大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养
南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月
一、试剂
1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636）
2)DMEM（Invitrogen,11995-065）
3)FBS（Invitroge,10099-141）
4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）
5)B27（Invitrogen ,17504-044）
6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）
7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）
8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）
9)DPBS（HyClone，SH30028.01B）
10)dd H2O
11)10％水合氯醛
12)75％酒精
二、器械
1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显
微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x1
2)200 ml小烧杯（盛放胎鼠）
3)200目不锈钢筛
4)细胞计数器（求精）
5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）
6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）
7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）
8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）
9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）
10)注射器：50ml、5ml各 1
11)Pipette and pipette tips
12)冰袋、手套、棉球、棉签
Day 1
1、消毒
1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
2、包被培养板
2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
2.2 取PLL，用DPBS将其稀释至100μg/ml。
2.3 以PLL包被培养板，量以覆盖培养板底面为宜。6孔板：1 ml per well；24孔板：0.5 ml per well；96孔板：0.1 ml per well。过夜。
3、配置培养基、消化酶
3.1 DMEM with 10% FBS
FBS：DMEM=1：10
取FBS 4ml、DMEM 40ml加入50ml离心管中混合。
3.2 Neurobasal-B27-Glutamine Medium
Neurobasal：B27=50:1
Neurobasal：GlutaMAX =100:1
取Neurobasal 50ml、B27 1ml、GlutaMAX 0.5ml，加入50ml离心管中混合。
3.3 0.125％胰酶
取0.25％Trypsin-EDTA 5ml,用HBSS稀释至10ml。
将配置好的培养基、消化酶放入4°C冰箱中，待第二天使用。
4、消毒
操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。
Day 2
1、消毒
打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
2、洗板
用ddH2O洗涤3 x 5 min，放入培养箱中晾干。
3、解剖孕鼠
3.1 将已消过毒的解剖工具和已乘HBSS的小烧杯端入动物房。
3.2 麻醉：取10％水合氯醛5ml,腹腔注射麻醉孕鼠。
3.3 75％酒精消毒切口部位。
3.4 开腹（尽量开口大一些，便于后面操作）
使用1把组织镊、1把组织剪。
3.5 分离胎囊。
换用另一幅直/弯镊、组织剪。
3.6 将分离出的胎囊放入HBSS中。
4、解剖胎鼠（所有操作在冰袋上进行）
4.1 将盛放胎囊的烧杯放进操作台。
4.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
4.3 取3个培养皿，内乘HBSS，放置在冰袋上。
将胎鼠从胎囊中取出，剪去头，将胎头放入一个培养皿中。
4.5 用两支显微镊撕开脑膜，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中（将所有的胎鼠都同样处理）。
4.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜，将分离好的脑组织放入另一新的内乘HBSS的培养皿中。
4.7 将分离好的脑膜用虹膜剪剪碎脑组织，约1mm3。
5、接种细胞
5.1 用移液管将剪碎的脑组织移入两个15 ml离心管中。
5.2 每支离心管加入3 ml 0.125％胰酶，摇匀，37℃消化15分钟（为增加接触面积消化更充分可将离心管平放，也可以用60 mm培养皿消化。）
5.3 消化期间整理操作台。
5.4 消化15分钟后，用移液管移去胰酶，每支离心管加入2 ml 10％ FBS/DMEM终止消化。
5.5 吹打：用1 ml枪头，吹打40次，静止2分钟，将上面液体移入一新的15ml离心管中。下面沉淀的细胞团块不要丢弃，加入1-1.5ml10％ FBS/DMEM吹打20次，重复上面的步骤。一共这样分次吹打3次。3次之后如果还有团块在下面，果断丢弃。（吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。）
5.6 过筛网至60 mm培养皿中。
5.7 将培养皿中液体移入2支15 ml离心管中。
5.8 离心：800转5分钟。
5.9 弃上清，沉淀的细胞加10％FBS/DMEM 3ml重悬，轻柔吹打100次（具体吹打次数据细胞计数时看到的情况而定，若看到大量细胞团，应加大吹打次数）。
5.10 用细胞计数板计数：细胞浓度 = (4个大格细胞总数/4) × 104 /ml
5.11 调浓度，接种。接种后摇晃培养板摇匀细胞（注意不要圈圈摇晃，圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀。要左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度）。
具体细胞接种数值：
培养液体积（ml/well）细胞密度（个/ml）总细胞数（个/ well）
6孔板 1.5ml 1x1061x106
96孔板0.1ml 1x1061x105
5.12 两小时后全量换液，换用NB27（应提前放入37℃细胞培养箱中预热半小时）。换液前轻轻晃动培养板（细胞碎片贴壁很慢而且不牢固，这时候的摇晃可以最大程度去掉细胞碎片。）
6、消毒
实验结束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。
7、换液
细胞培养成功后每天观察细胞生长状态，每 3天1/3量或半量换液。注意：换液前要将NB27放入37℃细胞培养箱中预热半小时。
大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,无菌取出胰腺,置于4℃Ｈａｎｋｓ液中,用眼科小剪刀将胰腺剪成1ｍｍ3大小的组织块,加入0.5ｇ·Ｌ-1胶原酶,37℃恒温水浴振荡消化15ｍｉｎ,将已消化至细颗粒状组织吸出,并用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化,余下未消化完全的组织加入少量37℃Ｈａｎｋｓ液,用粗口径吸管轻轻吹打,直至大部分组织被消化成细颗粒状,用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化。混合前后两部分的消化产物,用Ｈａｎｋｓ液低速离心洗涤3次后,将组织置于含100Ｕ·ｍｌ-1青霉素,100ｍｇ·Ｌ-1链霉素,11.1ｍｍｏｌ·Ｌ-1葡萄糖,10ｍｍｏｌ·Ｌ-1Ｈｅｐｅｓ和7%的胎牛血清的完全ＲＰＭＩ1640培养液中,用150目(108μｍ)尼龙筛网过滤,以除去未被消化的组织和结缔组织。将已分离好的胰岛细胞和细胞团,置于含上述培养液内的培养瓶内培养。24ｈ后,吸出未贴壁的细胞悬液,低速离心以收集细胞,显微镜下计数后,以每孔一定数量胰岛细胞团接种于24孔细胞培养板内,继续培养48ｈ后用于实验。 我分离胰岛细胞后,用DTZ染色,发现溶液中含有许多小颗粒,放入温箱中也未发生变化,镜下观察没有看到文献中所说的红染细胞。我是将100mg双硫腙粉末溶于10mlDMSO中，用滤纸过滤，用时用KRBB缓冲液稀释100倍。胰岛细胞分离是将成年大鼠胰腺用胶原Ⅴ酶消化后，过150目网取滤过液，再过400目网取网上细胞，加入L-DMEM培养。方法是我根据文献稍作改动后实施的。胰岛细胞分离和染色对于我都是第一次做，请高手指点一下。 溶液中如果有紫黑色小颗粒，那就是DTZ，过滤除的不净。没有红染的细胞就是没有胰岛啊。还有，我总觉得150目太密了，很多胰岛都滤不过去吧 大鼠胰岛细胞原代培养 一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks 悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL 的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞， 胰岛细胞移植的研究进展 人类至今已有100多年用移植方法治疗糖尿病的历史，胰岛细胞移植治疗糖尿病存在两个障碍：组织来源不足和免疫排斥反应。 一．胰岛细胞的来源
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养 南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月 一、试剂 1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636） 2)DMEM（Invitrogen,11995-065） 3)FBS（Invitroge,10099-141） 4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049） 5)B27（Invitrogen ,17504-044） 6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061） 7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112） 8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056） 9)DPBS（HyClone，SH30028.01B） 10)dd H2O 11)10％水合氯醛 12)75％酒精 二、器械 1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显 微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x1 2)200 ml小烧杯（盛放胎鼠） 3)200目不锈钢筛 4)细胞计数器（求精） 5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）
6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599） 7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010） 8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1） 9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB） 10)注射器：50ml、5ml各 1 11)Pipette and pipette tips 12)冰袋、手套、棉球、棉签
小鼠脑动脉血管平滑肌细胞 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠脑动脉血管平滑肌细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠脑动脉血管平滑肌细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
神经元细胞培养 1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。 2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。 3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。 4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3 次。 5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。 6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。 7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。 (1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27 的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。（+0.5mmol/L谷氨酰胺） 鉴定 1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常 明显。 2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前 鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！ 3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。这就更能支持2的阳性表达 了。 4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！ 从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！ 错误之处还请赐教！ TUJ1
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代 、试剂 Poly-L-lysine (Sigma,P2636) DMEM (Invitrogen,11995-065) 二、器械 手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪 x1 3ml 移液管( Biologix, 30-0138A1) 南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01 1) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141) 4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112) 5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056) 6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B ) 7) dd H 2O 8) 75％酒精 1) 2) 100 ml 小烧杯 3) 200 目不锈钢筛 4) 细胞计数器（求精） 5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790) 6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641) 7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛） 8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010) 9)
10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B 11) 注射器：50ml、5ml 各1 12) Pipette and pipette tips 13) 冰袋、手套、口罩
图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone
图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect
图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect
1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process
大鼠二型糖尿病造模方法 Prepared on 22 November 2020
大鼠2型糖尿病模型建立方法讨论 专业：药理班级：六班姓名：刘畅学号：150517 摘要：据国际糖尿病联合会（InternationalDiabetesFederation，IDF）估计，现在全球约%的成年人患有糖尿病。到2035年，该病患者人数预计会上升至亿。在2013年，全球约有亿成年人患有糖尿病，中国的糖尿病患者人数居全球之首，调查统计人数为亿。糖尿病导致约510万人死亡，平均大约每6秒钟就有1人死于糖尿病。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为2。6%，60岁以上老年人患病率高达%。因此，为治疗糖尿病建立简单、稳定、经济的动物模型非常重要。因2型糖尿病患者人数占糖尿病患病人数的90%以上，本文主要综合讨论高糖高脂饲料联合链脲佐菌素大鼠2型糖尿病模型的建立方法和注意事项。得出结果为：使用体重在190g~240g之间的雄性SD大鼠，通过连续两次腹腔注射小剂量链脲佐菌素并辅以去抗氧化剂处理，合理饲养并通过尾静脉采血方法建立的2型糖尿病模型较理想。 关键词：2型糖尿病，SD大鼠模型，链脲佐菌素STZ， 糖尿病（diabetes）是一种以胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用不足所致的以高血糖为特征的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合征，基本治疗方案包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育。病因主要有遗传因素、病毒感染、肥胖等，临床表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食和体重减轻。长期的高血糖最终会引起很多严重的并发症，包括心脑血管疾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病、糖尿病足、感染、糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等[1]。 糖尿病分为1型糖尿病（Type1diabetes）和2型糖尿病 （Type2diabetes）两种，1型患者因自身免疫β细胞破坏所致，每日胰岛素分泌量非常少，空腹基值及糖刺激后峰值均明显低于正常值，表现为绝对分泌不足。2型糖尿病细分为两类：体重正常患者胰岛素分泌量低于正常人，糖刺激后峰值低并且延迟出现；肥胖糖尿病人胰岛素分泌量大于正常人，空腹基值和糖刺激后高峰明显高于正常人，但延迟出现，因此，表现为相对性胰岛素分泌不足且释放反应迟钝。胰岛素分泌不足的原因可能为：遗传因素、自身免疫、胰岛素拮抗。糖尿病患者中约有90%～95%属于2型糖尿病。 2型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病（non-insulin-dependentdiabetesmellitus，NIDDM），根据体重可分为肥胖和不出现肥胖两
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良 [ 08-10-30 13:48:00 ] 作者：吴建芳编辑：studa20 【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法改良酶消化法。结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98% 以上，足以满足各种细胞试验需求。结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士 【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养 Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity. Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult 在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。 1 材料与试剂 1．1 组织来源：C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。 1．2 试剂：鼠抗SMC-α -actin ,Cy2 conjugated affinity purified anti-mouse IgG［H/L］，戊巴比妥钠注射液。 1．3 培养基：在DMEM 培养基中添加１５％胎牛血清、１％青霉素、链霉素、１％谷氨酰胺，过滤除菌备用（不要超过四4周）。 1．4 酶消化液：Collagenase TypeⅡ 7 mg 溶于5 ml DMEM 培养基中(无血清)，过滤除菌即用。
神经元原代培养 一、准备 1. 试剂 1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。 2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红：0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。 3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200μl或400μl/tube分装, -20度储存。母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。 4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50μl/tube，-20℃保存。使用时需将终浓度调整为25μM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。 例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。 5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。 6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。 AraC工作液：10μM（半量换液，终浓度5μM）； 7）DNAse I（）（购自ROCHE，，100mg，1mg=2000U，用dH2O配成10mg/ml 母液，过滤分装100μl/tube，每次使用50-100μl） 8）培养基 FBS DMEM/F12：购自Hyclone，SH30023.01B，500ml
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法： 问题1培养液pH值变化太快 可能原因 (1)CO2张力不对 (2)培养瓶盖拧得太紧 (3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足 (4)培养液中盐浓度不正确 (5)细菌、酵母或真菌污染 建议解决方法 (1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。 (2)松开瓶盖1/4圈。 (3)改用不依赖CO2培养液。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。 (4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。 (5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变 可能原因 (1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来 (2)冰冻保存培养液 建议解决方法 (1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。 (2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。 问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化 可能原因 细菌或真菌污染 建议解决方法
丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题4：培养细胞不贴壁 可能原因 (1)胰蛋白酶消化过度 (2)支原体污染 (3)培养瓶瓶底不干净 (4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解) (5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不 细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性) (7)接种细胞起始浓度太低或太高 建议解决方法 (1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。 (2)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。 (3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶 (4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可) (5)重新配置消化液或培养液 启用新的保种细胞 (7)调节最佳接种细胞浓度 问题5：悬浮细胞成簇 可能原因 (1)培养液中含钙、镁离子 (2)支原体污染 (3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释 (4)DNA污染 建议解决方法 (1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。 (2)分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。
大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良 中国医科大学附属第一医院内分泌科(沈阳110001) 吴志香* 王玉霞△ 刘国良 摘 要 目的:探讨一种简单易行的大鼠胰岛细胞培养方法,获取尽可能多的高质量胰岛,并寻找进行体外实验研究的最佳时间和条件。方法:运用胶原酶 原位灌注法分离胰腺, F ico ll400纯化胰岛细胞,双硫腙(D T Z)染色鉴定胰岛,运用倒置显微镜观察细胞生活状态, 放免法检测胰岛素分泌考察胰岛功能。结果:每只大鼠可分离438±27个胰岛 胰腺,细胞存活率为92.3±2.3%,GS IS实验中胰岛素释放指数S I为3.25±0.26。结论:本分离纯化方法可获得数量多,质量高的胰岛细胞,为原代胰岛细胞的体外研究提供实验条件。 主题词 细胞培养 胰岛 生理学 胰岛 分离和提纯 大鼠 An i m provem en t m ethod of pr i m ary culture of w istar ra t pancrea tic islets D ep artm en t of Endocrino logy,the F irst A ffiliated Ho sp ital,Ch ina M edical U n iversity (Shenyang 110001)W u Zh ix iang W ang Yux ia L iu Guo liang ABSTRACT O b jective:To study the effects of iso lating and cu ltu ring the rat pancreatic islets in vitro.M ethods:A fter in traductal infu si on of8210m l co ld H ank’s balanced so lu ti on con tain ing1m g m l of type co llagenase,pancreas w ere su rgically p rocu red and digested at37℃fo r15220m in,and stopped digesti on by co ld H ank’s so lu ti on w hen the em u lsi on appeared.T he islets w ere pu rified by discon tinou s F ico ll den sity gradien t(25%,23%,20.5%and11%)cen trifugati on,and the degree of pu rity w as defined as dith izone stain ing.A n i m ati on of islets w as ob served and in su lin secreti on w as detected. R esu lts:438±27islets w ere p rocu red from one rat,and su rvival rate w as92.3±2.3%,Gluco se sti m u lated in su lin secreti on in vitro show ed the m ean value of in su lin in the low2gluco se m edium w as39.74±2.73mM ,w h ile that of h igh2gluco se m edium w as128.94±8.72mM,the S I w as3.25±0.26.Conclu si on:T h is m ethod cou ld ob tain large quan tities and h igh quality islets,w h ich offered better experi m en tal conditi on s fo r cell study. KEY WORD S Cell cu ltu re Istets of langerham s physi o logy Istets of langerham s iso lati on pu rificati on R ats 近年来许多有关糖尿病方面的研究均利用体外培养的胰岛细胞株作为研究对象,然而源自肿瘤细胞系的细胞株毕竟在基因表达功能上与正常细胞有差别,因此,本研究采用了培养的大鼠原代胰岛细胞作为研究对象,以期更接近在体研究的结果,同时又可避免在体研究很难避免的混杂因素。 材料与方法 1 实验材料 实验动物选择两月龄的健康W istar大鼠,体重250±23g,购自中国医科大学实验动物中心。主要试剂有 型胶原酶(co llagenase typ e ,Sigm a);R PM I1640及 *辽宁中医药大学附属第一医院 △中国医科大学附属第四医院DM E M培养基(G I BCO)、胎牛血清(FB S, H yclone)、青霉素、链霉素(华北制药厂)、F ico ll 400(Pharm acia)、H ank’s液,40目不锈钢网, H EPES(Sigm a)、D T Z(Sigm a)、(OA,北京华美)。胰岛素放免药盒(北京原子高科技核技术应用股份有限公司灵敏度:1.5m I U L;精密度:批内Cvv5%,批间Cvb10%) 2 实验方法 2.1胰岛细胞的分离纯化:胰腺的原位灌注:W istar大鼠禁食16h后,10%水合氯醛腹腔麻醉,常规消毒后经腹中线开腹。暴露胆管,寻找胆管穿过胰腺进入十二指肠处,320丝线穿过(暂不结扎),充分暴露胰尾,在肝门胆管分叉处逆行胆管插管,少量推入含冷却的胶原酶(1m g m l)
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能 上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一、鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1、材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2、结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
罗梅：糖尿病大鼠胰岛α细胞胰岛素受体分布及含量的研究 背景动物实验和临床研究均发现代谢综合征包括糖耐量异常以及 2型糖尿病时胰岛素升高，但是对胰高血糖素的抑制效应减弱或消失。同时，有证据表明胰高血糖素分泌和胰岛素敏感性呈负相关，对胰岛素越不敏感的个体其胰高血糖素水平越高，这提示除了骨骼肌、脂肪和肝脏等胰岛素经典靶组织的外周胰岛素抵抗以外，还可能存在胰岛α细胞对胰岛素的抵抗。我们最近的研究发现S TZ糖尿病大鼠胰岛α细胞分泌的N P Y含量增加，予以胰岛素治疗不能令其下降，也提示胰岛α细胞对胰岛素的抵抗。迄今对胰岛素的外周抵抗已有大量研究，但对胰岛α细胞的胰岛素抵抗国内外未见报道。 目的明确糖尿病时是否存在α细胞对胰岛素的抵抗并探讨α细胞的胰岛素抵抗是否与α细胞上胰岛素受体的改变有关。 方法本研究采用免疫组织化学的双重荧光标记法对正常Wis tar大鼠和大剂量STZ诱导的1型糖尿病大鼠以及高脂饮食加小剂量STZ诱导的肥胖2型糖尿病大鼠胰岛的胰高血糖素、N P Y和胰岛素蛋白质含量进行了测定，同时对α细胞上胰岛素受体的分布和含量进行了初步观察。
结果1.2型糖尿病大鼠胰岛内胰高血糖素、N P Y及胰岛素蛋白含量均显著高于对照组，提示胰岛α细胞存在胰岛素抵抗；1型糖尿病大鼠胰岛内胰高血糖素和 NP Y蛋白含量也显著升高，但胰岛素蛋白含量明显低于正常。2.在正常Wistar大鼠和1型糖尿病大鼠、2型糖尿病大鼠胰岛α细胞均有胰岛素受体蛋白表达。 3.大剂量STZ诱发的1型糖尿病大鼠胰岛α细胞上胰岛素受体的含量比正常Wister大鼠明显减少（下图），受体减少的原因尚不清楚，有待进一步研究。4 .与正常Wister大鼠比较，高脂饮食和小剂量 STZ诱发的2型糖尿病大鼠胰岛α细胞上胰岛素受体的含量也有下降趋势，但无统计学意义，分布无明显变化。 解释1.本研究结果显示 2型糖尿病大鼠胰岛内胰岛素蛋白表达增高的同时，伴有胰高血糖素及 N P Y蛋白和N P Y m R N A表达增高，即高胰岛素不能抑制α细胞胰高血糖素及N P Y的表达，提示胰岛α细胞对胰岛素的抵抗。 2.2型糖尿病大鼠α细胞上胰岛素受体呈减少趋势。 3.α细胞胰岛素抵抗似与α细胞胰岛素受体数目变化无明显关系，是否与胰岛素受体结合能力降低、酪氨酸激酶活性降低或受体后其它环节抵抗有关值得进一步研究。 正常大鼠胰岛α细胞胰岛素受体×400 1型糖尿病大鼠胰岛α细胞胰岛素受体×400
小鼠肺血管平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肺血管平滑肌细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肺血管平滑肌细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠肺血管平滑肌细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肺血管平滑肌细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
大鼠和小鼠解剖图谱
图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone
图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect
图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect
1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process