基因工程基本过程
基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA 技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA 结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。
常用的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割
DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化
核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接
核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成
核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割
核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰
其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
主要过程有为四步：
一．获得目的基因
有多种方法可获得目得基因
1.构建cDNA文库分离目的基因
过程：
（1）从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA的第一条链。
（2）以第一条链为模板，以反转录酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。
（3）在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。
（4）接头或衔接子连接。
（5）凝胶过滤分离cDNA。
（6）通过核酸探针法或免疫反应法从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。
2.人工化学合成法
适于已知的核苷酸序列且校小的ＤＮＡ片断合成，常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。
过程：先用以上方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡核苷短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的ＤＮＡ片段，再用连接酶连接成完整的基因。
3.利用PCR技术直接扩增目的基因
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程，用ＰＣＲ法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。
二．载体的选择与制备
1.载体的选择（以质粒为例）
⑴载体必须是复制子。
⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。
⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小，拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
(6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别
(7)应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。
(8)应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNA较为稳定。
(9)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。
2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。
目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。
在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA 却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。
三．构建基因表达载体
1.用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出粘性末端。
2.用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。
3.将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。
四．目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞－农杆菌转化法
2.将目的基因导入动物细胞－显微注射法
3.将目的基因导入微生物细胞（以大肠杆菌为例）
（1）用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.
（2）将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.
（3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。
五．目的基因的检测与鉴定
1.要检测目的基因是否插入转基因生物染色体的DNA上
检测方法：采用DNA分子杂交技术
2.检测目的基因是否转录了mRNA
检测方法：同样用分子杂交技术DNA与RNA杂交
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
检测方法：提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。
基因工程制药实例及意义
抗生素类
传统的抗生素生产，主要利用化学合成或微生物发酵来获得，其生产过程中菌种的表达水平比较低，生产成本比较高，而且在使用过程中容易产生耐药菌群。而利用基因工程技术可以对生产菌种进行基因改造，得到表达水平高、产品目的性强的菌株，如大肠杆菌生产青霉素酞胺酶。德国一个科研小组对生产半合成青霉素的材料6APA．用基因工程来增强大肠杆菌的青霉素酰胺酶活性。将大肠杆菌的基因PBR322的质粒克隆化所形成的菌株，其酶活力比原株提高50倍．从而提高6APA生产能力。我国王以光利用基因重组技术对螺旋霉素产生菌进行改造，增强了丙酰基转移酶的基因在螺旋霉素产生菌中的表达，并提高了丙酰螺旋霉素的产量。
基因工程制药 姓名：惠霞 学号：2011506024 班级：2011级生技1 班
基因工程制药 一．基因工程制药常用的工具酶： 基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。 (一) 限制酶(Restriction enzymes) 限制酶即限制性核酸切酶的简称，是一类专一性很强的核酸切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。限制酶的种类 Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。 Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。 (二) DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。 1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断 3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 5. T aqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶 6. 反转录酶
（三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。 1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。 2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。 （四）基因工程中常用的其他酶 1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶） 2. T4噬菌体多核苷酸酶 3. 核酸酶（Nuclease） 4. 碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA和RNA 分子中的5' 磷酸基（脱磷酸作用）。分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP），牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）。 二．基因工程制药中常用的克隆载体 载体：能在细胞进行自我复制的DNA分子就是外源DNA片段（基因）的运载体（Vector）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体和粘粒。 （一）质粒 1.质粒（Plasmid）是一些存在于微生物细胞染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。 2 常用的几种质粒载体 （1）pBR322及其衍生载体 pBR322 最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6×106u，4.36kb，属松弛型复制，含有两个抗性基因（Tetr和Ampr），已确定32个限制酶切割位点的相对位置。BamH I
基因工程基本过程 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA 技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA 结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。 常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 主要过程有为四步： 一．获得目的基因 有多种方法可获得目得基因 1.构建cDNA文库分离目的基因 过程： （1）从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA的第一条链。 （2）以第一条链为模板，以反转录酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。 （3）在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。
（4）接头或衔接子连接。 （5）凝胶过滤分离cDNA。 （6）通过核酸探针法或免疫反应法从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 2.人工化学合成法 适于已知的核苷酸序列且校小的ＤＮＡ片断合成，常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。 过程：先用以上方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡核苷短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的ＤＮＡ片段，再用连接酶连接成完整的基因。 3.利用PCR技术直接扩增目的基因 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程，用ＰＣＲ法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。 二．载体的选择与制备 1.载体的选择（以质粒为例） ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 (6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别 (7)应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 (8)应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNA较为稳定。 (9)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。 2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。
一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是专题1《基因工程》的第二节，也是《基因工程》的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》，下接《基因工程的应用》。本节课主要介绍了基因工程的基本操作程序的四个步骤，教学内容多，难点多，最好化整为零、各个击破。 二、教学目标 1．知识目标： 简述基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）关注基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 三、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 四、学情分析 本节课内容较多，难点较多，学生学习起来有一定困难，所以之前应该要求学生做好预习，尽量采用化整为零、各个击破的教学策略。 五、教学方法 1、学案导学：见学案。 2、新授课教学基本环节：预习检查、总结疑惑→情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→发导学案、布置预习 六、课前准备 1．学生的学习准备：预习《基因工程的基本操作程序》，初步把握基因工程原理及基本操作程序。 2．教师的教学准备：多媒体课件制作，课前预习学案，课内探究学案，课后延伸拓展学案。 七、课时安排：2课时 八、教学过程 （一）预习检查、总结疑惑 检查学生落实预习的情况并了解学生的疑惑，使教学具有针对性。 （二）情境导入、展示目标 教师首先提问： （1）什么是基因工程？（基因工程的概念） （2）DNA重组技术的基本工具有哪些？（限制酶、DNA连接酶、载体） （3）运载体需要具备哪些条件？（有一个或多个限制酶切割位点；有标记基因；能在受体细胞中稳定存在并自我复制或者整合到受体细胞染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制） 上节课我们学习了DNA重组技术的基本工具，本节课我们将继续学习《基因工程》的核心内容——基因工程的基本操作程序。我们来看本节课的学习目标。（多媒体展示学习目标，强调重难点） （三）合作探究、精讲点拨
第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程： 第一步：加热至90～95℃DNA解链； 第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞_ 1. 转化的概念： 是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和表达 1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA
基因工程的基本操作程序 教案 Prepared on 24 November 2020
专题一基因工程的基本操作程序 一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是专题1《基因工程》的第二节，也是《基因工程》的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》，下接《基因工程的应用》。本节课主要介绍了基因工程的基本操作程序的四个步骤，教学内容多，难点多，最好化整为零、各个击破。 二、教学目标 1．知识目标： 简述基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）关注基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 三、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 四、学情分析
本节课内容较多，难点较多，学生学习起来有一定困难，所以之前应该要求学生做好预习，尽量采用化整为零、各个击破的教学策略。 五、教学方法 1、学案导学：见学案。 2、新授课教学基本环节：预习检查、总结疑惑→情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→发导学案、布置预习 六、课前准备 1．学生的学习准备：预习《基因工程的基本操作程序》，初步把握基因工程原理及基本操作程序。 2．教师的教学准备：多媒体课件制作，课前预习学案，课内探究学案，课后延伸拓展学案。 七、课时安排：2课时 八、教学过程 （一）预习检查、总结疑惑 检查学生落实预习的情况并了解学生的疑惑，使教学具有针对性。 （二）情境导入、展示目标 教师首先提问： （1）什么是基因工程（基因工程的概念） （2）DNA重组技术的基本工具有哪些（限制酶、DNA连接酶、载体）（3）运载体需要具备哪些条件（有一个或多个限制酶切割位点；有标记基因；能在受体细胞中稳定存在并自我复制或者整合到受体细胞染色体DNA 上随染色体DNA的复制而同步复制）
“基因工程的基本操作程序”教学设计 1 教材分析 《基因工程的基本操作程序》是人教版选修3专题1基因工程中第2节内容，本节是《基因工程》专题的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》一节，下接《基因工程的应用》。 对于基因工程，学生接触得很少，文字描述中会感到抽象，为此，教材中采用形象化得呈现方式简述了基因工程基本操作程序的四个步骤。例如，基因文库中把基因组文库比作国家图书馆，而把cDNA文库比作某市图书馆，这样便于学生理解和掌握。此外，在教材处理中还呈现主干，割舍枝杈，将非主干内容以《生物技术资料卡》、《拓展视野》等方式呈现，做到有主有次。 2 学情分析 学生经过上一节的学习已经掌握DNA重组技术所需三种基本工具的作用及基因工程载体所需条件等知识，具备学习基因工程的基本操作程序一节的基础；而且经过一年必修教材的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，应在教师引导下适时加强学生解决问题和运用概念图等生物学语言归纳结论等方面的能力。 3 教学目标 3.1 知识目标 ⑴简述基础理论研究和技术进步催化了基因工程 ⑵简述基因工程的原理和基本步骤 3.2 能力目标 ⑴学会运用概念图总结基因工程的基本步骤及方法 ⑵尝试运用基因工程原理，提出解决某一实际问题的方案 3.3 情感态度与价值观 ⑴关注基因工程的发展 ⑵认同基因工程的应用促进生产力的提高 4 教学重点与难点 4.1 教学重点基因工程基本操作程序的四个步骤 4.2 教学难点 ⑴从基因文库中获取目的基因 ⑵利用PCR技术扩增目的基因 5 教学整体思路 采用从“整体-部分-整体”的教学思路，首先引用基因工程案例使学生从整体上了解基因工程的四个步骤，其次采用分步探究的形式帮助学生理解各个步骤的原理、方法和过程，最后教师引导学生用概念图将所学的知识从整体上再次整合。
水寨中学生物自主探究学案 内容：基因工程的基本操作程序课时：2课时年级：高二编号64 一、教学目标 1．知识目标： 了解基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）了解基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 二、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 第一课时 三、教学过程 （一）复习上节内容 1、什么是基因工程？DNA重组技术的基本工具有哪些？运载体需要具备哪些条件？ 以上问题可以不展示 （二）讲授新课 1、基因工程的基本步骤包括那四步？ 2、第一步：目的基因的获取 （１）为什么要有目的基因的获取这一步骤？ （２）目的基因的获取方法有哪些？ （3）为什么要建立基因文库？怎么建立的？
（4）如何从基因文库中获取目的基因？ （5）为什么要建立cDNA文库？如何获取cDNA？ （5）PCR技术的原理是什么？利用PCR技术扩增目的基因的前提是什么？ （6）如何获取引物？ （7）请你用文字和箭头描述PCR技术扩增的过程？ 3、第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤） （1）在基因工程的操作过程中，为什么要构建基因表达载体？单独的DNA片段能不能稳定遗传？ （2）参考课本P11页图1—10基因表达载体模式图，在学案上绘出基因表达载体的模式图，并标出其组成部分。并了解什么是启动子、终止子？他们位于哪里？有什么作用？标记基因的作用是什么？
思考:1、作为基因工程的表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么 2、完成教材P11页的“寻根问底” 第二课时 4、第三步：将目的基因导入受体细胞 （1）为什么要把目的基因导入受体细胞而不是在外界培养让其维持稳定和表达？（2）什么是转化？ （3）将目的基因导入植物细胞的方法有哪些？最常用的方法是哪种？（结合示意图，了解农杆菌转化法的基本过程） （4）将目的基因导入动物细胞的基本操作程序是怎样的？要用到什么技术？ （5）早期的基因工程为什么选择原核生物作为受体细胞？大肠杆菌细胞最常用的转化方法是？
基因工程的基本内容 基因工程的基本内容一.本周教学内容：基因工程的基本内容二.学习内容：本周学习基因工程的操作过程，指导进行基因工程操作时需要的基本工具：限制酶、连接酶、运载体，了解他们的特点，及其在基因工程中的应用。理解基因工程操作的基本步骤，理解如何提取目的基因，怎样将目的基因导入受体细胞，怎样鉴定试验的成果等等。基因工程的基本内容 一. 本周教学内容： 基因工程的基本内容 二.学习内容： 本周学习基因工程的操作过程，指导进行基因工程操作时需要的基本工具：限制酶、连接酶、运载体，了解他们的特点，及其在基因工程中的应用。理解基因工程操作的基本步骤，理解如何提取目的基因，怎样将目的基因导入受体细胞，怎样鉴定试验的成果等等。了解基因工程对现代社会的贡献及基因工程应用的发展。 三. 学习重点： 1. 基因工程的概念 2. 基因工程的操作工具 3. 运载体的基本条件 4. 基因工程的基本操作步骤
5. 基因工程的应用和发展 四. 学习难点： 1. 基因工程工具：限制酶、运载体 2. 运载体的基本要求 3. 基因工程的操作步骤 4. 如何检测基因操作 5. 基因工程应用的两面性 五. 学习过程： （一）概念：基因工程——又叫基因拼接技术或DNA重组技术。 是指在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。 概念要点： 1. 在DNA分子水平上进行设计操作的 2. 在生物体外实现的基因改造 3. 对受体细胞进行无性繁殖 4. 重组基因最终表达获得性状 （二）基因操作的工具 1. 抗虫棉的培育：将抗虫的基因从某种生物（如苏云金芽孢杆菌）中提取出来，“插入”到棉花的细胞中，及棉细胞
基因工程的基本过程 基因工程主要包括几个过程： 1、目的基因的制备； 2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连接生成重组DNA分子； 3、将重组DNA片段导入受体； 4、选择目的基因； 5、目的基因的表达。 对于整个基因过程来讲，目的基因的获取是关键，它直接涉及到产物，而且还影响到产物的量。很多在基因操作过程中，目的基因是很难获得的，所以通常采取先生成基因文库的方法，然后从基因文库中筛选。如果目的基因的序列以及它的调控等信息很清楚，可以直接通过PCR或cDNA获取，这样就大大减少了选择目的基因的盲目性，可以将整个过程简化为以下步骤： 图10-3-8 基因工程过程
(1)目的基因的分离和制备 目的基因是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。获得目的基因的方法很多，但也是十分困难的一步。目前获得目的基因有4条途径： 1.从生物基因组群体中分离目的基因 原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。 图10-3-1 限制性内切酶
限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种限制酶，都有自己特定的作用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构（palindromes）。例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。多在原核生物中存在，能识别4～6个特苷酸特定的碱基序列。限制酶对细菌有保护作用，某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因此而得名。限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保护之故。 这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比较大的基因组，可以先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。 2.人工合成目的基因DNA片段 人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。 3.PCR反应合成DNA 聚合酶链式反应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。PCR技术的原理如下：
《基因工程的基本操作程序》教学设计 教学目标 1.简述基因工程原理及基本操作程序。 2.尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3.培养学生探索科学的严谨态度 教学重难点 【教学重点】 基因工程基本操作程序的四个步骤。 【教学难点】 （1）从基因文库中获取目的基因。 （2）利用PCR技术扩增目的基因。 教学工具 多媒体 教学过程 复习提问： 1.DNA重组技术的基本工具有那些，各自的作用和特点是什么？ 2.我们所学过的育种方法有那些？其中基因工程育种有那些优点？ 导入：通过基因工程的概念我们可知,我们能够应用DNA重组技术和转基因技术赋予生物以新的遗传特征，但是无论是DNA重组技术还是转基因技术都需要找到对我们有利的目的基因，我们该如何去寻找目的基因哪，目的基因又将如何连接到载体上哪，以及如何将载体导入受体？这些都是我们所要共同探究的问题!现在让我们共同学习一下1.2基因工程的基本操作。 思考1.我们在前面提到的苏云芽孢杆菌中的抗虫基因、胰岛素基因、干扰素基因等都可以作目 的基因。可是要在浩瀚的“基因海洋”中，找到特定的目的基因可以用什么样的方法和途径呢？ 2、基因工程的基本操作程序主要包括：、 、 新课教学：
基因工程的基本操作步骤主要包括：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 一．目的基因的获取 1．目的基因：主要是指编码蛋白质的结构基因。 2．目的基因的获取方法： （1）从基因文库中获取 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。 构建基因文库的目的：为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 基因组文库：含有一种生物的所有基因。 部分基因文库（如cDNA文库）：含部分基因，可由mRNA反转录而来。 （2）利用PCR技术扩增目的基因 PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 原理：DNA双链复制 原料：模板DNA；RNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子 方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物与单链相应互补序列结合、DNA 聚合酶作用下延伸合成互补链。 特点：指数形式扩增 二．基因表达载体的构建 1．目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在；可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。 目的基因： 2．基因表达启动子：位于基因首端，RNA聚合酶识别和结合的部位， 驱动转录基因 载体的组成终止子：位于基因尾端，使转录在所需要的地方停下来 标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因
1．2基因工程的基本操作程序 【课标要求】 1．简述基因工程基本操作程序的四个步骤 2．尝试设计某一转基因生物的研制过程。 【本节重难点】 重点：基因工程基本操作程序的四个步骤 难点：（1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 【学习过程】 一、基因工程的基本操作程序简述 ①目的基因的； ②的构建； ③将目的基因； ④目的基因的。 二、基因工程的基本操作程序 （一）目的基因的获取 1．目的基因：主要是指的基因，也可以是一些具有作用的因子。 2．原核细胞和真核细胞的基因结构 （1）原核细胞的基因结构 （2）真核细胞的基因结构
3．目的基因的获取 目的基因可以从中分离出来，也可以用合成。 常用的方法有以下几种： （1）从基因文库中获取目的基因 ①基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） 基因组文库cDNA文库 文库类型cDNA文库基因组文库 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种间的基因交流 ②从基因文库中得到目的基因，可以根据一些信息，如根据基因的、 基因的、基因在染色体上的、基因的，以及基因的等特性。 （2）利用PCR技术扩增目的基因 ①PCR是____________________________________技术，是的缩写。
②原理：____________________。， ③前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_________。 ④条件：DNA模板、。 ⑤扩增过程： a．变性（℃）：目的基因DNA受热变性后接连为单链b．退火（℃）：与单链相应互补序列结合 c．延伸（℃）：在的作用下进行延伸 Taq酶的特点是。 PCR技术与DNA复制的比较： PCR技术DNA复制相 同 点 原理 原料 条件 不 同 点 解旋方 场所 酶 结果 （3）化学法直接合成
基因工程综合检测 一、选择题 1．下列关于基因工程技术的叙述，正确的是( ) A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列 B．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因 D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达 2．下列关于基因工程的说法中，正确的是( ) A．基因工程的设计和施工都是在细胞水平上进行的操作 B．目前基因工程中所有的目的基因都是从供体细胞中直接分离得到的 C．只要检测出受体细胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功表达 D．基因工程能使科学家打破物种界限，定向改造生物性状 3．甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是( ) A．甲方法可建立该细菌的基因组文库 B．乙方法可建立该细菌的cDNA文库 C．甲方法要以脱氧核苷酸为原料 D．乙方法需要逆转录酶参与 4．中美科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠Hobbie－J，Hobbie －J比普通老鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。下列关于Hobbie －J产生过程的描述，错误的是( ) A．NR2B基因可通过PCR技术进行扩增 B．改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内 C．通常采用显微注射法将改变后的NR2B基因重组质粒导入小鼠受精卵内 D．可采用基因探针检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内 5．下列说法不正确的是( ) A．基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的 B．基因文库包括基因组文库、cDNA文库等 C．基因工程的核心是基因表达载体的构建 D．外源基因插入到转基因生物染色体DNA上后就能够表达 6．土壤农杆菌含有一个大型的Ti质粒(如下图所示)，在侵染植物细胞的过程中，其中的T－DNA片段转入植物的基因组。若想用基因工程并通过土壤农杆菌向 某种植物中导入抗旱基因，以下分析不合理的是( ) A．若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T －DNA片段内，且要保证复制起始点和用于转移T－DNA的基因片段不
“基因工程的基本操作程序”一节的教学设计 1 教材分析 《基因工程的基本操作程序》是人教版选修3专题1基因工程中第2节内容，本节是《基因工程》专题的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》一节，下接《基因工程的应用》。 对于基因工程，学生接触得很少，文字描述中会感到抽象，为此，教材中采用形象化得呈现方式简述了基因工程基本操作程序的四个步骤。例如，基因文库中把基因组文库比作国家图书馆，而把cDNA文库比作某市图书馆，这样便于学生理解和掌握。此外，在教材处理中还呈现主干，割舍枝杈，将非主干内容以《生物技术资料卡》、《拓展视野》等方式呈现，做到有主有次。【1】 2 学情分析 学生经过上一节的学习已经掌握DNA重组技术所需三种基本工具的作用及基因工程载体所需条件等知识，具备学习基因工程的基本操作程序一节的基础；而且经过一年必修教材的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，应在教师引导下适时加强学生解决问题和运用概念图等生物学语言归纳结论等方面的能力。 3 教学目标 3.1 知识目标 ⑴简述基础理论研究和技术进步催化了基因工程 ⑵简述基因工程的原理和基本步骤 3.2 能力目标 ⑴学会运用概念图总结基因工程的基本步骤及方法 ⑵尝试运用基因工程原理，提出解决某一实际问题的方案 3.3 情感态度与价值观 ⑴关注基因工程的发展 ⑵认同基因工程的应用促进生产力的提高 4 教学重点与难点 4.1 教学重点基因工程基本操作程序的四个步骤 4.2 教学难点 ⑴从基因文库中获取目的基因 ⑵利用PCR技术扩增目的基因 5 教学整体思路 采用从“整体-部分-整体”的教学思路，首先引用基因工程案例使学生从整体上了解基因工程的四个步骤，其次采用分步探究的形式帮助学生理解各个步骤的原理、方法和过程，最后教师引导学生用概念图将所学的知识从整体上再次整合。【2】 6 教学过程 教学环节教师行为 学生 活动 导入新课1）出示我国有知识 产权的转基因抗 虫棉的培育图解 2）质疑：转基因抗 看图并回 答：首先
专题一1.2 基因工程的基本操作程序 一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是专题1《基因工程》的第二节，也是《基因工程》的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》，下接《基因工程的应用》。本节课主要介绍了基因工程的基本操作程序的四个步骤，教学内容多，难点多，最好化整为零、各个击破。 二、教学目标 1．知识目标： 简述基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）关注基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 三、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 四、学情分析 本节课内容较多，难点较多，学生学习起来有一定困难，所以之前应该要求学生做好预习，尽量采用化整为零、各个击破的教学策略。 五、教学方法 1、学案导学：见学案。 2、新授课教学基本环节：预习检查、总结疑惑→情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→发导学案、布置预习 六、课前准备 1．学生的学习准备：预习《基因工程的基本操作程序》，初步把握基因工程原理及基本操作程序。 2．教师的教学准备：多媒体课件制作，课前预习学案，课内探究学案，课后延伸拓展学案。 七、课时安排：2课时 八、教学过程 （一）预习检查、总结疑惑 检查学生落实预习的情况并了解学生的疑惑，使教学具有针对性。 （二）情境导入、展示目标 教师首先提问： （1）什么是基因工程？（基因工程的概念） （2）DNA重组技术的基本工具有哪些？（限制酶、DNA连接酶、载体） （3）运载体需要具备哪些条件？（有一个或多个限制酶切割位点；有标记基因；能在受体细胞中稳定存在并自我复制或者整合到受体细胞染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制） 上节课我们学习了DNA重组技术的基本工具，本节课我们将继续学习《基因工程》的
基因工程药物研发的差不多过程 基因工程药物的研发分为上游和下游两个时期： 上游时期：要紧是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最要紧的确实是目的基因的表达。选择基因表达系统要紧考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。现在期的工作要紧在实验室内完成。 下游时期：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量操纵。现在期是将实验室的成果产业化、商品化，要紧包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化操纵，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化操纵等。 血管抑制素(angiostatin ,简称AGN) 是纤溶酶原 的一个酶解片段,相当于其1～4 Kringle 区,具有抑 制内皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿 瘤生长和转移的生物功能,是一种新型血管生成抑 制因子[1 , 2 ] ,关于操纵肿瘤、糖尿病视网膜病变、消
化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研 究价值和应用前景. PCR产物的T载体克隆 （一）重组T质粒的构建 一．原理 外源DNA与载体分子的连接确实是DNA重组，如此重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分不经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP
1.基因工程的基本操作程序是：①使目的基因与运载体相结合②将目的基因导入受体细胞③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求④提取目的基因。其中正确的操作顺序是() A．③②④①B．②④①③C．④①②③D．③④①② 2.下列有关PCR技术的说法，不正确的是() 是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术 技术的原理是DNA双链复制 C.用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA 3.在基因工程技术中，需要用氯化钙溶液处理的环节是() A.目的基因的提取 B.基因表达载体的构建 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的表达 4.在受体细胞中能检测出目的基因是由于() A.质粒与目的基因重组后能够复制 B.目的基因上具有标记基因 C.质粒上具有某些标记基因 D.以上都不正确 5.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是() ①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A.①④ B.①③ C.②④ D.②③ 6.下面是一项“利用转基因番茄生产人胰岛素的方法”的专利摘要，请回答：本发明利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素。所用的人胰岛素基因是依据植物“偏爱”的密码子来设计所含的密码子，通过人工合成若干DNA片段，拼接而成，并且在胰岛素—COOH端加上KDEL内质网滞留序列，避免胰岛素在植物细胞中的降解。将该基因置于CaMV35S启动子和果实专一性启动子2A12的驱动之下通过农杆菌介导的方法转入番茄中，在番茄的果实中表达人胰岛素。 （1）本专利是采用________的方法获得目的基因的。获得的人胰岛素基因与人体细胞中胰岛素基因的碱基序列不同，但两者所编码的蛋白质中氨基酸序列，原因是________________ ______。要想在体外获得大量该目的基因的片段，可以采用________技术。 （2）根据上述摘要，转基因操作时所用的载体是________。构建的基因表达载体中不会含有______ __(从下列选项中选择)。 ①目的基因②CaMV35S启动子③果实专一性启动子2A12 ④引物⑤标记基因⑥内含子滞留序列⑦终止密码子⑧终止子 （3）如果要检测在受体细胞中是否存在目的基因可采用________技术。该技术中使用的基因探针也可以用来检测__________________。1.基因工程的基本操作程序是：①使目的基因与运载体相结合②将目的基因导入受体细胞③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求④提取目的基因。其中正确的操作顺序是() A．③②④①B．②④①③C．④①②③D．③④①② 2.下列有关PCR技术的说法，不正确的是() 是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术 技术的原理是DNA双链复制 C.用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA 3.在基因工程技术中，需要用氯化钙溶液处理的环节是() A.目的基因的提取 B.基因表达载体的构建 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的表达 4.在受体细胞中能检测出目的基因是由于() A.质粒与目的基因重组后能够复制 B.目的基因上具有标记基因 C.质粒上具有某些标记基因 D.以上都不正确 5.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是() ①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A.①④ B.①③ C.②④ D.②③ 6.下面是一项“利用转基因番茄生产人胰岛素的方法”的专利摘要，请回答：本发明利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素。所用的人胰岛素基因是依据植物“偏爱”的密码子来设计所含的密码子，通过人工合成若干DNA片段，拼接而成，并且在胰岛素—COOH端加上KDEL内质网滞留序列，避免胰岛素在植物细胞中的降解。将该基因置于CaMV35S启动子和果实专一性启动子2A12的驱动之下通过农杆菌介导的方法转入番茄中，在番茄的果实中表达人胰岛素。 （1）本专利是采用________的方法获得目的基因的。获得的人胰岛素基因与人体细胞中胰岛素基因的碱基序列不同，但两者所编码的蛋白质中氨基酸序列，原因是________________ ______。要想在体外获得大量该目的基因的片段，可以采用________技术。 （2）根据上述摘要，转基因操作时所用的载体是________。构建的基因表达载体中不会含有______ __(从下列选项中选择)。 ①目的基因②CaMV35S启动子③果实专一性启动子2A12 ④引物⑤标记基因⑥内含子滞留序列⑦终止密码子⑧终止子 （3）如果要检测在受体细胞中是否存在目的基因可采用________技术。该技术中使用的基因探针也可以用来检测__________________。
基因工程的基本操作程序 自主学习（理知识，固基础） 基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：、、、。 学点一、目的基因的获取： 1．目的基因：符合人们需要的，编码蛋白质的。也可以是一些具有的因子。 2．获取目的基因的方法 (1)从基因文库中获取目的基因 ①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多，导入受体 菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基 因文库。 ②种类 基因组文库：含有一种生物的基因。 部分基因文库：含有一种生物的基因，如cDNA文库。 ③目的基因的获取依据： 根据基因的有关信息：基因的序列、基因在上的 位置、基因的产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等特性获取目 的基因。 (2)利用PCR技术扩增目的基因。 ①PCR含义：是一项在生物体外特定DNA片段的核酸合成技术。 ②PCR原理：DNA 。 ③条件：有一段已知目的基因的序列，以便根据这一序列合成。 ④过程：目的基因DNA受热形成，与结合，然后在_____ ____的作用下进行延伸形成DNA。 ⑤方式：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成扩增=2n(n为扩增循环的次数)。 (3)人工合成法：如果，已知，可以通过用化学方法人工合成。 学点二、 基因表达载体的构建──基因工程的核心 1．表达载体的组成： + + + 等。 2．启动子：位于基因的，它是和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA，最终获得所需的。 3．终止子：也是一段有特殊结构的，位于基因的，终止。 4．标记基因：鉴别受体细胞是否含有目的基因，从而将筛选出来。常用的标记基因是。 5．表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中，并且给下一代；同时使目的基因能够_ __和作用。 6．不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。 学点三、将目的基因导入受体细胞 (一)转化的概念：目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内和过程。
基因工程制药 姓名：刘惠霞 学号：2011506024 班级：2011级生技1 班
基因工程制药 一．基因工程制药常用的工具酶： 基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。 (一) 限制酶(Restriction enzymes) 限制酶即限制性核酸内切酶的简称，是一类专一性很强的核酸内切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。 限制酶的种类 Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。 Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。 (二) DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA 模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。 1．大肠杆菌 DNA聚合酶Ⅰ 2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断 3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 5. TaqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶 6. 反转录酶 （三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。 1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。 2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。 （四）基因工程中常用的其他酶 1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶） 2. T4噬菌体多核苷酸酶