1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。
冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。C,从-30。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。
（1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。C43。C的时间，减少冰晶的形成。其方法有二：
①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（大小为1cm××）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。
②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
（2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类：
①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4μm，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难，且切片厚8～15μm，不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。
冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。
2．石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃。C下进行，以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于2cm××，使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。
组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3：
表1-3 组织块处理时间表
1 70%乙醇4℃3～4h
2 80%乙醇4℃3～4h
3 90%乙醇4℃2～3h
4 95%乙醇Ⅰ4℃2～3h
5 95%乙醇Ⅱ4℃1～2h
6 100%乙醇Ⅰ4℃
7 100%乙醇Ⅱ4℃
8 二甲苯Ⅰ4℃～1h
9 二甲苯Ⅱ4℃１～1h
10 石蜡Ⅰ60℃1h
11 石蜡Ⅱ60℃2h
以上全过程为18-24h，也可在室温内使用自动脱水机代替。如组织块小，直径小于，可用快速石蜡包埋切片，全过程只需4h左右。
石蜡切片为常规制片技术，切片机多为轮转式，切片厚度2～7μm，应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。由于甲醛固定、有机熔剂和包埋剂对组抗原有一定的损害及遮蔽，使抗原特征发生改变。有人报告经蛋白酶消化，可以改善光镜免疫组化染色强度，常用的有胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蜡切片应入37℃恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象。切片如需长期贮存，可存放于4℃冰箱内备用。
石蜡切片优点较多，但在制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多，有人采用冷冻干燥包埋法（Freeze drying embedding methed），可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白变性和酶的失活，从而减少了抗原的丢失。该法是将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机（Freezing dryer）在真空、低温条件下排除组织内水分，然后用甲醛蒸气固定干燥的组织，最后将组织浸蜡、包埋、切片。此法可用于免疫荧光标记、免疫酶标记及放射自显影。
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。 冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。C,从-30。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。 （1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。C43。C的时间，减少冰晶的形成。其方法有二： ①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（大小为1cm××）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。 ②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。 （2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。 影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类： ①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4μm，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。 ②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难，且切片厚8～15μm，不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。 冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。 2．石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃。C下进行，以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于2cm××，使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。 组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3： 表1-3 组织块处理时间表 1 70%乙醇4℃3～4h 2 80%乙醇4℃3～4h 3 90%乙醇4℃2～3h 4 95%乙醇Ⅰ4℃2～3h 5 95%乙醇Ⅱ4℃1～2h
石蜡切片 1.仪器 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材 幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡： 将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋： 先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片 对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。
7．粘片 将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡 脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色 将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封 滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照
XX医院病理科2010～2012年术中冰冻与石蜡切片诊断准确性分析 肿瘤手术中冰冻切片快速病理诊断具有十分重要的意义，它不仅是鉴别良、恶性肿瘤准确快速的方法，也是指导临床医生决定手术切除范围及制定下一步治疗方案的关键手段。比较冰冻切片快速病理诊断与石蜡切片病理诊断的符合率，分析可能导致误诊的原因。现 对我科2010年１月～2012年5月间所有冰冻切片诊断工作进行回顾性分析。 一、材料与方法 为防止制成的冰冻切片镜下组织形态发生改变，送检标本要求用干纱布包裹或置于不加任何液体的洁净容器内及时送达病理科，病理医师详细检查大体标本后取肉眼确认病变最明显区域1～2块组织，迅速置全自动恒冷切片机（英国产SHANDN ）上制作切片。切片厚4μm，经酒精固定，HE 染色，普通光镜（Olympus BX41）下观察。 二、结果
三、讨论 冰冻切片与石蜡切片诊断的符合率逐年有所提高，说明我科病理医生对冰冻切片诊断的知识面及经验都有所提高。误诊原因分析
1、科外因素： ⑴.术中标本送检时放入生理盐水或其它液体中，或用湿纱布包裹标本，或术者用水冲洗标本等，做冰冻切片时由于骤冷产生大量冰晶使组织呈空网状，使病理医师误认为是粘液或脂肪组织来源的肿瘤，被迫第二次取材。 ⑵.手术医师取材不当或取材错误，可造成冰冻切片诊断的准确率和预测值之间的差异，如滑膜肉瘤送检组织为纤维结缔组织；胰腺癌时切取正常胰腺组织送检；脑胶质瘤送检脓性坏死渗出物，从客观上导致假阴性。 ⑶.有些病变由于组织结构的特殊性，冰冻切片很难确诊，例如：①乳腺硬化性病变，包括某些类型的腺病（硬化性腺病）及放射状瘢痕。有人认为良性硬化性病变与硬癌的鉴别很困难，在冷冻切片中尤其如此。我们曾遇见过乳腺硬化性腺病的假浸润现象而诊断为乳腺癌的病例。②乳腺乳头状病变，包括导管内乳头状瘤与末梢导管的乳头状瘤病。③乳腺导管上皮增生性病变，包括不典型增生。本组有一例导管上皮增生呈“搭桥”样生长，并形成不规则的间隙，误诊为恶性。这些病变有时在石蜡切片中多处取材都可能难以确诊，不能苛求在一张切片短时间内作出确切诊断，必须等待石蜡切片最后确诊，特别是对年轻患者。 2、科内因素：
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么 1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的 抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。 2、从研究目的来看。石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形 态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。 3、从抗原的保真性来看。冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程 中可能会对抗原的性质造成影响。 4、从操作步骤的繁琐程度看。染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。 5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立 即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 编辑本段冰冻切片的应用
石蜡切片免疫组化染色实验操作流程_ 1．石蜡切片脱蜡至水： （石蜡切片染色前应置60℃1小时）。 ①二甲苯I、II，各30分钟。 ②梯度酒精：100%I、II，各10分钟;95%，5分钟;80%，5分钟;70%5分钟。 ③蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。 2抗原修复： 根据待检测的抗原，选择适当的方法。 附： 抗原修复液（10mMpH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制： ①储备液的配制： A液： 枸橼酸三钠-2H2O 29.41g+蒸馏水1000ml；B液： 枸橼酸21g +蒸馏水1000ml；②工作液的配制： A液82ml+ B液18ml+蒸馏水900ml 抗原修复的方法： 高压锅处理技术： 枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH
6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。晾至室温抗原修复的注意事项： ①组织不能干。②选择抗原修复方法要因抗体而异。③该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。 3．PBS：5分钟，2次（置于摇床） 4．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温20分钟（避光）。 5．PBS水洗：5分钟，2次。 6．正常血清封闭： 从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片 正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。 附： 正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)： 按1:10比例，用PBS配制，每张切片需要量按50μ+5μl (10%抛洒量)计算。 7．滴加第一抗体： 用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体50μ，（也可置于4℃冰箱过夜）。 第二天片子晾至室温 8．PBS：5分钟，2次。 9.滴加聚合物增强剂（试剂A），37℃孵育30分钟， 0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。
3.脱水。乙醇是常用的脱水剂，用乙醇脱水的过程中，以低浓度逐渐过渡到高浓度乙醇（70%、80%、95%、无水乙醇），来除去材料块中的水分。脱水时间跟材料块的大小而定（70% 1.5h，85% 1.5h，95% 2h(可以过夜)，100% 1.5h ，100% 1.5h） 4.透明。透明剂为二甲苯。透明剂的作用是置换乙醇，让材料透明，有利于石蜡向材料内部的渗透。从1/2无水乙醇+1/2二甲苯（1.5h,若脱水不彻底，会出现乳白色浑浊）→二甲苯(1.5h)→二甲苯(1.5h) 5.低温浸蜡。目的是慢慢除去材料中的二甲苯，而代之以石蜡。将已透明的材料和二甲苯（约5ml）一起倒入包埋用的小烧杯中，把事先切碎的石蜡放入小烧杯中，使二甲苯正好浸没石蜡，盖上盖子，放入40℃的恒温箱中14h。 6.高温浸蜡。将小烧杯中的石蜡和二甲苯混合液全部倒干净，注意不要把材料倒掉，马上倒入提前溶解好的熔点为54-56℃的纯石蜡，不要盖盖子，再把恒温箱的温度调到58℃，时间为4h-5h。在两小时时换一次石蜡。 7.包埋。即用纯石蜡将渗透好的材料封埋成蜡块，便于切片。将溶解好的54-56℃的石蜡倒入事先准备好的蜡船中，用镊子将材料放入蜡船中，每隔1.5-2.0cm放一个材料，用镊子将材料扶正，动作要迅速，不能产生气泡。然后放入装有冷水的脸盆中，使蜡迅速凝固。待石蜡完全凝固后，取出蜡船阴干。 8.切片。切片是用石蜡切片机把蜡块连同材料切成薄片。具体步骤： ①蜡块的修正与粘附。将材料用解剖刀修成宝塔形，材料在中央。将宝塔粘附到载物块上，并用石蜡烫牢。 ②安装切片刀和调节切片厚度。装上切片刀，使刀身与材料切面平行（若不平行再将材料重新修平行），并略向内倾斜（约15°）调节切片的厚度为14微米。 ③切片室4手摇切片机摇柄，左手持毛笔接蜡带，摇转速度要均匀，以没分钟40-50片为宜。 9.粘片。肉眼观察或镜检，将看上去完整的切片进行粘片。方法： 取干净的载玻片，滴三滴粘片剂（明胶1g+水100ml+碳酸2g+甘油15ml）与载玻片中央，加一滴蒸馏水，用手涂匀，用镊子将切片平铺在载玻片上，将多余的粘片剂用吸水纸吸干，然后将载玻片放在展片台（35℃）上，约1-1.5h，至蜡片全部展开为止。然后将片子放在干净，通风的地方干燥3-4天。 10.脱蜡染色。步骤： ①脱蜡。即染色前用二甲苯将石蜡溶去。将切片放入染色缸中，加入二甲苯，将染色缸放入45℃的恒温箱中45分钟，每15分钟换一次二甲苯。 ②复水。将切片依次经过1/2二甲苯+1/2无水乙醇→无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→70%乙醇，各级5-10分钟， ③番红-固绿重染。番红用71%乙醇溶解（0.5g+100ml70%乙醇），固绿用95%乙醇溶解（0.1g固绿+100ml95%乙醇）。将切片放入番红染液中3-4h，然后取出切片，依次经过 70%（20s） →85%(20s)→95%(20s)→固绿(20s)→95%(将固绿冲洗干净，3-4s)→无水乙醇(5-10min)→无水乙醇 (5-10min)→1/2二甲苯+1/2无水乙醇(5-10min)→二甲苯(5-10min)→二甲苯(5-10min) 11.封片。光学树胶（光学中性树胶+二甲苯比例为1：1）。将切片从二甲苯中取出后迅速滴一滴光学树胶，盖上盖玻片，（注意不要产生气泡，树胶也不要太多。）放在干净，通风处，自然干燥。 12.贴标签。最后在做好的切片的左边贴上标签，注明材料的名称，日期和制作者。 注意事项1.无水乙醇有硬化组织的作用，所以在无水乙醇中不宜浸得过久。=zD7 2. 透明时，材料在二甲苯中不要放的太久，二甲苯易使材料变硬变脆。 3 所采用的石蜡熔点不宜太高，否则材料块会高度收缩变形，且高温浸蜡时间不要过长。
HE染色 1．取材 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液） 镊子触质粒由硬变韧性为准。 （美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。（20，30，30，60） （美）：流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水，各30min 注意事项： （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 （2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。 （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 （美）：80％的酒精×2小时 95％的酒精×2小时 100％的酒精×2小时×2 100％的酒精×1小时或者更长时间 5．透明（环保透明脱蜡液）中杉金桥 纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明为止）。 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
石蜡切片与冰冻切片 一、组织和细胞标本类型： （一）组织标本类： 1、石蜡切片：组织形态保存好 2、冰冻切片：抗原性保存好 （二）细胞标本类： 1、组织印片 2、细胞培养片（细胞爬片） 3、细胞涂片 二、组织取材 1、脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。 2、组织取材注意事项： （1）标本新鲜：组织要求离体后30min~2h内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。 （2）注意防止人为因素的影响刀和剪要快，避免挤压。 （3）组织块的大小厚为0.1~0.3cm，大小可根据需要而定。 三、活细胞标本的制备法 （1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。 （2）将细胞直接培养在盖玻片上。 （3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。 四、石蜡切片的制备 1、由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而，组织经固定和水洗后含大量水分，需用乙醇类试剂进行脱水，水脱完后，组织内含有大量的乙醇，还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换，最后经浸蜡，组织细胞内被大量石蜡支称，才使组织能用于石蜡切片。 2、小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 75%乙醇30min，85%乙醇30min，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min；二甲苯Ⅰ15min，Ⅱ10min，Ⅲ10min；石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1~2h。 五、冰冻切片的保存和使用 1、冰冻切片固定后-80℃保存备用 2 、冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。
石蜡切片、HE、免疫组化实验 一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈） ①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。） ①脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡①1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡①中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。 ①包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡①倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。包埋过夜。 ①切片：将包埋好的蜡块取出，置于小木块上，用刀修成梯形（包埋时组织所在的底面现在变成正面，主要修这一面，蜡块厚的一面用烧过的刀块烫平，贴在小木块上，贴紧底面后，用刀片烫一下四边，使蜡块完全固定在小木块上，防止切片时掉落）（组织蜡块的梯形上下边一定要平行，梯形不用太大，也不能太
一、制备显微标本的切片法 一石蜡包埋切片制作法 这是最常用的切片法。以石蜡作为组织的填充支持介质，将整块组织加以包埋， 最后凝固成均匀一致的固态结构。用切片机制取极薄的切片。为了让石蜡能浸入组织内部，需将组织经过脱水等处理。过程大致如下： ⑴固定：生物标本脱离机体或培养环境，细胞会发生自溶，腐败分解。因此，需 用固定剂处理，使蛋白质凝固停止濒死或死后变化。凡供永久保存的标本都需经固定处理。 常用的固定剂是甲醛、乙醇等，能使蛋白质凝固。还有由几种试剂配成的固定液，例如Carnoy固定液，由无水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更强，不含水分，可避免水溶性物质如糖原等在固定过程中损失。 ⑵脱水：是将组织细胞所含水分除去。通常用乙醇（AlcohoI ,酒精），浓度递升到100%。此过程还使组织块进一步硬化。 ⑶透明：是用既能溶于纯酒精又能融解石蜡的有机溶剂，将组织中的酒精取代，以便石蜡浸入。通常用二甲苯（xylene ）为透明剂。 ⑷浸蜡：在温箱内进行。已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，让石蜡浸透组织，作为支持介质。 ⑸包埋：将已浸蜡的组织块放入热融的包埋石蜡中，迅速冷凝，组织决便被蜡包埋。 ⑹切片：用切片机。常用的切片机有轮转式、平推式的。用轮转式的易于切出连续切片。切片厚度随制片目的而调整。教学标本厚度多是5~6卩m。 ⑺贴片烤干：石蜡切片在温水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色处理。
染色后用树胶、盖坡片封固，可永久保存。 二冷冻切片法 冷冻切片法是借组织在低温下，冻结变硬而达到符合切片要求。冷冻切片法需有冷冻切片机，或在普通切片上配制冷设施。恒冷切片机是高级冷冻切片设备。它有一个恒冷箱，标本致冷台和切片机都装在箱内。恒冷箱的作用类似冰箱，可在一定范围内调整温度，其结构有利于保持箱内恒定低温，减少箱门打开时环境温度的干扰。切片机的轮转把手装在箱外，便于操纵切片。 冷冻切片法的优点是：在处理得当时，它可以最大限度地保持组织的新鲜状态。 并且，由于不需经脱水、透明、浸蜡等过程中有机溶剂的处理，及湿箱浸蜡热的影响，甚至可不经固定。所以能很好地保存组织细胞的各种成分和酶的活性，因此在酶的组织化学研究中常用此切片法。 二、显示标本结构成分的染色法 一苏木素伊红染色法（HE染色法） 为最常用的染色法。该法应用于各种组织的染色，是组织学技术的基本方法，对任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用，只是对不同包埋的切片法处理略有不同。下面简介石蜡包埋切片的HE染色法。 1、脱蜡：石蜡切片的组织内部充满石蜡，不能使水溶性染液着色，因此在染色 前必须首先用二甲苯将石蜡脱掉，共两次。 2、下行入水：将已脱蜡的标本浸入无水酒精及各级酒精，使组织逐步接近水。 3、蒸馏水略洗。
石蜡切片的制作 一：试验目的 掌握石蜡切片的制作 二：器材和试剂 实验动物、手术刀、手术剪、镊子、托盘、标本缸、石蜡切片机、恒温箱、水浴锅、温度计、烧杯、电磁炉、石蜡、包埋纸盒、毛笔、载玻片、盖玻片、中性树胶、染色架、鸡蛋清、甘油、甲醛、各级浓度的酒精(50%、70%、80%、85% 、90%、95%、100%)、二甲苯、苏木精、伊红、盐酸、蒸馏水、30%三氯化铁液。 三：试剂配制 苏木精染液：甲液：苏木精1g、无水酒精100ml;乙液：30%三氯化铁液4ml、蒸馏水 100ml、盐酸1ml。使用时将甲液、乙液等量混合。 伊红染液：伊红1g、95%酒精100ml、冰醋酸1-2滴。 1%盐酸酒精：盐酸1ml、70%酒精99ml。 福尔马林：甲醛10ml、蒸馏水90ml。 蛋白甘油1:1配制 四：实验步骤 1.取材和固定 处死实验动物，迅速取出所需的组织，清洗干净放入福尔马林中固定，12h后换福尔马林。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 （3）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的标本缸里，同时在容器外上标签。标签上注明固定液、材料来源、日期等。 ⑷如需清洗的材料可用生理盐水轻轻擦洗。 2.清洗 材料固定后，用清水清洗4小时 2.脱水： 50%酒精12h,在依次经70%、85%、95%、100%各级酒精溶液脱水1-2h。 注意事项： (1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分和酒精挥发。 (2)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法
石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片
冰冻切片的免疫组化染色步骤 速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约 10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。 冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。 PBS洗，5分钟×3。 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS洗，5分钟×3。 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。 石蜡切片免疫组化染色步骤 三步法（以SP试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。 4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5. PBS冲洗，2分钟×3次。 6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 7. PBS冲洗，2分钟×3次。 8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 9. PBS冲洗，2分钟×3次。 10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
石蜡切片制作基本技术 实验器材：转动切片机、镊子、解剖刀、解剖针、玻璃缸或小塑料盆、小烧杯（50ml）、酒精灯、打火机、染色缸、吸管、温台、温箱、毛笔、纱布、双面刀片。 试剂：95%的乙醇、无水乙醇、二甲苯、甲醛、石碳酸、甘油、新鲜鸡蛋清、加拿大树胶、番红、铬绿、熔点48~50℃和56~58℃的石蜡。 其它：无水CaCl2 、铁帆、苏木精、重铬酸钾、浓硫酸 石蜡切片制作基本技术：石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、 浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1.取材应根据要求选取材料来源及部位。采下的标本要注意保湿，冲洗干净后截取大小合适的样品迅速投入固定液中。（注意材料切割形状以便于包埋，尤其植物叶片横纵切面） 2.固定卡诺氏固定液（无水乙醇：冰醋酸=3：1）固定24h，70%酒精保存。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。 3.洗涤与脱水从50％开始→70％→85％→95％→无水乙醇（30min）（此步骤需两遍），每次时间为1～2h；如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存。脱水乙醇的用量为材料体积的3~5倍。 无水乙醇中要加入不含结晶水的CaCl2 ；用95%的乙醇配制各级脱水乙醇（原浓度95%,要配浓度y%,则取yml95%乙醇加上95-y=？ml蒸馏水即可）。 4.透明经1/2无水乙醇+1/2二甲苯（氯仿）至纯二甲苯（氯仿）两级透明，每级停留2h。在1/2无水乙醇+1/2二甲苯时加入少量番红干粉。 5.浸蜡在浸入有植物材料的透明剂中投入切成小块的低熔点石蜡，加入石蜡的量溶入透明剂的用石蜡溶液=透明剂体积为原则。用浮石蜡（石蜡放入容器中，水浴熔融，取出石蜡，冷却时不断用玻璃棒搅拌，空气进入，冷却后即为浮石蜡）。加蜡后放有材料的有盖容器放入35℃的温箱中6h或更长时间。之后调高温度至56℃，打开盖子让透明剂蒸发，2h后将石蜡溶液倾去。将植物材料移入高熔点的熔融纯石蜡小烧杯中，2~4h再换一次熔融纯石蜡，2~4h即可进行包埋。 6.包埋、切片和粘片 （1）折包埋纸盒； （2）材料包埋：熔融的石蜡到入纸盒中，用在酒精灯上烧热的镊子或解剖针将材料排好（快速，避免石蜡结晶），然后将包埋纸盒放入冷水中冷却凝固。（3）修蜡：每块拉一个材料，双面刀片切开。 （4）粘蜡快：2*2*2.5~3cm的长方形木块，长轴一端刻出网格；木块具网格一端浸入已溶化的废石蜡中，蜡块修成下宽上窄的台体，用烧热的解剖针一面贴
1、 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 编辑本段冰冻切片的应用 （1）在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。 （2）了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。 （3）对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。 （4）在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。 （5）显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。 （6）某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。 （7）神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal 氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。 （8）对某些物质所进行的免疫荧光的研究。 编辑本段冰冻切片的制作方法
低温恒冷箱冷冻切片制作法 以Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机为例，该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。 冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。 操作方法及步骤 ①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 ②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 ③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 ④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 ⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 ⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。 冰冻切片时的注意事项
石蜡切片免疫组化步骤 1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。 2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min) 4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g 枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml) 5. PBS浸洗2次各5min 6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。肝组织过氧化物酶含量高。需增加浓度或增长时间。蒸馏水洗2minx3次 8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要） 9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。（pv法不需要） 9.滴加一抗4℃过夜 10.PBS浸洗3次各5min 11.滴加二抗室温或37℃孵育30min 12.PBS洗3次各5min 15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗 16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗 17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵； 18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min) 19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干 二、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行： 二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min） 2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。 4、抗原热修复：将切片置于装有抗原修复液的玻璃容器中（耐高温），进入微波炉内，容器内液体温度达到95～100℃后断电，连续三次。 5、PBS冲洗5min×3次。 6、5%BSA封闭液20min，甩去。 7、用0.1mol/L PBS稀释一抗100倍，滴加后4℃过夜。 8、PBS冲洗2min×3次，滴加二抗37℃20min，PBS冲洗2min×3次，滴加SABC 37℃20min，PBS冲洗5min×4次，显色剂显色。 9、自来水冲洗，封片，观察。 注意：如果需要做双标记法，则在操作完步骤8后，重复步骤3～8即可