time for

Execution

#patterns

0.5

No 3m34s390ms 24

Yes 4m1s609ms 19

0.3

No 71m31s140ms 195

Yes 17m17s94ms 188

From the table, we see that the time of PreFixSpan consume is largely reduce by the TopoConstraint Algorithm with support 0.3. But with support 0.5, the time increase. This is because the time cost of determining whether patterns are topologically connected is larger than the process time of the pruned patterns. In low support occasions, which are more usual, the time cost by the pruned patterns is much more than the cost to determine whether to prune them. As a result, the Constraint Based Algorithm is thus useful for most of occasions. Besides, the frequent patterns that the algorithms output has be refined. We made another comparison between the above algorithms with the GSP algorithm, which is an

apriori-like sequential mining algorithm. The result is shown in Figure 2, which shows that the number of patterns is

slightly refined both in PreFixSpan and GSP.

Figure 2 The effect of Topol ogical Constraint Algorithm to Sequential

Algorithms

4.3 Conclusions

The above experiments show that the Topological Constraint Based Algorithm is quite useful in both data transforming and data mining.

When adopted in data transforming, the method can largely reduce the number of generated sequences. With the reduction of meaningless sequences, the mining algorithm hence has an easier job to mining meaningful patterns. The topology based method can help the algorithms get results in low support while the fixed window method cannot.

When adding the topological constraint into the mining procedure, the accuracy of the results is improved. Fewer but more meaningful results are obtained. The time cost is also reduce as the meaningless patterns are pruned. The lower the support is, the significant the effect of the algorithm is.

As a result, we claim that the Topological Constraint Based Algorithm is an effective way of improving the accuracy and efficient of telecom alarm data mining. Based on the conclusion, we can further infer that the network model we build for telecom network is a proper model for fault location use, as it serves the data transform and mining quite well.

5 Future work

After the frequent sequences in the alarm data are accurately mined, it is easy to generate correlation rules, but is difficult to infer the root fault cause from the mining results. The frequent sequences indicate the alarms have a very high probability of occurring as the given order. We know that the cause takes place before the effect, but the early events are not definitely the cause of the posterior event. The frequent sequences only give a clue, and yet the approaches to infer the root cause of telecom network fault remains a popular topic.

6 Acknowledgement

This research work has been supported by IBM China Research Laboratory. Thank my mentor, Zhang Bin and Li Guohui for their guidance. Thank my classmates for the co-operation during the research and development.

7 References

[1] A. Patel, G. McDermott, C. Mulvihill. Integrating network management and artificial intelligence, in: B.Meandzija, J.Westcott (Eds.), Integrated Network Management I, North-Holland, Amsterdam, 1989, pp.647–660.

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Operations and Management, University of Delaware, Newark, DE, October 1998.

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[12] J. Pei, J. Han,etc.Mining Sequential Patterns by Pattern-Growth:The PrefixSpan Approach

纳米孔测序是极具前景的下一代测序技术

纳米孔测序是极具前景的下一代测序技术 Nanopore Sequencing 2019 - Patent Landscape Analysis 随着各种技术的新产品推出,哪些公司将在知识产权方面引领纳米孔测序? 纳米孔测序是极具前景的下一代测序技术 据麦姆斯咨询介绍,纳米孔测序是新一代测序(NGS)技术之一,被认为能够彻底革新DNA分析。随着时间地推移,目前已经开发出了不同形式的纳米孔测序技术,包括蛋白质纳米孔、固态纳米孔和复合纳米孔。该技术可以高速生成超长读数,减少样品制备时间以及将读数重组成原始序列所需要的数据处理时间。 这项新技术可以开发一个需要遗传指纹来快速识别癌症类型和病原体的全新客户群。根据DataBridge的数据,全球下一代测序市场将快速增长,市场规模预计将从2017年的48.3亿美元增长到2024年的163.5亿美元,2018~2024年期间的复合年增长率(CAGR)预计为19.2%。 目前,Oxford Nanopore Technologies是唯一一家将基于纳米孔的测序仪推向市场的公司。不过,还有其它几家公司正在开发自己的相关技术,Oxford Nanopore Technologies公司可能很快将不再是纳米孔测序仪的唯一供应商。例如,Two Pore Guys公司宣布将在2019年春季发布其产品套件。 随着新产品在未来的相继推出,了解纳米孔测序市场相关参与者的知识产权(IP)状况和策略,同时发现专利新申请人及其所带来的威胁至关重要。为此,著名市场研究机构Yole 子公司Knowmade深入调研了基于纳米孔的测序技术(蛋白质、固态和复合)及其应用(肿瘤学、植物遗传学等)中涉及的知识产权主要参与者。本报告可以帮助读者发现业务风险和机遇,预测新兴应用,支持战略决策以加强市场地位。 纳米孔测序全球专利申请趋势 对专利申请趋势的分析表明,从2008年到2013年,纳米孔测序相关的专利申请获得了重要增长。这一增长源自于学术研究团队(哈佛大学和加州大学)对纳米孔测序概念的验证。

新一代测序技术的发展及应用前景

2010年第10期杨晓玲等:新一代测序技术的发展及应用前景 等交叉学科的迅猛发展。 1.1第二代测序——高通量低成本齐头并进以高通量低成本为主要特征的第二代测序,不再需要大肠杆菌进行体内扩增,而是直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序¨】。根据其原理又可分为两类:聚合酶合成测序和连接酶合成测序。1.1.1聚合酶合成测序法Roche公司推出的454技术开辟了高通量测序的先河。该技术通量可达Sangcr测序的几百倍,而成本却只有几十分之一,因此一经推出,便受到了国际上基因组学专家的广泛关注。454采用焦磷酸合成测序法HJ,避免了传统测序进行荧光标记以及跑胶等繁琐步骤,同时利用乳胶系统对DNA分子进行扩增,实现了大规模并行测序。截止到2010年4月,已有700多篇文献是采用了454测序技术(http://454.com/publications.and—resources/publications.asp),对该技术是一个极大的肯定。 Illumina公司推出的Solexa遗传分析仪是合成技术的进一步发展与延伸。该技术借助高密度的DNA单分子阵列,使得测序成本和效率均有了较大改善。同时Solexa公司提出的可逆终止子”1也是该技术获得认可的原因之一。与454相比。Solexa拥有更高的通量,更低的成本。虽然片段长度较短仍是主要的技术瓶颈,但是对于已有基因组的物种来说,Solexa理所当然成为第二代测序技术的首选。2008年以来,利用该技术开展的研究大幅度上升,报道文献达400多篇(http://www.illumina.com/systems/genome—analyzer_iix.ilmn)o 1.1.2连接酶合成测序法2007年ABI公司在Church小组拍1研究成果的基础上推出了SOLID测序仪。该技术的创新之处在于双碱基编码…的应用,即每个碱基被阅读两次,因此大大减少了测序带来的错误率,同时可以方便的区分SNP和测序错误。在测序过程中,仪器自动加入4种荧光标记的寡核苷酸探针,探针与引物发生连接反应,通过激发末端的荧光标记识别结合上的碱基类型。目前SOLID3.0测序通量可达20G,而测序片段仅有35—50bp,这使得该技术与Solexa相比,应用范围还不够广泛。ABI公司正加快研发进度,争取在片段长度方面做出重大突破。 DanaherMotion公司推出Polonator¨1测序仪同样也是基于Church小组的研究成果,但是该设备的成本要低很多,同时用户在使用时可以根据自己的研究目的设置不同的测序条件。而CompleteGe—nomics公司推出的DNA纳米阵列与组合探针锚定连接测序法"1则具有更高的容错能力,试剂的消耗也进一步减少,目前已顺利完成3个个体基因组的测序工作。 1.2第三代测序——单分子长片段有望实现第二代测序技术虽然在各方面都有了较大的突破,但是仍然建立在PCR扩增的基础上。为了避免PCR扩增带来的偏差,科学家目前正在研制对DNA单个分子直接测序的第三代测序仪。最具代表性的包括Heliscope单分子测序仪,单分子实时合成测序法,纳米孔测序技术等。 Helicos技术仍然是基于合成测序原理¨…,它采用了一种新的荧光类似物和灵敏的监测系统,能够直接记录到单个碱基的荧光,从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。PacificBioscienees公司研发的单分子实时合成测序法充分利用了DNA聚合酶的特性,可以形象的描述为通过显微镜实时观测DNA聚合酶,并记录DNA合成的整个过程。纳米孔测序技术[11’121则是利用不同碱基在通过纳米小孔时引起的静电感应稍有不同,或者不同碱基通过小孔的能力各有差异,来加以区分不同的碱基信号。 2应用与实践 Kahvejian在2008年的一篇综述中提到¨“:“如果你可以随心所欲地测序,你会开展哪些研究?”。人类基因组计划的完成和近年来高通量测序的兴起,使越来越多的科研工作者认识到,我们对于生物界的认识才刚刚起步。基因图谱的绘制并不意味着所有遗传密码的破解,癌症基因组的开展也没有解决所有的医学难题。DNA变异的模式和进化机制,基因调控网络的结构和相互作用方式,复杂性状及疾病的分子遗传基础等,仍是困扰生物学家和医学家的难题,而高通量测序的广泛应用,也许可以让我们知道的更多。 2.1DNA水平的应用 2.1.1全基因组测序新一代测序技术极大地推

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一代测序与二代测序的区别与联系 Sanger 法测序(一代测序) Sanger 法测序利用一种DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP 缺乏延伸所需要的3-OH 基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T 或 C 处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs 和ddNTPs 的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 高通量测序(二代测序) 高通量测序技术(High-throughput sequencing,HTS)是对传统Sanger 测序(称为一代测序技术)革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing,NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 第一代和第二代测序技术 第 X 代公司 平台 名称 测序方 法 检测 方法 大约 读长 (碱基 数) 优点相对局限性 第一代ABI/ 生命 技术 公司 3130 xL-37 30xL 桑格- 毛细管 电泳测 序法 荧光/ 光学 600-1 000 高读长,准确度一 次性达标率高,能 很好处理重复序 列和多聚序列 通量低;样品制备 成本高,使之难以 做大量的平行测 序 第 一代贝克 曼 GeXP 遗传 分析 系统 桑格- 毛细管 电泳测 序法 荧光/ 光学 600-1 000 高读长,准确度一 次性达标率高,能 很好处理重复序 列和多聚序列;易 通量低;单个样品 的制备成本相对 较高

新一代测序法简介

新一代测序法简介 新一代测序方法是一种直接测序法,它既可以分析基因和DNA的组成(定性分析),也可以测定同一类型基因在表达过程中产生的数量(定量分析),以及不同类型基因或DNA 之间的差别所在(交叉对比分析)。自2004年,454测序技术发展以来,已经出现的测序产品超过六种之多。这些产品的技术特点见下表: 产家名称产品技术特点优缺点 化学反应测序方法误读率样品准备高通量程度 Roche (454 Life Science) 焦磷酸标记的链 反应 焦磷酸基 标记 <1% 较复杂,需PCR 中等 Illumina(Solexa)四色可逆终止码合成法1%—3% 较复杂,需PCR 中—高ABI(SOLID) 双色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂,需PCR 中—高Helicos Bioscience 单色可逆终止码合成法2%—8% 简单,无需PCR 高—超高Intelligent Biosystm 四色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂,需PCR 中—高 Pacific Bioscience 四色焦磷酸基标 记焦磷酸基 标记 3%—8% 简单,无需PCR 高 VisiGen 焦磷酸基标记 FRET 焦磷酸基 标记 3%—8% 简单,无需PCR 高 在这些技术中,从所分析的样本在测序前是否需要扩增,大致可以分为两类,即克隆扩增型和单分子测序型。两种类型在测序技术上区别并不大,但对结果的影响却有不小的差别。主要体现在两个方面:(1)单分子测序更能反应细胞或组织内分子的真实情况,尤其是在需要定量分析的情况下。而克隆扩增型中的PCR反应使得样品中DNA分子的扩增机会并不完全均等,这会对基因表达的定量分析造成影响;(2)单分子测序具有通量更高的优势。克隆扩增使得同一类型的分子数目急剧上升,在提高同类型分在在固相表面出现的几率同时,也降低了不同类型分子出现的机会。 面重点介绍Pacific Biosciences公司推出的Single Molecule Real Time (SMRT?) DNA Sequencing(单分子实时DNA测序)。 首先,在这一测序技术中有主要有两个关键的技术: 一、荧光标记的脱氧核苷酸避免了碱基的空间位阻效应。显微镜现在也无法实现实时看到“单分子”,但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA 链的时候,它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候,它的荧光基团就被DNA聚合酶切除,荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性,并且在荧光被切除之后,合成的DNA链和天然的DNA链完全一样; 二、纳米微孔(Zero-mode waveguide (ZMW))。因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候,DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景,这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有10nm的纳米孔,单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内,DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限,而且由于A,T,C,G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去,它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时,这种特定颜色的荧光会持续一小段时间,直到新的化学

DNA第一代-第二代-第三代测序的介绍

双脱氧链终止法又称为Sanger法 原理是:核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP,其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP ),因为双脱氧核苷没有3’-O H,所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长,若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自 的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段,长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3’端的双脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法因操作简便,得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术,其中最重要的是荧光自动测序技术。 荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理,用荧光标记代替同位素标记,并用成像系统自动检测,从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法,并采用激光聚焦荧光扫描检测装置,25只毛细管并列电泳,每只毛细管在1.5h内可读出350 bp,DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究,使用四色荧光标记法,每个毛细管长3.5cM,在9min内可读取150个碱基,准确率约 97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时 不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。 杂交测序技术杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和Sanger 法, 而是利用 DNA杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列

下一代测序技术

下一代测序技术 摘要:DNA测序技术对生物学的发展有着最根本的意义。Sanger法测序经过了30年的应用和发展,而在过去三年中,以454, solexa, SOLiD为代表的高通量测序平台已经大幅度降低了测序成本,提高了测序速度,成为基因组测序市场的主流。在此基础上,各种下一代测序技术正在快速研发,将使基因组测序和重测序的通量和成本更加平民化,为基因组学、遗传学、生物医学和健康科学等领域的发展创造更加广阔的前景。本文将对所有新的测序技术的原理、优势和应用进行总结和展望。 1977年Maxim、Gilbert发明的化学降解法测序技术和Sanger发明的双脱氧末端终止法测序技术不仅为他们赢得了诺贝尔奖,也使得从DNA序列层面研究分子遗传学成为可能。特别是后者,从最开始的凝胶电泳到越来越高通量的毛细管电泳,从开始的手工操作到越来越多自动测序仪的出现,各种改进的Sanger 测序技术统治了DNA测序领域三十年,至今仍在长片段测序,大片段文库测序方面有广泛的应用。人类基因组计划(HGP)的完成就是靠Sanger测序法。 在耗费了庞大成本的人类基因组计划宣布完成之后,越来越多的物种基因组测序工作对测序成本和通量提出了更高的要求,新一代测序技术(也被称为第二代测序技术)开始登上历史舞台。2005年454 life science公司率先推出了焦磷酸测序技术,使测序成本较Sanger法降低了100倍,速度快了(提高)100倍,人类基因组测序逐步进入了100,000美元时代。如今,454 FLX测序仪(Roche Applied Science)、基于“边合成边测序”的Solexa测序仪(Illumina Inc.)和使用“边连接边测序”的SOLiD测序仪(Applied Biosystems)已经成为基因组测序市场的主流机型。除此之外,2008年一年内又有HeliScope单分子测序仪(Helicos)和Polonator(Dover/Harvard)两种测序机型商品化。 在NHGRI(美国人类基因组研究中心)的支持和推动下,未来几年内测序成本将在目前基础上再下降100倍,最终使个人基因组测序成本降至1000美元,人类将革命性的进入个人基因组时代。高通量和低成本的测序技术将进入到普通实验室,基因组测序的简单化将使分子生物学飞跃发展,个人基因组测序产业化也将对健康医学等领域产生革命性的影响。本文将首先对目前已经商品化的新一代测序技术(454、Solexa、SOLiD、HeliScope)做一介绍和比较,再对正在研发中的各种下一代测序方法(第三代测序技术)的原理和应用做一详细的介绍和展望。 1. Roche 454测序技术 2005年454生命科学公司在《自然》杂志发表论文,介绍了一种区别于传统Sanger法的全新高通量测序方法,将测序成本降低了100倍以上,开创了第二代测序技术的先河,454测序仪也成为最先商品化的第二代测序仪。正是在此基础上,其它如Solexa、SOLiD等第二代测序仪才相继问世。454测序技术的原理在于首先使用乳液PCR(emulsion PCR)技术(图一a)扩增已经连接上接头的基因组文库片段,扩增子结合在28 μm的磁珠表面,将乳液破坏后用变性剂处理磁珠,再将含有扩增子的磁珠富集到芯片表面,用测序引物进行测序。在测序过程中,454使用了一种“焦磷酸测序技术”(Pyrosequencing),即在合成DNA 互补链的过程中,每加入一种单核苷酸(dNTP),如与模板链配对结合,就会释放出一个焦磷酸,与底物腺苷-5’-磷酸硫酸(APS)在A TP硫酸化酶作用下合成A TP,与荧光素(Luciferin)一起在荧光素酶(Luciferase)的作用下,会发出一个光信号,由芯片背后连接的电荷耦合装置(CCD,Charge Coupled Device)捕捉。454测序技术合成DNA链使用的是普通单核苷酸,没有任何标记,合成中也没有切割基团等生化反应,因此读长可以达到300-400bp。但没有阻断(block)和去阻断(de-block)过程也意味着对连续重复单核苷酸的阅读只能根据信号强度来判断,容易对其中插入和缺失碱基阅读错误。454测序技术相比较其他第二代测序技术如Solexa和SOLiD, 在读长上有着巨大的优势,但是目前成本要略高。总体而言,高读长使得454技术比较利于De Novo拼接和测序。

一代、二代、三代测序技术

一代、二代、三代测序技术 (2014-01-22 10:42:13) 转载 第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是,聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火,然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂(双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3-OH基团,所以可被用作链终止试剂)通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后,DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行,每一组分别用四种ddNTP(双脱氧核苷酸)中的一种来进行终止,再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。 第二代测序技术-大规模平行测序 大规模平行测序平台(massively parallel DNA sequencing platform)的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一,还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格,更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品,例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上,通过技术创新,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程,(1)文库制备,将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端,紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。(2)簇的创建,将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构,以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。(3)测序,分三步:DNA聚合酶结合荧光可逆终止子,荧光标记簇成像,在下一个循环开

三代测序原理技术比较

导读从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法)1,发展至今三十多年时间,测序技术已取得了相当大的发展,从第一代到第三代乃至第四代,测序读长从长到短,再从短到长。 摘要:从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法)1,发展至今三十多年时间,测序 技术已取得了相当大的发展,从第一代到第三代乃至第四代,测序读长从长到短,再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置,但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革,也都对基因组研究,疾病医疗研究,药物研发,育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1:测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上(图1)所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来,整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格(Sanger)和考尔森(Coulson)开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆(Maxam)和吉尔伯特(Gilbert)发明的化学法(链降解). 并在1977年,桑格测定了第一个基因组序列,是噬菌体X174的,全长5375个碱基1。自此,人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力,并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年,完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础,Sanger法核心原理是:由于ddNTP的2’和3’都不含羟基,其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键,因此可以用来中断DNA 合成反应,在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分为:ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP),通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列(图2)。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片,形象而生动。 值得注意的是,就在测序技术起步发展的这一时期中,除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术,如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中,焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4,而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4,但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

下一代测序工作流程自动化

下一代测序(NGS)彻底改变了基因组学研究领域,使全基因组测序比以往任何时候都更有效率。然而,典型的NGS工作流程是鲜有革新的,因为它面临许多手动操作步骤和来自成本、通量以及结果变异性的诸多挑战。传统的样品制备和数据分析方法非常耗时,并更易出错。 针对这些挑战,自动化技术为此提供了相应的解决方案,并通过减少样品间变异提高了最终数据的精准度。然而,为您的NGS工作流程选择适合的自动化设备是一个复杂的过程。为了给您的实验室配备最佳的自动化整合系统,首先要对以下的四个因素进行评估,然后再作出决定: ? 自动化将如何影响您的实验流程? ? 您可选的自动化方案有哪些? ? 需要多少培训? ? 您的自动化解决方案是否需要扩展,以满足未来的需求?

Ilumina文库构建杂交选择和靶向捕获簇扩增和测序Ilumina文库构建杂交选择和靶向捕获簇扩增和测序

图3,高通量PCR纯化自动化工作流程 您是否在纯化时使用真空泵和离心过滤?图3描述了一个中高通 进一步加速:靶标富集技术 量的自动化工作流程图。 基于磁珠技术的靶标富集方法,比如SureSelect靶标富集 试剂盒和SureSelect人全外显子试剂盒,能使您仅对感兴 趣的基因片段测序,提高了几个数量级的实验效率。这些操 作很容易实现和高度扩展,凸显出Bravo自动化液体处理 平台的速度和精度的优势。

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DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍

原理是:核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP,其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP ),因为双脱氧核苷没有3’-O H,所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长,若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自 的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段,长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3’端的双脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法因操作简便,得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术,其中最重要的是荧光自动测序技术。 荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理,用荧光标记代替同位素标记,并用成像系统自动检测,从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法,并采用激光聚焦荧光扫描检测装置,25只毛细管并列电泳,每只毛细管在内可读出350 bp,DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究,使用四色荧光标记法,每个毛细管长,在9min内可读取150个碱基,准确率约 97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时 不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。 杂交测序技术杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和Sanger 法, 而是利用 DNA杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列

下一代DNA测序技术研究进展综述

深度DNA测序技术在基因组测序中的研究策略和进展 摘要:回顾了经典DNA测序技术原理,重点阐述了深度测序技术在基因组测序中的研究策略,并结合目前比较常见的二代测序仪来分析比较相互之间的特点和优势,最后,对即将到来的三代测序法的研究进展给予了简单的介绍。 关键词:深度DNA测序基因组测序仪 DNA测序技术的发展过程漫长而艰辛,然而,我们现在获取的大部分DNA序列信息还是依靠基于Sanger在1977年建立的“DNA双脱氧链末端终止测序法”的DNA测序技术获得的。另外就是Maxam和Gilbert建立的“化学降解测序法”。在过去的七年当中,DNA测序技术的发展至少受到来自四个方面的影响:首先是人类基因组计划的出现,这项计划的实施过程中,科学家们面临了巨大的经费问题,因为传统的Sanger测序法无论怎么优化,都无法大幅度降低测序的成本,这很大程度促进了人们对在测序过程中如何降低成本的技术方面的研究。第二,人类以及其他主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段阅读(short-read)成为可能,这极大的促进了短片段测序技术的发展。第三,新型分子生物学技术的不断涌现导致了越来越多的诸如RNA表达染色体构象等生物现象的出现,这就需要有高通量DNA测序手段去解释这些问题,这也极大的促进了新型测序技术的发展。第四,其他学科领域的技术的发展,例如计算机技术,数据存储及分析技术,聚合酶工程技术等,极大地支持了DNA测序技术的应用。本文主要是对目前新一代DNA测序(也叫深度测序)技术(Next-generation DNA sequencing technologies)的研究策略及目前国际DNA测序最新进展做一简要的综述。 1.Sanger测序法 先来回顾一下经典的DNA测序法,从上世纪九十年代早期开始,几乎所有的DNA测序都是利用半自动化的毛细管电泳Sanger测序技术完成的(图1-a)。后来出现了高通量测序法,这种方法首先要对DNA预处理,获取大量的待测序模板即质粒或PCR产物。然后在测序一种发生测序生化反应,这个过程会产生大量长短不一(因为终止位点不一样),末端被荧光标记的延伸产物。再用分辨率高的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物,通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分,利用计算机软件自动“读

高通量测序:第二代测序技术详细介绍

在过去几年里,新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展,各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术(next-generation sequencing),是相对于传统Sanger 测序而言的。Sanger 测序法一直以来因可靠、准确,可以产生长的读长而被广泛应用,但是它的致命缺陷是相当慢。十三年,一个人类基因组,这显然不是理想的速度,我们需要更高通量的测序平台。此时,新一代测序技术应运而生,它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段,然后拼接成一幅完整的图画。 Sanger 测序大家都比较了解,是先将基因组DNA 片断化,然后克隆到质粒载体上,再转化大肠杆菌。对于每个测序反应,挑出单克隆,并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的,荧光标记的产物梯度,在测序仪的96或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时,四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中,片断化的基因组DNA 两侧连上接头,随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列(polony)。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上,这些反应就能够大规模平行进行。同样地,每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行,来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa高通量测序原理 --采用大规模并行合成测序法(SBS,Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术(ReversibleTerminatorChemistry) --可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。 --具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势 --可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学(基因表达及调控,基因功能,蛋白/核酸相互作用)研究 ----将接头连接到片段上,经PCR扩增后制成Library。 ----随后在含有接头(单链引物)的芯片(flowcell)上将已加入接头的DNA片段变成单链后通过与单链引物互补配对绑定在芯片上,另一端和附近的另外一个引物互补也被固定,形成“桥” ----经30伦扩增反应,形成单克隆DNA簇 ----边合成边测序(Sequencing By Synthesis)的原理,加入改造过的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP。这些dNTP是“可逆终止子”,其3’羟基末端带有可化学切割的基团,使得每个循环只能掺入单个碱基。此时,用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后,将这些基团化学切割,恢复3'端粘性,继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去,直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样,统计每轮收集到的荧光信号结果,就可以得知每个模板DNA 片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp,更长的读长也能实现,但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响,如荧光标记的不完全切割。 Roche 454 测序技术 “一个片段= 一个磁珠= 一条读长(One fragment =One bead = One read)”

下一代测序技术的内容概览

下一代测序技术的内容概览 高通量DNA测序技术(下一代测序技术NGS)在过去的15年里已经有了快速的发展,新的方法也在继续实现商业化。随着技术的发展,对基础和应用科学中的相关应用范围也在增加。这篇综述的目的是提供一个对NGS方法论的概述以及相关的应用。每个简要的讨论之后都跟有制造商和基于网页的可视化。关键词搜索,例如用Google,可能也会提供有帮助的网页链接和信息。 方法的建立 DNA测序方法的建立是Sanger双脱氧合成法以及Maxam-Gilbert的化学裂解法。Maxam-Gilbert化学裂解法是基于DNA的化学修饰然后在邻近修饰过的核苷酸附件的位点进一步裂解DNA骨架。Sanger测序采用了特殊的链终止核苷酸(双脱氧核苷酸),它缺少一个 3‘OH连接位点。因此,不能够在DNA聚合酶的作用下合成磷酸二酯键,结果是正在伸长的DNA链在该位置终止了。双脱氧核苷酸是具有放射性的或者具有荧光标记的,便于分别在测序凝胶或者自动测序仪器上识别。尽管原始的Maxam-Gilbert方法的化学特性已经被进行修饰来帮助消除有毒性的反应物,但是Sanger测序通过合成双脱氧核苷酸的方法已经变成了一种测序的标准。 Sanger测序法在1977年被创建,并且在UNIT7.4中被详尽的描述了。尽管通过当前NGS 标准测序相对较慢,但是在Sanger末端终止法的改进,自动化,以及商业化这些方面已经使它能够在当前的多种应用范围中成为最适当的测序方法。特别的,超薄的凝胶板电泳已经被多通道毛细血管电泳代替了,逐渐还出现了自动填充可循环的毛细血管以及电动样品加样,这对提高Sanger测序过程的速度与便利性有很大的贡献。在Sanger测序中已经出现的最显著的创新点有:(1)荧光染色的发展,(2)采用末端循环测序降低所要求的输入DNA的质量并且用耐热聚合酶高效准确的将终止物染色与正在伸长的DNA链结合起来,(3)解释和分析序列软件的发展。在自动化的Sanger测序项目中的主导者是Applied Biosystem(AB)。当前商业化的AB测序仪全部使用的是荧光染色和毛细管电泳(CE)。用于DNA测序或者片段分析协议的机器的容量在发生改变,4组毛细血管(SeqStudio Genetic Analyzer),8到24组毛细管(3500 Series Genetic Analyzer),以及48到96组(3700 Series Genetic Analyzer)。所以的这些测序仪产生了600-1000个碱基的正确的序列。尽管多年以来,不同种类基于Sanger测序的测序仪器已经被引进,包括来自Licor,Amersham,MilliGen,Perkin Elmer 和Dupont,所以的这些除了AB仪器都已经被停产了。 Sanger测序技术在一些应用中任然非常有用,而这些应用中高通量测序是不被要求的。一些DNA测序的核心设备和以测序来获利的公司提供了Sanger测序服务。对于个体测序反应对公共的用法是在一个特殊的模板上用特殊的DNA引物,例如去检验质粒的构建和PCR 产物。既然来自大量的商家的用于DNA纯化的分子生物试剂盒和试剂以及相对较高质量的合成产物都是可用的,这就使得甚至是相对较大的Sanger测序项目都能够在合理的时间框架和成本范围内完成。 除了检测DNA的序列AB仪器上的毛细管电泳(CE)还被应用到测量酶对基于荧光标记的DNA底物的选择活性,列如,可以分析DNA片段的大小。毛细管电泳同样能够用来同时分析一个单反应中的多个底物,产物或者反应介质,通过不同的荧光标记。CE被用在DNA 聚合酶和DNA连接酶动力学,以及包括冈崎片段和核糖核苷酸的删除修复的偶联酶通路的研究中。AB CE在在糖生物学中也是很有用的,可以用来分析荧光标记的多糖。 第二代测序方法 术语“下一代”隐含着DNA测序技术发展的下一步,同时也表明将会产生一个以下一代命名的新技术。我们更喜欢用下一代,第三代等这些术语,因为我们意识到上述的自动化的

一代测序、高通量测序等各种测序相关概念介绍

什么是高通量测序? 高通量测序技术(High-throughput sequencing,HTS)是对传统Sanger测序(称为一代测序技术)革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing,NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行 细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序(一代测序) Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序(Genome Re-sequencing) 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序,并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低,人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序,实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点,以及结构变异等,具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序:其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序,利用生物信息学分析手段对序列进行拼接,组装,从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展,基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低,大规模基因组测序渐入佳境,基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力,可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序(whole exon sequencing) 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势,但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。

二代测序

第二代测序技术 --以Illumina/Solexa Genome Analyzer为例 1.概述 DNA测序(DNA sequencing)作为一种重要的实验技术,在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构(Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术,但是当时的操作流程复杂,没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法,同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速,并经过后续的不断改良,成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展,传统的Sanger 测序已经不能完全满足研究的需要,对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序,都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术,第二代测序技术(Next-generation sequencing)应运而生。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis),即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列,现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、 Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。这三个技术平台各有优点,454 FLX的测序片段比较长,高质量的读长(read)能达到400bp;Solexa测序性价比最高,不仅机器的售价比其他两种低,而且运行成本也低,在数据量相同的情况下,成本只有454测序的1/10;SOLID测序的准确度高,原始碱基数据的准确度大于99.94%,而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%,是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成,但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用,下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例,简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。 2.基本原理 Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成变测序。在Sanger等测序方法的基础上,通过技术创新,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。 3.操作流程 1)测序文库的构建(Library Construction) 首先准备基因组DNA(虽然测序公司要求样品量要达到200ng,但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中),然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段,并在两头加上特定的接头(Adaptor)。如果是转录组测序,则文库的构建要相对麻烦些,RNA片段化之后需反转成cDNA,然后加上接头,或者先将RNA反转成cDNA,然后再片段化并加上接头。片段的大小(Insert size)对于后面的数据分析有影响,可根据需

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