目录
摘要 (1)
关键词……………………………………………………………………………………………
1 Abstract……………………………………………………………………………………………
1 Keywords (1)
1 污染 (2)
1.1 污染的种类 (2)
1.2 污染的因素 (2)
1.2.1 外植体本身 (2)
1.2.2 外植体灭菌 (2)
1.2.3 接种和培养环境 (3)
2 褐化 (3)
2.1 褐化原因 (3)
2.2 影响褐变的因素 (3)
2.3 防止褐变的方法 (4)
2.3.1 外植体的选择 (4)
2.3.2 适宜的培养基和培养条件 (4)
2.3.3 加入抗氧化剂和吸附剂 (4)
2.3.4 反复转接 (4)
3 玻璃化 (4)
3.1 玻璃化苗的特点与发生原因 (4)
3.1.1 玻璃化苗的特点 (4)
3.1.2 发生原因 (4)
3.2 影响玻璃化苗的因素 (5)
3.2.1 生长调节剂 (5)
3.2.2 温度 (5)
3.2.3 湿度 (5)
3.2.4 消毒方法 (5)
3.2.5 光照时间 (5)
3.2.6 培养基 (5)
3.2.7 继代次数 (5)
4 其他常见问题及其解决措施 (5)
4.1 初始培养阶段 (5)
4.2 继代培养阶段 (6)
致谢 (7)
参考文献 (7)
浅析植物离体快繁过程中常见的问题
摘要
探讨了影响了植物组织培养的主要因素，分析了污染、褐变、玻璃化及其他常见问题，并提出了解决措施。认为：污染主要是由灭菌不彻底和环境不洁造成的，加强外植体和培养基的灭菌，对培养环境及其用具彻底消毒，可大大降低污染率。植物品种、取材部位及环境条件与褐变的发生密切相关，选择适宜的外植体，进行外植体，调价抗氧化剂和吸附剂等可有效控制褐变。培养基的种类、温度、通气状况等会影响玻璃苗的发生，选择适当培养基，降低温度，增强光照，改善通风等可使玻璃化率降低。
关键词
组织培养；污染，褐化，玻璃化
According to the rapid propagation process of in vitro in
common problem
Abstract
Discusses the influence of the main factors of plant tissue culture, this paper analyzes the pollution, Browning, vitrification and other common problems, and proposes the measures. Think: pollution is mainly composed of sterilization is not complete and the environment caused by the unclean, strengthen the explant and culture medium sterilization for training environment and its appliance disinfection, can greatly reduce the rate of pollution. Plant variety, based site and environment and the occurrence of Browning closely related, the choice of appropriate explant, explant, introduce antioxidants and adsorbent, etc can effectively control the Browning. The kinds of culture medium, temperature and ventilation situation will influence the occurrence of glass seedlings, choose proper culture medium, reduce the temperature, and enhance the illumination, improve ventilation can make glass transition rate to decrease.
Keywords
Tissue culture; Pollution, Browning, vitrificatio
1 污染
污染是指在培养过程中由于外界真菌、细菌或植物材料的内生菌所侵染，从而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败。
1.1 污染的种类
○1真菌
真菌性污染主要指霉菌引起的污染，表现为培养基污染部位发霉，颜色黝黑、白、黄等。一般接种后3~8d可在培养基中发现各种颜色的菌斑，真菌性污染一般由接种室内的空气不洁净，超净工作台的过滤效果不理想，操作不慎，真菌孢子通过瓶口进入瓶内等原因引起。
为了减少损失，提高工作效率，必须每个操作环节注意防止污染的发生。
○2细菌
细菌性的主要症状是材料附近出现粘液状和发酵泡沫状物体，或在材料附近的培养基中出现浑浊和云雾状痕迹。一般在接种后1~2d可发现，细菌性污染一般除外植体带菌和培养基灭菌不彻底外，主要是操作人员的不慎造成。
防止外植体带菌：避免在阴雨天在室外采集外植体，最好在晴天的下午采集；组培季节最好选择在春夏季；或者材料在室内用无糖营养液预先培养；根据材料的大小及幼嫩程度控制好灭菌时间。
1.2.影响污染的因素
1.2.1外植体本身
植物组织培养的成败除与培养基的成份有关外，另一个重要因素就是外植体本身，即从活体植物上切取下来，用以进行离体培养的那部分组织或器官，为了使外植体适于在离体条件下生长，使组织培养顺利进行，有必要对外植体进行选择与处理。
首先，应该从田间或温室中生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的组织或器官作为外植体，离体培养易于成功。不同的植物材料如种、品种、不同的取材部位、材料大小、取材年龄以及取材时期，其带菌量不同。通常多年生木本材料比1、2年生的草本材料带菌多；老的材料比幼嫩材料带菌多；田间生长的材料比温室材料带菌多；带泥土的材料比清洁材料带菌多。一年中以雨季的材料带菌多，一天中以中午阳光最强势时材料带菌少。
对于大多数植物来说，茎尖是最好的外植体，由于茎形态已基本建成，生长速度快，遗传稳定，病毒含量低或无病毒，所以是获取无病毒苗的良好途径。但是，不同植物的不同部位，由于其本身的生长特点，在外植体的培养中存在各种差异性。比如，各部位的分化再生能力不同，各部位接种后的污染率也不同，各部位培养形成的再生植株的脱毒率也不同。所以，我们在选取外植体时应选择适当大小、病毒含量低的、易于消毒和灭菌的。
因此，应尽可能选取温室或人工气候室培养的材料，田间采取的材料，可在温室条件下培养一段时间，以使用新的生长部分；木本植物的枝条取回后可插入水中使它萌芽；对于那些容易污染的材料可在取材前进行杀菌剂、抗生素预处理。由于有些污染需要相当长的时间才表现，所以，初步成功后还要对培养物进行进一步检测。
1.2.2外植体灭菌
在开放有菌环境条件下采取的植物材料，去掉不用的地方，然后用适当的软毛刷或毛笔在流水中刷洗干净。在刷洗过程中也可以使用洗涤剂，如洗衣粉或肥皂水，然后切成大小合适的小块，置于烧杯中并用流水冲洗几分钟至数小时。去除植物材料体表的洗涤剂。细小或容易漂浮的植物材料需用纱布、纱网或金属网扎住洗涤。
初步刷洗过的外植体需拿到茶经工作台上进行再次灭菌。事先我们已准备好干净的空杯、无菌水、灭菌药品溶液、无菌的三角瓶或广口瓶，以及回收溶液的器皿等。首先将洗涤干净的植物材料放入烧杯中，然后将材料沥干，放入无菌的三角瓶或广口瓶中，加灭菌溶液，计
时。为了使植物表面灭菌彻底和均匀，可以在灭菌溶液中滴加几滴吐温-80，轻轻摇动三角瓶，促进植物材料和灭菌溶液的充分接触，驱除气泡，提高灭菌效果。在达到设定灭菌时间前，倾倒出灭菌溶液，并倒入无菌水。植物材料应从加入灭菌溶液到加入无菌水的这段时间。在用无菌水洗涤过程中应注意每次洗涤3min左右，一般洗涤3~10分钟即可除掉织物表面残留的灭菌药品。
1.2.3接种和培养环境
每次接种前对接种室的地面进行清洁，并用紫外灯照射30min,接种前工作台用洁尔灭或75%酒精擦洗。定期对过滤膜进行清洗。定期打开臭氧发生器，定期打扫地面和擦洗培养架。
2.褐化
2.1褐化原因
外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，酚类化合物被多酚氧化物氧化成褐色的醌类物质和水。醌类物质又会与络氨酸酶发生作用使外植体蛋白质聚合，导致外植体生长停顿，直至死亡。许多植物尤其是木本植物组织中含有较多的酚类化合物，褐变现象比较严重。而控制褐变比控制污染、玻璃化更加困难。因此，能否有效控制褐变是有些植物组培成功的关键。
2.2影响褐变的因素
影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体部位及生理状况的不同，褐变程度也有所不同。
（1）与基因型有关
不同植物与品种之间褐变现象也不同，即褐变与植物的遗传性有关。一般来说植物材料中单宁类和多种酚类化合物含量高，易引起外植体材料的严重褐化。多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。
（2）与取样外植体的年龄有关
通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。因此，在外植体接种时常需剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的茎尖或切取茎尖分生组织更为理想。
（3）与外植体取材时间有关
一般在春夏季，在春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻。已木栓化和木质化的枝条和处于休眠状态的枝条褐化严重。即分生部位接种后醌类形成物质少，而分化部位形成醌类物质较多。
（4）与培养基有关
固体培养基还是液体培养基、无机盐浓度、激素种类和浓度、培养基的pH等，都与外植体的褐变程度有关。大量研究证实，液体培养基能有效防止外植体的褐变，加上滤纸桥效果更佳。降低无机盐浓度，尤其是Mn2+和Cu2+离子浓度，可减少酚类物质外溢，外植体的褐变程度减轻。培养基中的细胞分类素（BA、KT）不仅促进酚类物质的合成，而且还刺激多酚氧化酶的活性，较高浓度的BA和激动素加重外植体的褐变程度，相反，生长素类物质如2,4—D和NAA则延缓多酚合成，减轻褐变。培养基的pH值较低时，常有利于减轻外植体的褐变。当培养基合适时，外植体细胞分裂迅速，褐变也会受到抑制。
（5）培养条件不适宜
外植体接种后，培养的温度和光照条件也常对外植体的褐变程度有一定的影响。培养条件不合适，如温度过高或光照过强，都可以诱导多酚氧化酶的活性从而加速被培养的外植体褐变。
（6）外植体大小
外植体大小影响其在培养过程中的褐变。一般的，材料太小，容易产生褐变。
（7）外植体组织的受伤程度
植物的创伤是导致多酚氧化酶和底物酚类物质接触的原因，并使组织褐变。为了减少褐变，在切取材料时应尽量减少伤口面积，创伤面要尽量平整。
（8）材料转移时间
在培养过程中，如果推迟继代时间，会导致材料的褐变，最终材料全部死亡。
（9）用于外植体体表的灭菌的化学药品
这些药品的使用，在杀死外植体表面的菌类的同时，也可能会一定程度地杀死外植体组织细胞，导致褐变。在进行植物外植体表面灭菌时，要尽量使用无菌水清除化学杀菌化学药品。
2.3防止褐变的方法
2.3.1外植体的选择\
不同基因型、不同时期、不同年龄的外植体在培养中褐变程度不同。所以，要选择褐化程度低的品或品种，最好选择春季或夏季的生长旺盛的材料做外植体。
2.3.2适宜的培养基和培养条件
注意培养基的状态、类型、组成，如无机盐浓度、激素浓度等。初期培养可在黑暗或弱光条件下进行，对外植体进行预处理，如对母株或枝条进行遮光处理，之后在切除外植体能减少褐变；先用流水冲洗，然后进行低温处理。
2.3.3 加入抗氧化剂和吸附剂
在培养基中加入抗氧化剂，或在含抗氧化剂培养基中预培养，可大大减轻醌类物质对外植体的毒害。如Vc、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清蛋白、柠檬酸、硫代硫酸钠、活性炭等。通常可在培养基中附加2~3g/L的活性炭，或5~20g/L的PVP。在精制的液体培养基中加入抗氧化剂比在固体培养基中加入抗氧化剂好。
2.3.4 反复转移
在外植体接种后1~2d立即转移新鲜培养中，减轻醌类物质对外植体的毒害，从而减轻材料的褐变。
3.玻璃化
植物组织培养过程中，叶片和嫩稍呈透明或半透明的水渍培养物称为玻璃化苗。它是组培苗生理失调的症状。玻璃化大大降低了组培苗有效增殖系数，造成人、财、物的极大浪费，必须对玻璃苗加以控制。
3.1 玻璃化苗的特点与发生原因
3.1.1玻璃化苗的特点
在形态解剖和生理上，玻璃化苗有如下特点：
○1玻璃化苗植株矮小肿胀、失绿、叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎。
○2叶表面缺少价值层蜡质，没有功能性气孔，仅有海绵组织而无海绵组织。
○3体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。
○4吸收营养与光合功能不全，分化能力大大降低，苗生长缓慢，繁殖系数大为降低，甚至死亡。
○5生根困难，移栽成活率低。
3.1.2发生原因
玻璃化苗是在芽分化启动后的生长过程，碳、氮代谢和水分发生生理性异常所引起。尤其是植物细胞分裂与体积的增大速度超过了干物质生长和积累的速度，植物只好用水份充涨体积，从而表现玻璃化。同作物种类或品种，玻璃化的发生频率各不相同。
3.2影响玻璃化苗产生的因素
3.2.1 生长调节剂
细胞分裂素和生长素的浓度及其比例均影响玻璃化苗产生。高浓度的细胞分裂素有利于促进芽的分化，也会使玻璃化苗的发生比例提高。不同植物发生玻璃化的生长调节剂水平不相同。同一植物的不同阶段对细胞分裂素的要求也不相同，在某些特定阶段可忍受较高的浓度，而在其他阶段的培养中，却只需要较低的浓度。细胞分裂素与生长素比例失调，细胞分裂素的含量显著高于两者之间的适宜比例，使试管苗正常生长所需的生长调节剂水平失衡，也会导致玻璃化苗的发生。
3.2.2 温度
随着培养温度的升高，苗的生长速度明显加快，但高温达到一定限度后，会对正常的生长和代谢产生不良影响，促进玻璃化的产生。变温培养时，温度变化幅度大，忽高忽低的温度变化容易在瓶内壁形成小水滴，增加容器内湿度，提高玻璃化发生率。
3.2.3 湿度
瓶内湿度与通气条件密切相关，使用有透气孔的膜或通气好的滤纸、牛皮纸封口膜时，通过气体交换，瓶内湿度降低，玻璃化发生率减少。相反，如果用通气性不好的瓶盖、封口膜、锡泊纸封口时，不利于气体的交换，在不透气的高湿条件下，苗的生长势快，但玻璃化的发生频率也相对较高。一般来说在单位容积内，培养的材料的越多，苗的生长势越快，玻璃化的频率也越高。
3.2.4 消毒方法
对容易发生玻璃化的苗进行接种时，应尽量减少在水中浸泡的时间，做到随洗随灭，漂洗后马上接种。特别对一些草本植物，幼嫩的组织在长时间的消毒和清洗后很容易呈水渍状，继而产生玻璃化。
3.2.5 光照时间
光照影响光合作用和碳水化合物的合成，光照不足加上高温，极易引起试管苗的过度生长，加速玻璃化的发生。
3.2.6 培养基
培养基中的成分对促进培养物的生长和发育有积极的作用，提高培养基中的碳氮比，可以减少玻璃化的比例。增加琼脂用量可降低容器内湿度，随琼脂浓度的增加，玻璃化的程度明显减少。但培养基太硬，影响养分的吸收，使苗的生长速度减慢。
3.2.7 继代次数
随着继代次数的增加，愈伤组织和试管苗内积累过量的细胞分裂素，玻璃化程度不断提高。继代培养最初几代玻璃化苗很少，随着继代次数的增多，玻璃化苗的比例越来越高。3.3 控制和克服玻璃化的措施
3.3.1 降低培养基中细胞分裂素和赤霉素浓度，添加低浓度多效挫、矮壮素等生长抑制物质。
3.3.2 控制适宜的培养温度，避免温度过高，变温培养时注意温差不宜过大。
3.3.3 使用透气性好的封口材料，改善培养容器的通风换气材料。
3.3.4 适当增加培养基琼脂浓度，降低培养基的水势。
3.3.5 减少培养基中氮化合物的用量，采用低NH4 + 水平的B5培养基。
3.3.6 增加自然光照，光照强度较弱时，可通过延长时间补偿。
3.3.7 控制继代次数。
4 其他常见问题及解决措施
4.1 初始培养阶段
4.1.1 培养物水渍状、变色、坏死、茎断面附近干枯
可能原因：表面杀菌剂过量、消毒时间过长、外植体选用不当（部位或时期）。
改进措施：调换其他杀菌剂或减低浓度、缩短灭菌时间、使用其他部位、生长初期取材。
4.1.2 培养物长期培养无反应
可能原因：基本培养基不适宜、生长素不当或用量不足，温度不适宜。
改进措施：更换其他培养基或调整培养及成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。
4.1.3 愈伤组织生长过旺、疏松、后期水渍状
可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。
改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐浓度（尤其是铵盐）。
4.1.4 愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢
可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。
改进措施：减少细胞分裂素用量，调整生长素和细胞分裂素比例，降低糖浓度。
4.1.5 侧芽不萌发，皮层过于膨大，皮孔长出愈伤组织
可能原因：枝条过嫩，生长素、细胞分裂素过多。
改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。
4.2 继代培养阶段
4.2.1 苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高
可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。
改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为从芽继代。
4.2.2 苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗从密集，微型化
可能原因：细胞分裂素用量过度，温度不适宜
改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。
4.2.3 分化率低，畸形，培养时间长时苗再次分化成愈伤组织化
可能原因：生长素用量偏高，温度偏高。
改进措施：减少生长素用量，适当降温。
4.2.4 叶粗厚变脆
可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。
改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基。
4.2.5 丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽
可能原因：细胞分裂素过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。
改进措施：减少细胞分裂素用量，或不用赤霉素，延长光照时间，增加光强，及时转接，降低接种密度，更换封瓶纸的种类。
4.2.6 幼苗淡绿，部分失绿
可能原因：无机盐含量不足，PH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照，温度不适。
改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH,调控温度，光照。
4.2.7幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中
可能原因：瓶内气体状况恶化，PH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当。
改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，控制温度。
小结：植物组织培养是生物技术的重要组成部分，并且越来越引起重视。植物组织培养技术能引起当今人们广泛的重视和得到迅速发展，是因为它的理论和应用都具有极其重要的意
义。已在工厂化育苗、种苗脱毒复壮、遗传育种、种质自然的保存与交换等领域的到广泛应用。在近几年开展组织快繁培养技术研究和生产过程中，发现有几个问题较常见，有时会严重影响工作效率和进展，降低组织快繁的经济效益，这些问题必须尽量避免。
致谢
在论文完成之际，我要特别感谢我的指导老师刘振祥教授和咸宁市园林科学研究所刘良宏老师的热情关怀和悉心指导。在我撰写论文的时候，两位老师倾注了大量的心血和汗水，无论在论文的选题、构思方面，还是在论文的研究方法以及成文定稿方面，都得到了两位刘老师的悉心细致的教诲和无私的帮助。在这里要感谢研究的领导，在我在科研所实习期间给予的大力支持。感谢所有关心、支持、帮助过我的良师益友。
最后，向百忙之中抽出时间对本文进行评审并提出宝贵意见的各位专家表示衷心的感谢！
参考文献
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6.唐高生等。桉树植物组织培养常见问题。[J]。中国农业信息。2011年第7期
植物离体快繁技术的综述 黄新 （生物科学技术学院2009级生物技术一班） 摘要：植物快繁技术是一种全新的育苗技术，是现代计算机智能控制技术与生物技术有机结合的高新农业技术。运用植物生长模拟计算机为植物创造最为适宜的温、光、气、热、营养、激素环境，使植物的生理潜能得到最大的发挥，植物的生根基因尽快表达，从而实现植物的快速生根。它的推广应用将会带来一次全新的育苗革命。本文简要介绍植物快繁技术程序、相关培养技术以及植物快繁相关问题的讨论。同时还对植物组织培养脱毒快繁技术的应用前景作了分析。 关键词：植物离体快繁、愈伤组织、不定芽增殖、腋芽增殖、愈伤组织增殖、体细胞胚增殖、玻璃化问题、褐化问题、应用前景 1植物离体快繁概况 1.1研究简史 离体微繁殖技术的应用，首先应归功于Morel，他在1960年首先建立了兰花离体繁殖的方法（原球茎繁殖）。目前已有近400种植物的离体繁殖已获得成功，其中许多具有重要经济价值的花卉(如兰花、菊花、石竹)、果树(草莓、无籽西瓜、葡萄)、经济作物(马铃薯、甘蔗)、林木(桉树、杨树)均已在种苗生产上广泛应用，取得了巨大的经济和社会效益。 我国快速繁殖植物的种类达443种之多荷兰是试管苗的生产王国 1.2植物离体快繁的定义 快速繁殖（rapid clone propagation）：也叫离体繁殖（in vitro
propagation）、微体繁殖（Micropropagation），是指在无菌条件下，将植物体的器官、组织或细胞培养于人工培养基中，并辅以人工控制环境，使其生长出完整植株的繁殖技术。 追究植物组织培养脱毒快繁技术的发展简史，在11世纪就出现的热处理脱毒法，最早解决一些作物的病毒病害问题[1]。本世纪50年代发展的植物组织培养技术为脱毒提供了一条有效途径。现在植物的脱毒技术有多种，其中应用最广泛的有三种：热处理法、茎尖培养脱毒法、抗病毒药剂法，将不同的方法相结合起来应用效果更好。它们的脱毒原理各不相同。 2植物离体快繁的技术程序 无菌材料的建立芽苗的增殖生根及移苗 2.1无菌材料的建立 （1）初代培养：取材消毒接种培养 （2）外植体的选择主要应考虑以下问题： a)繁殖对象的品种典型性。 b)植物在自然条件下的繁殖特点。尽可能取自然繁殖器官的适当 部位作外植体， c)外植体的取材部位和大小、生理状态。 2.2芽苗的增殖 增值方式：不定芽增殖、腋芽增殖、愈伤组织增殖、体细胞胚增殖 2.2.1不定芽增殖 a)不定芽：从现存的芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形 成的芽称之为不定芽。 b)特点：繁殖系数高、遗传稳定性较好、继代次数有限 c)注意事项：激素浓度不能过高；避免使用2，4-D等活性强的生长素， 以减少变异发生。 2.2.2腋芽增殖 腋芽进行离体培养时可不断生长，逐渐形成芽丛，反复切割和转移可不
第二章植物离体繁殖 植物离体繁殖: 利用组织培养技术对外植体进行离体培养，短期内获得遗传性一致的大量再生植株。也叫快繁或微繁。 和传统方法突出特点： 1、繁殖效率高:增值率高，生长速度快，可周年生产，在一个短暂的时间，由单一个体开始，能产生出大量的遗传组成相同的植株。（如苹果矮化砧木茎尖8个月可繁殖6万株，石刁柏一个腋芽一年可繁殖７万株） 2、培养条件可控性强：人为提供培养基及小气候，便于对环境进行控制，省去田间栽培繁杂劳动。 3、便于管理、占地面积小：30m2可存放1万多培养瓶，约10万多苗木。 4、利于种质资源的保存及交换。 快速繁殖的应用 （1）短期内获得大量形状优良、整齐一致的种苗群体。加快引进新种、新育良种的繁殖，促进优良品种推广和应用。（2）大量繁育原来常规方法不能进行无性繁殖、难繁殖和繁殖速度慢的一些植物，尤其对一些珍、稀、濒危的植物的繁殖有更重要的意义。 （3）作为培育新品种的有效手段，繁殖和保存育种材料。如远缘杂种、多倍体、突变体。 （4）通过茎尖培养等技术脱毒，扩增脱毒苗，达到提纯复壮良种的目的。 一、植物快繁的器官形成方式 由于植物种类不同，器官再生及快速繁殖的方式也不同。 1、短枝发生型：外植体为带叶单芽茎段，培养为完整植株。 特点：一次成苗，培养过程简单，容易移栽成活，遗传性状稳定。例如：葡萄、红薯等试管苗繁殖。 2、器官型：外植体带有顶芽或腋芽。培养后形成丛生芽，转入生根培养基，诱导生根成苗，扩大繁殖。 特点：由单芽到丛芽，繁殖速度快，遗传性状稳定，多数花卉、苗木的快繁属于此类。 3、器官发生型：直接由外植体上或从愈伤组织产生不定芽，经过脱分化与再分化成苗。 特点：繁殖速度快，由愈伤组织再生植株，遗传不稳定。烟草、水稻、小麦、番茄等。 4、胚胎发生型：外植体脱分化产生愈伤组织或细胞团，再分化为胚状体产生小植株（球形期、心形期、鱼雷期、子叶期）特点：发生数量大，速度快，结构完整，人工种子繁殖，遗传变异。 5、原球茎发生型：兰科。 茎尖或腋芽外植体通过形成原球茎，而发育为完整植株。 二、植物快繁的程序和关键技术 离体无性繁殖的程序包括：无菌母株的制备，继代芽的增殖，芽苗生根培养，再生植株的锻炼和移栽。 1、无菌母株的制备 初代培养：在无菌条件下，制备无菌繁殖的材料称为无菌母株，或繁殖母株。 选取遗传性状优良、稳定，生长健壮、无病虫害植株上的外植体，经适当有效灭菌处理后，接种在培养基上，诱导其产生芽（腑芽或不定芽）和愈伤组织。 注意:培养基激素配比，取材的年龄、大小和生理状态。 初代培养的启动生长方式:腋芽被刺激后生长;茎段、叶片、其它器官伤口处产生不定芽；外植体切口产生愈伤组织。此阶段一般需要4-6周。 ↗愈伤组织 2、继代芽的增殖 无菌母株再次切割继代培养，芽分化增殖成丛芽，加快繁殖速度。 在快速繁殖过程中，随培养时间和继代次数增加，芽分化和生长速率降低，称为驯化现象，与内源激素和恒定培养条件有关，故可以调节激素配比或变温处理，提高繁殖速度。 3、芽苗生根培养 诱导无根苗生根的方法有两种：试管内生根和试管外生根。 1）试管内生根：将无菌小枝条转入生根培养基中进行培养。 提高生根率的措施： ①降低无机盐和有机物含量（如1/2MS或1/4MS培养基）
目录 绪论 (1) 1. 离体快繁过程中的问题、原因及防治措施 (1) 1.1 污染问题 (2) 1.1.1 污染的来源 (2) 2.1.2 污染的防治措施 (2) 1.2 褐变问题 (3) 1.2.1 褐变的原因 (4) 1.2.2 克服外植体褐变的措施 (4) 1.3 玻璃化问题 (4) 1.3.1 玻璃化发生的原因 (4) 1.3.2控制组培苗玻璃化的措施 (5) 1.4 遗传稳定性 (5) 1.4.1 影响遗传稳定性的因素 (6) 1.4.2 提高遗传稳定性，减少变异的措施 (5) 1.5 黄化问题 (5) 1.5.1 黄化原因 (6) 2. 离体快繁的前景与探讨 (6) 2.2适应现状的需求 (6) 2.3存在问题 (6) 参考文献 (6) 致谢 (6)
浅析植物离体快繁中常见的问题 摘要 植物组织培养是20世纪初发展起来的一项新技术，是现代农业生物技术的一个重要组成部分，已经日益广泛地应用于园艺植物的脱毒和快繁等方面。本文针对植物组织培养中常出现的问题进行了分析，探讨了污染、褐变、玻璃化、遗传稳定性、黄化等发生的可能原因，并提出了相应的防治措施。 关键词 离体快繁；污染；褐变；玻璃化；遗传稳定性；黄化 Analysis of the Common Problems in Plant Vitro Propagation Pick to Plant tissue culture is developed in the early 20th century, a new technology of modern agricultural biotechnology, is one of the important constituent, has increasingly widely applied in the enviroment of horticultural plants and rapid propagation, etc. Aiming at the plant tissue culture often appears the question were analyzed, pollution, Browning, vitrification, genetic stability, such as possible reasons Browning, and puts forward the corresponding prevention cuo Key words Propagation in vitro; contamination; browning; vitrification; genetic stability; etiolation
目录 摘要 (1) 关键词…………………………………………………………………………………………… 1 Abstract…………………………………………………………………………………………… 1 Keywords (1) 1 污染 (2) 1.1 污染的种类 (2) 1.2 污染的因素 (2) 1.2.1 外植体本身 (2) 1.2.2 外植体灭菌 (2) 1.2.3 接种和培养环境 (3) 2 褐化 (3) 2.1 褐化原因 (3) 2.2 影响褐变的因素 (3) 2.3 防止褐变的方法 (4) 2.3.1 外植体的选择 (4) 2.3.2 适宜的培养基和培养条件 (4) 2.3.3 加入抗氧化剂和吸附剂 (4) 2.3.4 反复转接 (4) 3 玻璃化 (4) 3.1 玻璃化苗的特点与发生原因 (4) 3.1.1 玻璃化苗的特点 (4) 3.1.2 发生原因 (4) 3.2 影响玻璃化苗的因素 (5) 3.2.1 生长调节剂 (5) 3.2.2 温度 (5) 3.2.3 湿度 (5) 3.2.4 消毒方法 (5) 3.2.5 光照时间 (5) 3.2.6 培养基 (5) 3.2.7 继代次数 (5) 4 其他常见问题及其解决措施 (5) 4.1 初始培养阶段 (5) 4.2 继代培养阶段 (6) 致谢 (7) 参考文献 (7)
浅析植物离体快繁过程中常见的问题 摘要 探讨了影响了植物组织培养的主要因素，分析了污染、褐变、玻璃化及其他常见问题，并提出了解决措施。认为：污染主要是由灭菌不彻底和环境不洁造成的，加强外植体和培养基的灭菌，对培养环境及其用具彻底消毒，可大大降低污染率。植物品种、取材部位及环境条件与褐变的发生密切相关，选择适宜的外植体，进行外植体，调价抗氧化剂和吸附剂等可有效控制褐变。培养基的种类、温度、通气状况等会影响玻璃苗的发生，选择适当培养基，降低温度，增强光照，改善通风等可使玻璃化率降低。 关键词 组织培养；污染，褐化，玻璃化 According to the rapid propagation process of in vitro in common problem Abstract Discusses the influence of the main factors of plant tissue culture, this paper analyzes the pollution, Browning, vitrification and other common problems, and proposes the measures. Think: pollution is mainly composed of sterilization is not complete and the environment caused by the unclean, strengthen the explant and culture medium sterilization for training environment and its appliance disinfection, can greatly reduce the rate of pollution. Plant variety, based site and environment and the occurrence of Browning closely related, the choice of appropriate explant, explant, introduce antioxidants and adsorbent, etc can effectively control the Browning. The kinds of culture medium, temperature and ventilation situation will influence the occurrence of glass seedlings, choose proper culture medium, reduce the temperature, and enhance the illumination, improve ventilation can make glass transition rate to decrease. Keywords Tissue culture; Pollution, Browning, vitrificatio
植物组织培养练习题 1.植物组织培养：指要人工控制的条件下，将植物体的任何部分，或器官、或组织、或细胞， 进行离体培养，使之发育形成完整植物体。所谓人工控制的条件，即营养条件和环境条件； 植物体的任何一部分是指根、茎、叶、花、果、实以及它们的组织切片和细胞。 2.愈伤组织培养：将外植体接种在人工培养基上，由于植物生长调节剂的存在，而使其细胞 脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。 3.外植体：植物组织培养中的各种接种材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质 体等。 4.脱分化：一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象。 5、接种：把经过表面灭菌后的外植体切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的 全部操作过程。 6、褐变：外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类 物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。 二填空 植物组织培养根据培养方式分为固体培养和液体培养。 2、植物组织培养类型分为愈伤组织培养、器官培养、胚培养、细胞和原生质体培养。 3、组织培养的主要应用领域有快速繁殖、脱毒、体细胞无性系变异和新品种培育、单倍体育种、种质保存、遗传转化、次生代谢物的生产等几个方面。 4、茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为快速繁殖和脱毒培养两种类型。 5、一般组织培养的几道工序如下：培养器皿的清洗、培养基的配制、分装和高压灭菌；无菌操作——材料的表面灭菌和接种，培养；试管苗的驯化、移栽与初期管理。 6、在进行植物组织培养室设计时，其设计应包括洗涤室、准备室、灭菌室、无菌操作室、培养室、细胞学实验室、摄影室等分室，另加驯化室、温室和大棚。 7、培养基的成分主要包括无机营养、氨基酸、有机附加物、维生素、糖、琼脂、激素、活性炭、PH。 8、植物器官培养主要是指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。 9、细胞全能性是指植物的每一个细胞都携带有一完整的基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。 10、玻璃化现象是指试管苗的一种生长失调症状，当植物材料进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会出现半透明状和水渍状，这种现象称为玻璃化。其苗称为玻璃化苗。
第三章植物离体快速无性繁殖技术和脱毒培养技术 第一节、植物离体快速繁殖技术 一、植物离体快速无性繁殖的概念及其意义 1 概念 离体无性繁殖：指利用组织培养的方法进行植物离体培养，在短时间内获得大量遗传性一致的个体的方法，又称“离体繁殖，快速无性繁殖、微型繁殖”。 试管苗：由离体无性繁殖获得的植株称试管苗。 无性系：指有同一个体通过无性繁殖产生的一个群体，它们的遗传背景基本一致。 2 应用 （1）用来加速难繁殖和繁殖速度慢的植物的繁殖。 （2）无病毒苗木的繁殖。 （3）用于某些杂合园艺植物的繁殖。 （4）用于需要加速繁殖的特殊基因型。 二、植物离体快速无性繁殖的特点 1 优点 （1）首先体现在一个“快”字上。 （2）可人为控制条件，不受大自然的干扰 （3）快速培养脱毒苗。 2局限性 （1）一些植物快速无性繁殖技术的某些环节还没有突破。 （2）要对其成本、技术等进行估算。 （3）随继代次数增多，培养材料的分化能力下降。 三、离体无性繁殖中器官的发生形式 1 不定芽型 ２器官型 ３器官发生型 ４类胚体发生型 ５原球茎型 四、离体无性繁殖的程序 ?无菌母株的制备 ?茎芽的增殖 ?诱导生根 ?炼苗 ?再生植株的鉴定 五、植物组织培养中应注意的问题 １褐变 （１）褐变
褐变：指在组织培养过程中，由培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。 （２）克服褐变的方法 选择适宜的外植体（幼嫩材料、春季取材） 改善营养条件（连续培养） 在培养基中加入一些附加物 ２污染 （１）特点： 细菌污染的特点 在培养材料附近出现黏液状菌斑，一般接种1-2天一5可发现。特别应注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌，外被荚膜，耐高温，一般灭菌剂难以杀死，可随培养材料、用具传播，可出现在培养基表面，也可呈滴形云雾状存在于培养基内，发现及时淘汰，并对用过的器具严格高温灭菌。 真菌污染的特点 培养基上长霉，一般接种3-5天就可先，霉的颜色有黑、白、黄等，真菌污染的特点是污染部分有不同颜色的霉菌，接种3天，有时多达10天才能表现。 （２）克服方法： ?外植体灭菌不彻底 ?培养基及各种器具清洁灭菌不彻底 ?人为因素 ?超净工作区被污染 ?环境不清洁 ３玻璃化 （１）玻璃化 玻璃化：是试管苗的一种生理失调症状，当植物材料进行离体繁殖时，有些培养物的茎、叶往往会出现半透明状和水渍状，这种现象称为玻璃化。 （２）克服方法 ?增加固体琼脂浓度，使细胞吸水受到阻碍。 ?提高培养基中的Ｃ、Ｎ比。 ?控制温度，增加自然光照。 ?附加一些物质 第二节、植物的脱毒技术 一、病毒的特性及其侵染 １病毒的特性 ２植物病毒的侵染途径 ３病毒在植物体内分布不均匀的原因 （１）分生组织中无微管系统，病毒不易移动。 （２）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很强，有竞争状态，抑制了病毒的复制。（３）在分生组织中存在高水平的内源激素，可以抑制病毒的增殖。 二、脱毒的方法 １物理方法
植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用人工培养基，对离体的植物胚胎、器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养 离体生态学：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件 外植体：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞 愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织 植物组织培养的特点 1.组培技术是无菌操作技术。 2.组培材料处于完全的异养状态。 3.组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞或原生质体。 4.组织培养物可以形成克隆（clone，无性繁殖系），也可以进行茎芽增殖或生根 5.组培容器内的气体和环境气体可通过封口材料进行交换，相对湿度通常是几乎100％，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。 6.组培的环境温度、光照强度和时间都是人为设定的，其参数可调 植物组织培养的研究类型 组织培养 器官培养 胚胎培养 细胞培养 原生质体培养 植物组织培养的研究任务 研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁植物的大量快速繁殖方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等 德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann于1838-1839年提出的细胞学说 德国植物学家Haberlandt于1902年提出了植物细胞具有全能性 李继侗和沈同1933年成功培养了银杏的胚。 1952年，Morel和Martin提出了植物脱毒（virus free）技术 Guha和Maheshwari等——花药培养 Cocking等-原生质体培养
0．填空 1.根据培养的材料,植物组织培养分:愈伤组织培养、(器官培养、细胞格养、原生质体培养(悬浮培养 2.植物组织培养的发展分为三个阶段:萌芽阶段、奠基阶段，快速发展和快速发展和应用阶段 3，1902年,Haberlandt提出了植物细胞“全能性”学说,1934年, White出版了《植物组织培养手册》培养等类型从而使植物组织培养为一门新兴学科。 一．填空、 1，组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器、调机、_天平、显微镜、_蒸馏水，发生器，酸度计 养基成分主要包括①无机营养成分、②有机营养成分)、_③植物生长调节物质、_④碳水化合物、⑤其它物质 3、培养基最常用的碳源是_蔗糖,使用浓度在1%-5%常用3% 4、糖在植物组织培养中是不可缺少的,它不但作为离体组织棱以生长的碳源而且还能维持培养基渗透压 5、在固体培养时琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物般用量6-10g/L之间 6.驯化的目的:在于于提高试管苗对外界环境条件的适应性,提高其光合作用的能力,促使试健壮,提高苗的移裁成活 7、生长素/细胞分裂素的高低决定着外植体的发育方向,其比值高:有利于根的形成和愈伤组织的形成:低:有利于芽的形成 8、培养基灭菌一般在108kPa的压力下,锅内温度达_121℃C,维持_20-30min、 9.选择外植体时应选择①选择优良的种质、②选健壮的植株、③选最适的时期和④选取适宜的大小。 10、诱导胚状体比诱导芽的优点:(1)数量多、(2)速度快、_(3)结构完整 11、试管苗的生态环境:高温且恒温、高湿、弱光、无菌 12、培养基中加入活性炭的目的:利用其吸附能力,减少一些有害物质的影响大 13、筛选培养基的方法:单因子试验法、多因子试验法、广谱实验法 14、植物培养技术:灭菌、接种种、培养、驯化四个环节 15、试管苗的驯化注意:基质、温、光、水、肥、气的综合管理 二．填空 1.绝大多数培养植物再生植株时都先经过愈伤组织阶段 2.愈伤伤组织形成大致经历诱导期、分裂期一和分化期三个时期 3、愈用植物生长调节物质时要注意:种类和浓度生长素和细胞分裂素的比值4.愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式 5.组织培养细胞再分化包括四个水平:细胞水平的再分化、组织水平的再分化、器官水平的再分化(器宣发生)和植株水平的分化 三．填空: 1.植物器官培养主要是指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。 2、茎尖培养根据培养目的和取材大小分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。前者主要是对茎尖长度不超过,最小只有几十微米的茎尖进行培养,目的是获得无病毒植株:后者是对几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养,目的是离体快繁 3.不定芽产生的途径一是从外植体上直接产生二是从由外植体诱导产生的愈伤组织上产生 4.离体叶培养是指包括叶原基、叶栖、叶鞘、叶片、子吐等叶组织的无菌培养 5.在离体叶培养中,6-BA和KT利于芽的形成;24D利于愈伤组织的形成 四．填空 1、胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养 2、离体胚的培养分为二种类型:。成熟胚培养和_幼胚培养六
植物快繁技术/植物克隆技术/植物傻瓜克隆技术/植物非试管高效快 繁技术 减小字体增大字体作者：本站来源：本站整理发布时间： 2008-1-1 18:33:32 植物快繁技术简介 所谓植物非试管高效快繁技术也就是植物克隆技术，也有人称之为植物非试管快繁技术、植物快繁技术、植物全光照喷雾育苗技术、全光雾插技术、微材料或微组织扦插育苗技术，喷雾育苗技术、喷雾扦插育苗技术、傻瓜克隆。无论叫做植物快繁还是植物克隆其原理和方法是一样的。 植物克隆技术（植物快繁技术）的关键是喷雾，十几年前就有权威单位推广全光照喷雾育苗技术，实际上也就是后来有人称之为植物非试管高效快繁技术，而现今更多被称为植物克隆、傻瓜克隆等时髦词汇。过去开发的喷雾全套设备是机械式，成本高达数万元，且容易锈蚀和损坏，一段时间后就没人再使用，而自从引进以色列微喷（头）技术后，微喷雾问题顺利以低成本形式解决，于是植物克隆技术（植物快繁技术）得以在全国迅速推广普及。 植物快繁技术（植物克隆技术）的推广的另一障碍就是自动控制仪的问题，进口的温湿控制设备好用但价格高，所谓的农业智能化计算机系统除了价格更高之外还总是不能成熟，使用起来问题百出，经常造成育苗的失败，笔者使用两年后才不得已开发了国产育苗仪，其低廉
的价格和丰富实用的功能很快被全国同行赏识。 植物克隆技术（植物非试管高效快繁技术）现在的投入只需2000余元，大力推广植物克隆技术、植物快繁技术利国利民。 植物非试管高效快繁技术的起源、应用和进展 植物傻瓜克隆技术是20年前从国外引进，又经过我国众多农业专家花费二十余年时间，逐步完善并成熟运用于规模生产一个系统配套，用于多种经济植物大规模无性快繁产业化生产的实用技术，又称非试管快繁技术、喷雾快繁技术等。此技术是一项崭新经济植物苗木快繁技术体系，它将植物组织培养快繁苗从试管培养基中解放到田间大地，是一场无性繁殖快速育苗的革命！是现代农业生物技术研究的一大创举！ 该技术育苗生产成本低，适用于国内外苗木交易市场和经济植物种苗繁殖工程。绿色快繁产业是一个永久性高效益产业，它可以带动制药产业、林纸产业、林草产业、园林绿化等其它产业，进而促进农业产业化、林业产业化、制药产业化和农业现代化的快速发展。还有利于生态城市、园林城市、森林公园、自然保护区的建设、生态环境改善、城市生态系统的改变、无性系造林、天然林保护工程、城市绿化工程以及与人们生活息息相关的如粮食作物、花卉、蔬菜、无公害蔬菜、野生蔬菜、濒危野生植物、果树、山野菜、药用植物、珍稀植物等高效经济植物以及新经济资源的开发利用。 植物快繁技术是古今中外人们十分关注的问题。从传统的扦插繁
植物组织培养：离体条件下利用人工培养条件在无菌情况下培养、生长、发育再生出完整植株的过程。外植体：由活体植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。植物细胞的全能性：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。脱分化：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。再分化经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。 第二章设备与培养条件 实验室组成：化学实验室、洗涤菌室、无菌操作室、培养室、细胞学实验室。1化学实验室：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。主要设备：药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器. 2 洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭菌器（如烘箱）等。3无菌操作室（接种室）：主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。4培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。主要设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、培养箱、紫外光源等。5细胞学实验室：用于对培养物的观察分析与培养物的计数等。主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、倒置显微镜等。6其他小型仪器设备：分注器、血球计数器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。 第三章培养基及其制备 培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。常用的培养基及特点如下：(1)MS培养基特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。(2)B5培养基其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。(3)White培养基其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。（4）N6培养基其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。(5)KM —8P培养基其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。1无机营养--①大量元素，指浓度大于0.5mmol／L的元素等。其作用是：(1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。(2)P 是磷脂的主要成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。(3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但(4)Mg、S和Ca、Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S 是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。②微量元素，作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节③缺素症④稀土元素，对试管苗的生长分化生根愈伤组织诱导生长体细胞胚的发生以及提高次生代谢物的产量有促进作用2有机营养成分①碳源，对细胞增殖起作用也影响细胞分化②维生素类，对生长分化等有很好促进作用③肌醇，糖类的转化中其重要作用，是细胞壁的构建材料④氨基酸，可直接被细胞吸收⑤天然复合物，对细胞的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显3培养材料的支持物4活性炭吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质，抑制外植体褐变防止玻璃苗的产生促进培养物生长和分化促进生根5抗生素防止外植体内生菌造成的污染6抗氧化物，作用抑制外植体的褐变7硝酸银促进愈伤组织器官发生或体细胞胚胎发生的作用，使原再生困难的物种分化再生植株母液的配置与保存：①大量元素母液，即含N.P.K.Ca.Mg.S等六种盐类的混合溶液，一般配成浓度10倍或20倍母液。②微量元素母液，含有除Fe以外的B.Mn.Cu.Zn,Mo.CL等盐类的混合溶液，因含量低，一般配成100倍或200倍母液。③铁盐母液④有机物母液⑤植物生长调节物质母液1生长素类，作用促进细胞伸长和分裂，促进生根抑制器官脱落，性别控制，延长休眠，顶端优势，单性结实等作用2细胞分裂素类作用，促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不定芽的形成，延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成。3赤霉素作用，加速细胞的伸长生长，促进细胞分裂。脱落酸具有抑制细胞分裂和伸长促进脱落和衰老促进休眠和提高抗逆等能力4多胺作用，调控部分植物外植体不定根不定芽画押体细胞胚发生发育以及延缓原生质体衰老促进原生质体分裂及细胞克隆形成方面具有明显的效果5多效唑作用，控长矮化，促进分枝，分嶪促进生根成花坐果，延缓衰老，提高叶绿素含量，增强植物抗逆性等培养基的配置准备工作1实验用具的准备2试剂药品的准备3 Vo=V1/t 或Vo=(C1*V1)/Co Vo=吸取母液体积（mL）V1=配置培养基体积（mL）Co=母液浓度（mg/L）C1=配置培养基的浓度（mg/L）T=母液扩大倍数①取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯内，加蒸馏水至培养基最终体积的3/4在恒温水浴中加热使之溶解，加热过程应不断搅拌，防治结块。②根据计算所需量一次加入大量元素微量元素铁盐有机物生长调节物质母液及其他特殊附加物，搅拌均匀。③加水定容至规定体积，搅拌均匀。④调整培养基的PH值。⑤分装⑥封口 第四章植物材料 植物材料幼年期特点：植物生长快，呼吸强，核酸代谢和蛋白质合成快。成年期：代谢和生理活动慢，光合速率和呼吸速率下降。外植体的选择：1植物的种质选择2外植体的增值能力3外植体的大小4外植体的年龄和着生部位5取外植体的季节和时间6木本材料的特殊性灭菌的常用化学药品:1乙醇2升汞3次氯酸钠4漂白剂5过氧化氢6其他用于外植体体表灭菌的化学药品①茎尖茎段以及叶片等材料的灭菌流水冲洗，70％乙醇浸泡，冲洗，取0.1％升汞。最后用无菌水洗涤干净，备用。②果实和种子的灭菌冲洗20min 再用70％乙醇灭菌30s，用无菌水洗涤3次，取出果实内种子进行培养。如暴露了，用10％次氯酸钙溶液浸泡30min。
植物组织培养的基本步骤 成熟细胞离体——（脱分化）——分生细胞——（分裂）——愈伤组织——（再分化）——形态建成————完整植株。 培养基的主要成分 【水分】 【无机盐】1.大量元素：N，P，K，Ca，Mg，S（由相关的无机盐提供） 2.微量元素：Fe，B，Cu，Mn，Mn，Zn，Co 【有机营养成分】1.糖类 2.维生素 3.氨基酸 4.肌醇 5.天然有机物【植物生长调节剂】1.生长素 2.细胞分裂素 3.其他生长调节剂 【凝固剂】琼脂 【其他物质】1.活性炭 2.抗生素 3.抗氧化物质 4.硝酸银 培养基和组织培养用具的灭菌方式 【培养基，无菌水】高压蒸汽灭菌，0.105MPa灭菌15~30分钟 【移栽基质】曝晒，甲醛熏蒸或高压蒸汽灭菌0.14MMPa灭菌1~2h 【接种室，缓冲室】紫外线灯照射30min，或气雾消毒剂 【超净工作台】紫外线灯30min，之后打开风机过滤除菌 【外植体】不同的化学消毒剂浸泡消毒 【接种工具】70%乙醇浸泡或擦拭，之后用火焰灼烧灭菌 【培养室】3%来苏尔喷雾，或甲醛，气雾消毒熏蒸 【皮肤】先用肥皂洗手，接种前用70%乙醇擦拭 【瓶口，管口】70%乙醇擦拭，用火焰封口
【培养瓶表面】70%乙醇擦拭 【台面，桌面】70%乙醇擦拭或喷雾消毒 植物外植体的灭菌方式 【茎尖，茎段，叶片】1. 用70%乙醇浸泡30秒，再用无菌水冲洗1次。 2.用2%次氯酸钠浸泡15min或0.1%升汞浸泡5~10min。 3.若材料有绒毛，最好在消毒液中加入几滴吐温。 4.消毒时要不断震荡，使植物材料与消毒剂充分接触。 5.最后用无菌水冲洗3~5次。 【果实】1.用乙醇迅速漂洗一下，再用无菌水冲。 2.用2%次氯酸钠浸泡10min，用无菌水冲洗2~3次。 【种子】用10%次氯酸钠浸泡20~30min，或0.1%升汞消毒5~10min，然后再用无菌水冲洗3~5次。 【花蕾】1.用70%乙醇浸泡10~15秒，无菌水冲洗一次。 2.在漂白粉中浸泡10min，用无菌水冲洗2~3次。 【根及地下部器官】用0.1%升汞浸泡5~10min 或用次氯酸钠浸泡10~15min，再用无菌水冲洗3~5次。 【消毒后的外植体应及时按照无菌操作技术接种在适宜的培养基上】
植物组织培养复习题（习题） 一、名词解释 愈伤组织：在培养基上由培养物产生的无序生长且没有一定结构的薄壁细胞团。 外植体：在组织培养中，由植物体上取下来进行离体培养的那部分组织或器官. 脱分化：由高度分化的植物器官，组织或细胞经过离体培养，产生愈伤组织的过程。 半连续培养：利用培养罐进行大量细胞培养的一种方式。 无性系变异：由任何形式的细胞培养所产生的植株所表现出来的差异。 胚状体：在离体植物细胞、组织或器官培养过程中，由一个或一些体细胞，经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。 看护培养：用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织培养细胞的一种方法。 无融合生殖：由配囊中卵细胞以外的其他细胞发育成的单倍体植株。 种质：亲代通过生殖细胞活体细胞直接传递给子代并决定固有生物性状的遗传物质。 悬浮培养：将游离的植物单细胞或小细胞团，按一定的细胞密度在受到不断拉动或摇动的液体培养基中进行培养的一种方式。 早熟萌发：在培养后迅速萌发为幼苗，不继续进行胚状生长，超过正常发育阶段。 选择压：在2个相对性状之间，一个性状被选择而生存下来的优势。 细胞全能性：任何有完整细胞核的植物细胞具有全部的遗传信息，在一定条件下，均具有分化，发育成完整植株的潜在能力。 条件培养基：在培养集中加入高密度的细胞进行培养，经过一段时间后，这些细胞向培养基中分泌一些促进细胞生长的活性物质，使培养基条件化，使原来在合成培养基上不能分裂的细胞发生分裂。 离体授粉：将未授粉的胚珠，子房或柱头从母体上分离下来，进行无菌培养，并通过一定的方式授给无菌花粉，使其在试管内实现受精的技术。 同步化培养：培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。
试卷编号NO: 高等函授教育《植物组织培养》试题 学号: 姓名: 一名词解释:(10*2分=20分) 1、植物细胞组织培养 2、细胞全能性 3、脱分化 4、外植体 5、试管苗驯化 6、间接不定芽发生 7、双极性 8、微体嫁接 9、人工种子 10、体细胞无性系变异 二填空:(30*1分=30分) 1、目前植物组织培养应用最广泛的方面就是 与。 2、由脱分化的细胞再分化出完整植株有两种途径,一种叫做 ,另一种叫做。 3、培养用具的常用灭菌方法有、、 。 4、某些生长调节物质及抗生素、酶类物质遇热不稳定,对其灭菌时不能进行 ,而要进行。 5、一般来说,黑暗条件下有利于的增殖,而往往需要一定的光照。 6、植物离体授粉技术通常包括、、 三个方面。 7、一般液体培养的继代时间较短, 继代一次;而固体培养继代时间可以长些, 继代一次。 8、外植体器官发生的三种途径包括、、。 9、从再生植株倍性来瞧,小孢子培养通常产生植株,胚培养通常产生植株, 通常产生三倍体植株。 10、脱毒苗鉴定与检测的主要方法有、、 、。 11、在生长素中, 对于许多作物花粉的启动、分裂、形成愈伤组织与胚状体起着决定性作用,但就是对却有抑制作用。 12、用平板培养法培养单细胞或原生质体时,常用 来衡量细胞培养效果。 13、用药剂处理就是诱导染色体加倍的传统方法。 三计算题(1*10分=10分) 某培养基的配方就是MS＋BA 2、0mg/L＋NAA 0、5mg/L＋2、5%蔗糖＋0、7％琼脂粉。MS母液的浓度分别就是:大量元素２０倍,微量元素500倍,铁盐100倍,有机物５０倍;BA母液浓度1、0 mg/ml ,NAA母液浓度0、1mg/ml。要配制400ml该培养基,需要吸取各种母液各多少ml？分别称取蔗糖、琼脂粉各多少克？(要求写出计算步骤) 四简答题(5*5分=25分) 1、造成组织培养过程中发生污染的原因有哪些？如何有效控制污染？ 2、简述外植体消毒的一般步骤。 3、胚培养在科学研究及生产实践中有哪些应用？ 4、结合花粉培养,简述瞧护培养法。
康乃馨的离体快繁开题报告 学生姓名：姜平阳张骏驰李凯 班级：14生本2 专业：生物技术 学部：生物医药 指导教师：严铮辉 二〇一七年三月
一、实验目的 掌握植物离体快速繁育原理、方法和完整过程。 二、实验原理 康乃馨又名香石竹,花色艳丽,开花时间长,装饰效果好,是世界上最畅销的切花之一,具有较高经济价值。由于病毒病侵害,常使植株矮化,花朵变小,花色产生斑点,退色甚至不开花,影响切花产量和质量。通过茎尖分生组织培养,能够获得“无病毒”的健康植株,对于引进的少而新的脱毒种苗,再进行一次茎尖培养,进一步降低基础苗中的病毒含量,并通过组织培养的方法快速繁殖,在短期内,就可以获得大量的脱毒试管苗,使引入材料迅速在生产上推广应用,取得明显的经济效益。 三、实验仪器与材料： 1.材料康乃馨枝条 2.仪器设备 超净工作台，带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水 培养基MS+1mg/L 6-BA 剪刀，镊子 量筒，酒精灯，滤纸，蒸馏水，小刷子 纱布，棉塞，牛皮纸，标签纸，肥皂，酒精喷壶 3.试剂 95%乙醇，70%酒精，70%酒精棉球 四、培养基的配方 （1）香石竹的生芽培养基
MS+ IAA (0.1mg/L) + BA( 2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)+蔗糖（30g/L）+琼脂(8g/L)，pH5.8-6.0,配制0.3L,用小培养瓶分装10~15瓶。 另外，需要制备无菌水20瓶（大培养瓶），每人3~4瓶，，纱布、碟子若干，后二者分别用报纸包好一同灭菌。 （2）香石竹的继代培养基 MS+ BA( 0.3mg/L)+NAA(0.2mg/L)+蔗糖（30g/L）+琼脂(8g/L), pH5.8-6.0,配制0.3L,用小培养瓶分装10-15瓶。 另外，需要制备无菌水20瓶（大培养瓶），每人3-4瓶，，纱布、碟子若干，后二者分别用报纸包好一同灭菌。 （3）香石竹的生根培养基 MS+生根培养基为1/2MS+NAA(0.075mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂 (8g/L)，pH5.8-6.0,配制0.3L,用小培养瓶分装10-15瓶。 另外，需要制备无菌水20瓶（大培养瓶），每人3-4瓶，纱布、碟子若干，后二者分别用报纸包好一同灭菌。 五、实验步骤 1.灭菌 （1）实验室及超净台消毒 先进行无菌室内消毒，用紫外线照射30-45分钟，地面消毒，紫外灯关闭约20min后方可进去工作。对超净工作台进行消毒，开启无菌风开关，开启紫外，让无菌风吹上15-20min后方可工作。并用70%的酒精棉台擦净工作台 （2）外植体灭菌
第五章植物的胚胎培养及离体授粉 胚胎培养的内容及概念 植物胚胎培养:是指胚和胚器官（子房、胚珠）在离体条件下培养发育成完整植株的技术。 植物胚胎培养包括：胚培养、胚珠培养、胚乳培养、子房培养、试管受精 1）胚培养 √成熟胚培养：将受精后果实或种子，药剂灭菌后，剥出种胚于培养基上，使裸露的胚在人工控制条件下发育成植株。√幼胚培养：将授粉后子房剥离消毒，再将胚龄处于原胚期、球形期、心形期、早鱼雷期的幼胚从胚珠中剥出，在人工控制条件下，发育成为一棵完整的植物体。 2）胚乳培养 指处于细胞期胚乳的离体培养,使之分化发育为完整植株。 3）胚珠培养:是将授粉的子房在无菌的条件下解剖后，取出胚珠置于培养基上培养形成幼苗的技术 √未受精的胚珠培养，目的是为试管受精提供雌配子体。 √受精后的胚珠培养，胚珠内胚的发育处于早期阶段，从两个细胞的原胚开始到球形胚阶段。 4）子房培养是指将子房从母体上分离下来，放在人工配制的培养基上，使其进一步生长发育成为幼苗的过程。 胚珠和子房培养又分为受精前和受精后的培养。 5）试管受精 指培养未受精的胚珠并在试管内撒播花粉，使其受精形成具有活力的种子。 在高等植物种间或属间远缘杂交时的问题: ①受精前障碍:由于不亲和性，常常还会发生花粉不能在异种植物柱头上萌发或花粉管生长受到抑制不能进入子房。——离体授粉受精 ②受精后障碍:即使受精，由于胚和胚乳之间的不亲和性，造成胚乳发育不良，或杂种不能发育成熟，使胚在早期败育。——胚培养，有可能获得杂种植株。 第一节植物胚培养 一、胚培养类型 两类:成熟胚培养与幼胚培养 成熟胚一般在比较简单的培养基上就能萌发生长，成熟。胚生长依赖胚乳、子叶的贮藏营养，对培养基的要求简单。只要提供合适的生长条件以及打破休眠，即可萌发成幼苗。 成熟胚培养技术要求不严格，将受精后的果实或种子（带种皮），表面消毒后，剥取种胚,接种于培养基上，即可发育成为一个完整的植物体。 幼胚指尚未成熟（发育早期）的胚。在离体培养时比成熟胚培养困难，要求的技术和条件较高。 幼胚离体培养中的生长方式（三种）： 胚性发育：继续进行正常的胚胎发育，维持胚性生长，形成成熟胚（类似种子）再按种子萌发途径出苗形成完整植株（一个胚只形成一个植株）。 早熟萌发:是在培养后迅速萌发为幼苗，不继续进行胚性生长，越过正常胚发育阶段，在未达到生理和形成成熟胚的情况下，萌发长成幼苗。（早熟萌发形成的幼苗往往畸形瘦弱，甚至引起死亡。） 形成愈伤组织：多数情况下，幼胚在离体培养中首先细胞分裂形成愈伤组织，再分化形成植株。（为胚性愈伤组织，易形成植株） 二、培养方法 远缘杂交中离体胚的培养主要是培养幼胚，幼胚培养技术在育种中更为重要。 幼胚离体培养中，维持培养的胚胎进行正常的胚性生长，是胚培养的关键问题。 幼胚（未成熟胚）一般不能像成熟胚一样在简单培养基上生长，它们比成熟胚对营养的需要更为复杂，为了使不能产生杂种的远缘杂交中获得杂种，主要是改良培养基，使离体幼胚能沿着胚珠内胚胎发生的途径发育（维持胚性生长）。 胚培养研究最多的是荠菜和大麦这两种被子植物，此外在曼陀罗属、柑桔属和菜豆属中，也进行了大量工作。 胚胎发育过程分为两个时期（根据胚对营养的需要）： ①异养期（heterotrophy period），即在胚发育早期，幼胚由胚乳及周围的组织提供养分。 ②自养期(autotrophy period) ，胚在代谢上已经能在基本的无机盐和蔗糖的合成培养基上生长，在营养上已相当独立。 幼胚培养不同时期对培养基要求不一样，异养期培养基成分复杂，自养期则相对简单。