目录
（一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30
方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表
Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置
Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置
Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果
Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
图片列表
Figure 1．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用 4 Figure 2．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用 4 Figure 3．酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤5 Figure 4．构建和筛选BD Matchmaker酵母单杂交和双杂交文库6 Figure 5．酵母菌株AH109和Y187中的报告基因12 Figure 6．BD Matchmaker酵母单杂交文库的构建和筛选16 Figure 7．BD Matchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选17 Figure 8．用BD SMART技术合成高质量的ds cDNA 21 Figure 9．BD CHROMA SPIN纯化柱和收集管26 Figure 10．通过酵母重整合作用来构建AD融合文库27 Figure 11．为双杂交筛选AD融合文库32 Figure 12．分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略39 Figure 13．通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作用42 Figure 14．用对照用人胎盘Poly A+ RNA合成双链cDNA 51 Figure 15．p53HIS对照载体的图谱53 Figure 16．pGAD-Rec2-53 AD对照载体的图谱53 Figure 17．pGADT7-RecT AD对照载体的图谱54 Figure 18．pGBKT7-53 DNA-BD 对照载体图谱54 Figure 19．pGBKT7-Lam DNA-BD 对照载体图谱55
（一）介绍
BD Matchmaker TM Library Construction & Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BD Matchmaker TM Systems和BD SMART TM cDNA Synthesis的技术，只需要用任何组织的1 μg poly A+ RNA 或total RNA就能构建cDNA文库。通过一般细胞内克隆步骤，你能利用BD Matchmaker Systems所提供的灵敏的转录方法所构建的文库来进行单杂交或双杂交实验。
单杂交实验的原理——蛋白-DNA相互作用实验
单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式DNA激活序列的绑定，该序列可能是处于最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。这个实验也可以用于预测或新蛋白的DNA 绑定结构域的确定。通过BD Matchmaker One-Hybrid System你可以很容易的获得这些基因表达的蛋白
在BD Matchmaker One-Hybrid实验中，潜在的DNA绑定蛋白基因是与克隆在pGADT7-Rec2（为单杂交设计的低拷贝载体）上GAL4激活结构域（AD）序列一起融合表达的。一个或多个目的DNA序列的串联拷贝被构建在pHIS2（含有HIS3营养缺陷报告基因的报告载体）。DNA绑定蛋白和目标序列的相互作用会激活HIS3的转录（Figure 1），该过程要在宿主菌株Y187（组氨酸缺陷型）中进行并在缺少组氨酸的培养基生长
双杂交实验的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理
双杂实验分析能用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、确定疑似作用、明确结构域。在一个BD Matchmaker双杂交实验分析中，诱饵基因是与GAL4 DNA（DNA-BD）绑定结构域序列融合表达的，同时其他的基因或其cDNA与GAL4激活域（AD）序列融合表达（Fields & Song, 1989; Chien et al., 1991）。当诱饵与文库融合蛋白在AH109（ADE2, HIS3, lacZ, MEL1）这样的报告菌株中相互作用，DNA-BD和AD相接近结合，并激活报告基因转录（Figure 2)
DNA-BD 和AD的融合序列是将cDNA序列克隆进酵母表达载体pGBKT7 和pGADT7-Rec载体中来实现的。pGBKT7表达了与GAL4 DNA-BD融合的蛋白，而pGADT7-Rec表达与GAL4 AD相融合的蛋白。在酵母中，两种融合基因在组成型启动子P ADH1下高水平表达的。其他的像pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge基于GAL4的克隆载体与这个试剂盒也相兼容的。pBridge载体能被用于鉴定三蛋白复合体的酵母三杂交实验。
单杂交和双杂交实验分析的生物学基础
单杂交和双杂交方法是基于许多真核转录因子被发现是复合组成的，它们的转录激活和DNA绑第结构域在结构上和功能上是分开的。这使研究者可以构建各种融合基因，当在酵母中表达时，能同时结合到目标DNA序列并激活下游报告基因的转录（Figure1
和Figure2），BD Matchmaker systems 使用的GAL4的转录激活域与DNA绑定域是被完全阐述的的转录因子（Zhu, L. & Hannon, G. J., 2000.）
双杂和单杂文库的建立和筛选
双杂和单杂文库的建立和筛选由四个主要步骤组成，（注：有两个步骤遵从同样的流程）。如果想去筛选双杂交相互作用，第一步是建立一种DNA-BD融合载体。第二步是使用试剂盒所提供BD SMART试剂从你所抽提poly A 和total RNA建立cDNA文库。
就酵母双杂筛选而言，如果你打算我们从预制的BD Matchmaker cDNA文库选取来替代自己准备文库，可以跳过RNA分离、cDNA合成、AD融合文库构建。这些包含非常广泛组织的文库被有效的保存在甘油中或预转化到Y187酵母菌株。我们也提供一种BD Matchmaker文库服务，基于这个服务，提供给我们你想筛选的组织与细胞，我们为你制作AD融合文库。请注意，我们尽管在高拷贝酵母表达载体中建立了很多的预制和预转化的BD Matchmaker cDNA文库，对双杂工作非常理想的，但他们很少适合单杂分析。在单杂分析中我们推荐使用pGADT7-Rec2 and pHIS2等低拷贝载体，因为他们产生较少的假阳性克隆。
其次是cDNA合成，把cDNA克隆到BD Matchmaker AD克隆载体中建立一个GAL4 AD 融合文库，如果是建立双杂文库是pGADT7-Rec载体，单杂则是pGADT7-Rec2载体。克隆在细胞内通过同源重组来进行的，这一步利用酵母替内高效重组系统使ds cDNA和相应的GAL4 AD质粒融合。采用重组介导的克隆，文库的构建和筛选能紧密的完成，而不需要任何的细菌转化和扩增步骤。简单的把cDNA文库和相应的BD Matchmaker载体转化到酵母中，然后把细胞用于成分缺省培养基筛选双杂作用。
Figure 3. 酵母单杂和双杂筛选的一般步骤，更加详细单杂和双杂筛选流程图，请参考Figures 6 and 7.
Figure 4. BD Matchmaker TM 单杂和双杂文库筛选与构建.
如这个图表所示，As this diagram shows,重组介导克隆使文库构建和筛选更快捷高效，尽管这里没有显示，双杂文库能通过酵母融合筛选（细节参照Section XII）.BD SMART TM 的cDNA合成和扩增，请参照Section IX. pGADT7-Rec被用于双杂文库构建和筛选而pGADT7-Rec2被用于单杂文库构建和筛选。被pGADT7-Rec[2]所显示的两个相关载体有不同复制元件。更多的信息请参照Section X 和相关的载体信息包.i
（二）试剂盒内试剂列表
此试剂盒包含有足够试剂能制备5次单杂或5次双杂文库。
去离子水、BD CHROMA SPIN柱,、NaCl溶液、缺省(DO)补充物、NaOAc、LiAc、PEG、TE Buffer,、YPD Plus培养基在室温下保存；.酵母菌株、对照Poly A +和BD SMART III Oligo 保存在–70°C，其他试剂储存在–20°C.下。
cDNA第一条链合成
cDNA扩增
Trial –Size BD Advantage TM PCR 试剂盒
cDNA 纯化
单杂交文库构建
双杂交文库构建
BD Yeastmaker 酵母转化系统
（三）自备材料
下列试剂自备，无其他特别要求所有的试剂与溶液均储存与室温下。cDNA第一条链合成
●无菌0.5ml离心管
●Poly A+ or total RNA
●矿物油
●热循环仪
●DNA marker (1-kb DNA ladder)
● 1.2% Agarose/EtBr gel
cDNA的分离
● 1.5ml无菌离心管
●带有小架子环型支架
●95%乙醇（-20℃）
●1% 氯代二甲苯
诱饵质粒构建
● E. coli感受态细胞。像DH5α or BD Fusion-Blue 感受态细胞
●T4 DNA连接酶
●10X T4 连接buffer
●LB/amp 平板
●50 mM NaCl
●从E. coli转化子中提取质粒的试剂盒
酵母转化（在无菌容器中准备试剂）
●PEG/LiAc溶液
● 1.1X TE/LiAc溶液
●二甲亚砜
酵母的培养与配对
●YPD培养基(参照Yeast Protocols Handbook)
●YPDA培养基（添加30 mg/L adenine hemisulfate，参照Yeast Protocols
Handbook）
●TE buffer或者无菌的蒸馏水
●适合转化的无菌试管和烧瓶
●100-和150-培养平板
●无菌玻璃棒，用于扑板弯曲的吸管
●X-α-Gal（用于酵母双杂MEL1表达的蓝白筛选）
●有agar的Minimal SD Base和没有agar的Minimal SD Base
●3-AT（抑制SD缺省his培养基背景生长）
●Kanamycin 储存液（50 mg/ml ）保存于-20℃
●Ampicillin 储存液（50 mg/ml ）保存于-20℃
文库长期保存
●100%甘油
●YPD冷冻培养基（25%v/v甘油）
酵母双杂文库的构建与筛选
BD Matchmaker Two-Hybrid Library Construction & Screening Kit不提供下列缺省补充物。用户必须自己从其他公司购买或者按照Yeast Protocols Handbook的附录C的配比自己准备。
●Trp DO Supplement
●–His/–Leu/–Trp DO Supplement
●–His/–Trp DO Supplement
●–Ade/–Trp DO Supplement
PCR 克隆筛选
●BD Matchmaker GAL4 AD LD-Insert Screening Amplimer Set
酵母生长和保藏的其它信息，请参考Yeast Protocols Handbook。我们也推荐Guthrie & Fink的Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (1991)和Heslot & Gaillardin的Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts (1992)。
A 基因型
TABLE I. BD MA TCHMAKER TM酵母的基因型
a．GAL1, GAL2和MEL1 的上游激活序列（UASs）应答于GAL4转录激活因子。
trp1,his3, gal4和gal80的突变都被删除；leu2-3, 112是一个双突变。
b. AH109衍生于PJ69-2A菌株，包括ADE2 、HIS3营养标记和一个内源的MEL1
基因(James et al., 1996)。lacZ 报告基因被引入PJ69-2A 而得到AH109菌株。
B.表现型
验证AH109 和Y187表现型是很重要的(Table II)。
1.复苏冻存的菌株，用无菌环或者牙签挑少量的细胞划到YPDA平板上。
2.30°C温育平板3到5天直到克隆出现，从这个工作平板上分离克隆增殖其他的平板。
3.按照Table II测试营养需求
a.用无菌环或者牙签，从工作平板上划3-4个克隆带单个合适的SD选择平板上。
b.30°C温育平板3到6天。酵母在SD选择培养基生长比YPDA培养基上要慢一些。
c.参照Table II比对你的结果，只有AH109 和Y181是期望的表现型才继续进行。
4.进行菌株融合或准备感受态细胞的液体培养，要使用已分离好经过验证工作平板克隆，
用保鲜膜密封好经过表型验证的工作平板，包藏在4°C。
TABLE II .BD MA TCHMAKER酵母菌株的表型
注：
●如果TRP1 和LEU2功能基因被导入，AH109 和Y187能够在SD/–Leu/–Trp
上生长。
●如果AH109携带ADE2 and HIS3基因被激活，AH109 and AH109/Y187 二倍体
能在SD/–Ade/–His生长。(i.e., in the presence of GAL4).
Y187 (MA Tα)能够与AH109, HF7c, CG-1945, Y190或SFY526 (all MATa)相融合。
D. 克隆的颜色和大小
●Y187携带的ade2-101突变和AH109在缺乏GAL4显示Ade-表型。在低含量的ade 培
养基上，克隆在几天后将变成粉红色，并在克隆老化后可能变暗。在补充Ade的培养基上生长时，颜色变化不显著。这些克隆生长到直径>2 mm。由于自发缺失线粒体功能的突变，会形成1–2%小的白色克隆。温育培养时要避免这些白色克隆。
●总体上Y187比AH109生长慢并形成明显较小的克隆。
E.报告基因
AH109包含四个在三个远距离GAL4上游调空序列(UASs)和TA TA boxes调控下的ADE2, HIS3, MEL1和lacZ四个报告基因(Figure 5)。ADE2报告基因针对ADE2 and HIS3，单独提供强的高严紧度的营养选择，减少假阳性率(James et al., 1996)。你也可以选择分析编码α-galactosidase的MEL1。由于α-galactosidase是一种内分泌酶，MEL1对于Y187和AH109两者是内源性的，可以通过添加X-α-Ga到选择平板来检测他的的活性，如果X-α-Gal存在，MEL1被激活，克隆将变成兰色。由于在完整的GAL1 UAS调控下，在阳性的双杂分析中Y187的lacZ表现出高水平的诱导β-galactosidase活性。
Figure 5. 酵母菌株AH109 和Y187中的报告基因。AH109是由PJ69-2A派生而来，包括了ADE2和HIS3两个营养合成基因（James et al., 1996）。MEL1是GAL4的内源效应基因。lacZ 报告基因被引入PJ69-2A而建成AH109。HIS3，ADE2和MEL1/lacZ报告基因都在不完全的GAL4效应序列和启动子元件GAL1，GAL2，MEL1的分别控制下
F. 缺失HIS3的表达
●3-AT是酵母HIS3蛋白的竞争性抑制剂。它被用于在缺省方式下阻止低水平的His3p
的表达，抑制缺省his SD培养基的北京生长。
●由于诱饵蛋白内在的dna结合特性，源于AH109的转化子可能表现出稍高HIS3表
达。通常少量3-AT足以抑制SD/–His上的背景生长。然而，如果你的选择是针对his3和ade2两者共同表达的，在初始文库筛选中没有必要去抑制缺省的HIS3。
●某些酵母菌株有相对较高本底水平的His3p，如果你使用Y190作为宿主菌，在培养
基中需要25–45 mM 3-AT去抑制背景生长。
●在你的选择培养基中优化3-AT的浓度
在你开始这个步骤以前，注意这个试剂盒不提供–His/–Trp缺省补充物，你必须自己单独购买或者按照Yeast Protocols Handbook的目录c的配比自己准备。
1.铺酵母转化子于一系列的不同3-AT浓度的SD/–His/–Trp平板上。
●如果你采用是包含有像pGBKT7这样DNA-BD质粒的AH109转化子，我
们推荐你从0 到15 mM之间开始测试3-AT的浓度（0,2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15
mM）
●如果你是采用包含有pHIS2报告质粒Y187转化子，我推荐你从10 到60
mM之间测试3-AT的浓度。
注：这些仅仅是推荐，优化浓度的高低主要依赖于使用的构件和菌株。
2.使用低浓度的3-AT，一周后，仅允许小的克隆去生长。培养基中太多的3-AT能
新的转化细胞。
（五）.酵母载体
A．单杂交系统
1、克隆载体
●信号载体pHIS2：cis-acting DNA片段插在HIS3营养报告基因的上游多克隆位
点（MCS）上，与HIS3基因（P minHIS3）启动子区相链接。在信号载体上还有一
段高度保守的低拷贝的CEN6/ARS4序列。
●克隆载体pGADT7-Rec2: 表达一个与GAL4 激活结构域(AD)相融合的蛋白，用
于酵母中同源重组介导的克隆（图4）。因此用户可以用Sma1消化的
pGADT7-Rec2（提供的）和ds cDNA（BD SMART文库构建法得到的）（Section
IX）通过酵母转化构建cDNA/AD融合文库。
2、对照载体（附录C）
●阳性对照载体p53HIS2：由DNA片段（包含至少3个连续拷贝的p53 cis-acting
DNA序列）插在pHIS2载体的多克隆位点上构成。插入片段在载体中HIS3基
因（P minHIS3）及其启动子的上游。
●阳性对照载体pGAD-Rec2-53：编码一个融合于GAL4 AD的鼠源p53蛋白。包
含p53HIS2和pGAD-Rec2-53的酵母细胞可以在缺组氨酸的SD培养基（如
SD/–His/–Leu/–Trp）上生长。
a、HA是血凝素，这些免疫标记用于通过体外的免疫共沉淀来鉴定蛋白与蛋白相互
作用，使用的抗体和实验方案由BD Matchmaker Co-IP 试剂盒提供。它们不适用于检测、亲合纯化和酵母内表达蛋白的免疫共沉淀。
b、通过SV40 Large T PCR Fragment和pGADT7-Rec共转化，在体内同源重组产生
的。
c、DNA-BD 和AD载体有不同的营养标记，酵母转化子被涂布在缺少特定成分的基
础培养基他们可以被单独地筛选出来。
B．双杂交系统
2.克隆载体
●pGBKT7：被用于表达一种与GAL4 DNA结合结构(DNA-BD域融合的蛋白。
●pGADT7-Rec：被用于表达一种与GAL4 激活结构域(AD)融合的蛋白。这个载
体被设计成针对同源重组介导的克隆。提供的pGADT7-Rec是被Sma I消化的
线形DNA。
3.对照载体
a.阳性对照
●pGBKT7-53编码一种GAL4 DNA-BD和鼠源的p53融合蛋白。
●SV40 Large T PCR Fragment编码SV40 large T-antigen。一起使用这个
DNA片段和pGADT7-Rec去检测酵母转化重组的效率。SV40 Large T
PCR Fragment和pGADT7-Rec重组形成pGADT7-RecT，它编码GAL4
AD 和large T-antigen的融合蛋白。
●p53和SV40 large T-antigen在酵母双杂分析中相互作用
b.阴性对照
●pGBKT7-Lam编码一种GAL4 DNA-BD和人类lamin C融合基因，提
供一个对照，针对一种不相关的蛋白和pGADT7-RecT 和你的
AD/library的质粒两者之一的意外作用。Lamin C既不形成复合体也不
于大多数蛋白相互作用。
TABLE IV. 双杂系统的载体
a.HA是血凝素，这些免疫标记被用于通过体外的免疫共沉淀来鉴定蛋白与蛋白相互作用，
使用的抗体和实验方案由BD Matchmaker Co-IP Kit 提供。它们无意被用于去检测、亲合纯化或者酵母内表达的蛋白的免疫共沉淀。
b.通过SV40 Large T PCR Fragment和pGADT7-Rec共转化，在体内同源重组产生的。
c.DNA-BD 和AD载体有不同的营养标记，当酵母转化子被扑到缺少特定成分的基础培养
基他们可以被单独的选择。
d.载体可以携带不同的抗生素标记因此可以在E. coli.中单独选择。
VII、构建酵母单杂实验的信号载体
A、背景
如果用BD Matchmaker单杂体系从cDNA库中筛选DNA-结合蛋白，必须先确定一个正确的或预测的靶元件。比如，敲除和点突变分析必须非常精确的运用。所构建的含有一个或多个拷贝的连续靶调控元件，其边界包含限制性酶切位点，重组入pHIS2的多克隆位点（MCS）。这就使得靶元件和HIS3信号基因联系到一起。插入靶元件后可能会影响HIS3表达的强度。因此，在做单杂实验前，要先检测一下构建的载体是否会减弱HIS3的表达。背景克隆的生长是由于HIS3的表达遗漏造成的，这可以通过在选择培养基中添加3-AT来控制，在第IV、F部分有详述。
B、靶元件的合成
每个靶-信号载体的构建都应在报告基因上游插入包含至少DNA靶元件的一个拷贝。早期的许多研究都提出，信号蛋白应包含至少3个连续拷贝的DNA靶元件。然而，Wei et al. (1999)证实了在许多情况下，单拷贝就已经足够了。关于靶元件数量问题可以参见Ghosh et al., 1993。连续的拷贝可通过多种方法制备，我们发现的最便捷、可靠的方法是寡核苷酸合成法。该方法之所以受欢迎是因为对于≤20 bp长度的调控元件该方法都很有效。
1、设计两条反向平行核苷酸链，一条为正义链，另一条为反义互补链。
注：正义链应包含一个或多个拷贝的靶元件和两端不同的酶切位点。当两链退火时，双链DNA会在每个末端有不同的突出来定向连入pHIS2。设计载体时参照pHIS2载体的多克隆位点信息（PT3705-5）。
2、合成不含5’磷酸盐的双链（参照合成方法）。
C、将靶DNA插入pHIS2的多克隆位点
1、正反义链核苷酸各0.1μg在10μl 50mM NaCl中混匀
2、核苷酸置于70℃5min退火，慢慢冷却至室温（~30min）
3、20μl体系完全酶切0.1μg pHIS2。37℃ 2hr或者按生产商的指导。
4、取2μl样品进行1%的琼脂糖凝胶电泳，确定质粒是否完全线性化。
5、将5μl酶切后的质粒、1μl退火后的寡核苷酸和4μl水混匀。
6、加入1.2μl 10×T4连接酶buffer和0.8μl（至少0.8units）T4 DNA连接酶，置于室温4hr。
注：寡核苷酸和载体的摩尔分子量为比100：1或者更大，无需通过胶回收来出除小片段。
7、用标准方法，每个构建的载体各自转化大肠杆菌（Sambrook et al., 1989）。我们推荐用DH5α或者BD Fusion-Blue TM提供的感受态细胞。
8、涂布在LB/Kan平板上，３７℃过夜。
９、用任意标准方法制备纯净的DNA（Sambrook et al., 1989）。通过用２％琼脂糖凝胶电泳和测序来鉴定靶片段插入是否正确。
Ｄ、鉴定靶－信号载体的HIS3背景表达
１、靶－信号载体用小规模方法转化Y187（参见第XI、C部分）
２、按第IV、F部分的方法来决定优化选择性培养基中３-AT的浓度。比如，我们发现１０mM ３-AT 就足够抑制Y１８７细胞转化p53HIS2对照实验的背景生长了。
VIII、为双杂分析建立一个与DNA-BD融合的载体
A. 建立一个DNA-BD融合基因
●如果相同的酶切位点在测试基因和相应的载体都存在，你可以建立一
个GAL4 DNA-BD融合基因。如果不，你可以通过PCR扩增基因片段，
使用的引物带有相应的酶切位点，通过合并期望的突变PCR引物，一
个在基因末端酶切位点可以被改变成不同的位点或者加入到不同的阅
读框。另外，如果你已经把一个基因克隆到BD Creator Donor Vector
中，使用Cre recombinase把你的基因转到pLP-GBKT7中。参考BD
Creator DNA Cloning Kits User Manual。
●更多关于克隆的具体信息，请参照Sambrook et al. (1989)
TABLE V. BD MA TCHMAKER TM DNA-BD载体的比较
a.包含两个检测三蛋白复合体的远距离表达框。
b.在以前BD Matchmaker Two-Hybrid Systems使用的DNA-BD载体。
c.BD Creator Acceptor Vector (LP = loxP). 从任何BD Creator Donor Vector
接受基因，作为GAL4 DNA-BD融合蛋白表达它。
1.纯化基因片段。（我们推荐使用NucleoSpin Extraction Kit (#K3051-1, -2)快速纯化DNA
片段）。
2.用合适的内切酶消化DNA-BD载体，进行磷酸化和醇化处理
3.连接相应的载体和插入片段，转化连接混合物到E. coli。
4.用酶切分析或PCR来鉴定被插入的质粒
B. 检测DNA-BD融合基因的转录激活
1. 使用少量转化方案（Section XII.A.7），使AH109 和Y187转化杂交。扑转化子在下列
平板上：
●SD/–Trp/X-α-Gal
●SD/–His/–Trp/X-α-Gal
●SD/–Ade/–Trp/X-α-Gal
包括一个假阳性对照，例如利用空载的DNA-BD载体转化细胞。
注：BD Matchmaker Library Construction & Screening Kit (#K1615-1)不提供制作这些培养基所要求的却省培养物。你必须自己单独购买或者按照Yeast Protocols Handbook 的目录c的配比自己准备。
2. 结果分析
●诱饵蛋白不被激活，如果转化子克隆是白色的并不能在SD/–His/–Trp 或者
SD/–Ade/–Trp上生长，继续5-6步。
●诱饵蛋白没有激活，如果转化子克隆是兰色的，并能SD/–His/–Trp 或者
SD/–Ade/–Trp生长，用3-4步骤继续。
4.如果诱饵菌株在缺少His的培养基显示背景生长，在你可以通过添加3-AT到选择培
养基（Section IV.F）。也可以使用–Ade/–His/–Leu/–Trp培养基筛选文库。
5.如果一个诱饵菌株在缺少Ade和His的培养基上显示背景生长，很难在双杂筛选中使
用这个诱饵蛋白。请参照故障处理指导。
6.如果就你的诱饵蛋白而言已知蛋白可用，用他去核对用这个特别DNA-BD/bait fusion
双杂相互作用的是否有可检测性。
7.蛋白表达的鉴定
●用转化的菌液做Western印记，用GAL4 DNA-BD的抗体做印记探针。使用没有
转化的酵母菌液做对照。
注：使用多克隆抗体可能导致多重交叉反映带；pGBT9 和pBridge的表达水平太低不允许使用GAL4 DNA-BD单克隆抗体检测。
C. 测试DNA-BD融合蛋白的毒性
●对比转化空载DNA-BD载体和DNA-BD/诱饵质粒的液体培养Y187细胞的生长
率，如果诱饵菌株生长明显减慢，你的DNA-BD/诱饵质粒可能有毒。
●使用少量酵母转化方案去准备转化子。在SD/–Trp上选择转化子，如下方案贮备
过夜培养：
1.用50 ml SD/–Trp/Kan (20 μg/ml)温育一个大的克隆（2-3mm）
2.30°C，250–270 rpm 摇晃，过夜培养(16–24 hr)。
3.检测培养物OD600。它应该≥0.8，如果OD600远小于0.8/，DNA-BD
融合蛋白可能有毒。如果融合基因不阻止酵母的生长，她是无毒的，
你可以计划用酵母融合去筛选你的双杂文库，用步骤4-7继续。如
果你打算用共转化去筛选，你可以停在这里并采用Section IX。
4.离心600 x g，5分钟。
5.弃上清
6.在5 ml SD/–Trp液体培养基重新悬浮，用计数器计算细胞数。细胞
密度应该≥1 x 10 cells/ml.
7.融合这些诱饵菌株和你的AD融合文库的宿主菌(Section XII.A.4)。
注：Y187 (MATα)能与AH109, HF7c, CG-1945, Y190, or SFY526
(MATa)菌株融合。
（九）建立一个cDNA文库
A. 用BD SMART技术建立一个cDNA文库
使用BD SMART技术mrna的转录产物能被有效的复制成ds cDNA，由于它可以保持序列的完整性同时可以高通量产生cDNA，非常适合单杂和双杂文库的构建.通过保持器官组织的复杂性，BD SMART步骤可以提供你检测稀有的和潜在的未知相互作用良好机会，在酵母单杂和双杂筛选过程中。
B. BD SMART cDNA 合成与扩增是如何进行的
在首链cDNA合成步骤中，MMLV反转录酶用于把RNA反转录成DNA.就cDNA合成的引物RNA，你即可以使用被修正的oligo(dT)引物（CDS III Primer）也可以使用随机引物(CDS III/6 Primer).
得到的cDNA文库的复杂性可能不同，主要依赖于你选择哪种引物.如果你使用CDS III引物，它杂交到poly A RNA的3'末端，在接近5'的反转录序有稍低的保真性.如果你使用CDS III/6引物替代，随机引物可以能杂交到RNA摸板序列的不同部位，你的文库应该包括很多不同5'- 和3'-端的序列，他们可能被均等的表达。
MMLV RT遇到摸板的5'末端时候，酶的末端转移活性就回增加一些额外的核酸到cDNA的3'末端，主要是脱氧胞啶。那么具有oligo(G)序列3'末端的BD SMART III寡核苷与脱氧胞啶骨架配对，产生一个延伸摸板。此时RT转换摸板继续复制到核苷酸的末端。在大部分的合成中，生成的ss cDNA包含有完整的可以与BD SMART III Oligo互补mrna 5'末端，它可以后续扩增作为长距离PCR的通用引物，仅这些具有BD SMART 5' 末端锚定序列的ss cDNAs可以做为摸板，被LD PCR呈指数级扩增。
在第二步中，ss cDNA被LD PCR扩增产生ds cDNA库。Library Construction &Screening Kits 包括一个免费试用包装BD Advantage(TM)2 PCR Kit，因而你可以产生和扩增ds cDNA。BD Advantage 2 Polymerase Mix包括有：BD TITANIUM(TM) Taq DNA Polymerase（没有n 末端检测能力的Taq DNA polymerase），适用于hot-start PCR的BD TaqStart(TM) Antibody，少量的具有校正能力的聚合酶。这个酶可以允许你比普通的PCR更高的保真度来扩增cDNA （大约20 kb）
Figure 8．使用BD SMART(TM) 技术高质量ds cDNA的合成
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的 结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而 转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不 能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只 有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建 成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱 饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立 为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂 交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性 原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备， 并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基 的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别
目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
酵母双杂交系统原理 https://www.doczj.com/doc/1b3233304.html, 2005-6-5 16:04:32 来源：丁香园 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大 约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
酵母双杂交系统及其应用 Y east Two-hybrid System and Its Application 1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物学特性 （1）单细胞真核生物 尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。 （2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少； 1996年已完成酵母全基因组测序（ 1.5 x 107 bp），是第一个被测序的真核生物。大约有6000个基因。目前已经建立了一个6000个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。其中5000多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。 （3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖 在指数生长期每90分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。 （4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析 酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。 有两种单倍体细胞类型，分别为a型和α型。在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/α双倍体细胞。在营养匮乏时，a/α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。 一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒 bud，芽, 蓓蕾starvation，饥饿, 饿死 ascus，n.[微生物]子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂 haploid，n.[生物]单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的 diploid，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体 ascospore，n.[植]囊孢子 rupture，v.破裂, 裂开, 断绝(关系等), 割裂。n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂 spore，n.孢子vi.长孢子germinate，v.发芽, 发育, 使生长
酵母双杂交系统的发展和应用 随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY 载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。 基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。
酵母双杂交技术的研究与应用 摘要：酵母双杂交系统是在20世纪90年代初发展起来的利用遗传学方法在酵母真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的一种高度灵敏的分子生物学技术，它可以有效分离新基因或新的能与一种已知蛋白相互作用的蛋白质及其编码基因，被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域，已成为分子生物学研究领域的重要实验手段之一，获得了许多有价值的重要发现。 关键词：酵母双杂交系统；蛋白质组学；功能基因组学Abstract:Yeast two-hybrid system is a highly sensitive molecular biology technique,which uses genetic methods to study protein-protein interaction in eukaryotic yeast cells,developed in the early 1990s.It can effectively separate new genes or new protein which has interaction with a known protein and protein-coding genes, is widely used in the field of proteomics, cellular signal transduction and functional genomics, has become one of the important experimental methods in the molecular biology areas, gained a lot of valuable important discovery. Key words:Yeast two-hybrid system;Proteomics;Functional Genomics.
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
4月4日划线配培养基TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25mlYPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始8号8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5mlEP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O8.8ml
酵母双杂交系统及其应用 Yeast Two-hybrid System and Its Application 1. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生物学特性 （1）单细胞真核生物 尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。 （2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少； 1996 年已完成酵母全基因组测序（1.5 x 10 7 bp ），是第一个被测序的真核生物。大约有6000个基因。目前已经建立了一个6000 个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。其中5000 多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。 （3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖 在指数生长期每90 分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。 （4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析 酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。 有两种单倍体细胞类型，分别为a 型和α型。在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/ α双倍体细胞。在营养匮乏时，a/ α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4 个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒bud，芽, 蓓蕾starvation ，饥饿, 饿死ascus，n.［微生物］子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂 haploid，n.［生物］单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的diploid ，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体ascospore，n.［植］囊孢子rupture，v.破裂, 裂开, 断绝（关系等）, 割裂。n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂 germinate，v.发芽, 发育, 使生长 spore，n.孢子vi. 长孢子
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
噬菌体载体构建基因组文库
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4 LexA DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。cDNA 文库或DNA 与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA
模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。 现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物
酵母双杂交 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立i 。 典型的真核生长转录因子，如GAL4 GCN4等都含有二个不同的结构域：DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。 基本原理 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而 且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白—蛋白的相互作用。主要有二类载体：a 含DNA -binding domain 的载体；b 含DNA-activating domain 的载体。 上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读 框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱 动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequenee)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用bin di ng-doma in 基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli 转录抑制因子)的DNA-bd 编码序列。常用的activating-domain 基因有：GAL4(768-881)和 疱疹病毒VP16的编码序列等。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：〈1〉易于转化、便 于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA-结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd);另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活
酵母双杂交操作手册 by shenao Y2H所需材料: PJ69-4A PJ69-4α or AH109 Y187 pGBKT7 DNA-BD Vector (bait) pGADT7 AD Vector (prey) pGBKT7-53 Control Vector pGBKT7-Lam Control Vector pGADT7-T Control Vector pCL1 Control Vector 3' DNA-BD & AD Sequencing Primers Herring testes carrier DNA Yeast extract，Dextrose(glucose); SD base; DO Supplement; Peptone，with DMF) TE buffer DMSO PEG/LiAc (10X) TE/LiAc buffer (10X) X-a- gal( Yeast Phenotypes –––Ade, His, Leu, Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the –or Trp medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients. Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to +Ade grow. +His Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.
模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白
4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始 8号 8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号 8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC 10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O 8.8ml