土壤酶的研究进展
摘要：土壤酶作为土壤组分中最活跃的有机成分之一不仅可以表征土壤物质能量代谢旺盛程度，而且可以作为评价土壤肥力高低、生态环境质量优劣的一个重要生物指标，并且，在土壤生态系统的物质循环和能量流动方面扮演重要的角色。本文通过分析、总结国内外土壤酶研究进展，研究土壤酶的来源、作用及其影响因素，展望土壤酶学的发展前景，将有助于该学科研究的纵深发展与广泛利用。
关键字：土壤酶作用影响因素进展
前言
土壤酶( soil enzyme)是指土壤中的聚积酶, 包括游离酶、胞内酶和胞外酶, 其活性变化规律及与生态因子的相互作用关系研究引起众多学者的重视, 它是评价土壤质量的重要手段之一[1], 同时也是评价土壤自净能力的一个重要指标[2]。对土壤酶的研究，让我们能更好地去了解土壤酶是土壤有机体的代谢动力, 在生态系统中起着重要的作用, 以及与土壤理化性质、土壤类型、施肥、耕作以及其它农业措施的密切关系。而土壤酶活性在土壤中的表现, 在一定程度上反映了土壤所处的状况, 且对环境等外界因素引起的变化较敏感, 成为土壤生态系统变化的预警和敏感指标。
关于土壤酶的研究历史可以追溯到19世纪末，自Woods( 1898) 首次从土壤中检测出过氧化氢酶活性以来, 土壤酶研究经历了一个较长的奠定和发展时期( 关松荫, 1986) 。一般认为, 20 世纪50 年代以前为土壤酶学的奠定时期, 许多土壤学者从各种土壤中共检测出了40 余种土壤酶的活性,并发展了土壤酶活性的研究方法和理论, 土壤酶研究逐渐发展成一门介于土壤生物学和生物化学之间的一门新兴边缘交叉学科( Burns, 1978)[3]。20 世纪50～ 80 年代中期为土壤酶学迅速发展的时期。由于生物化学和土壤生物学所取得的巨大成就, 土壤酶的检测技术和方法不断改进, 一些新的土壤酶活性逐渐被检测出来。到20 世纪80 年代中期, 大约有60 种土壤酶活性被检测出来, 土壤酶学的理论和体系逐渐完善。土壤酶活性与土壤理化性质的相互关系、土壤酶的来源和性质以及土壤酶检测手段的改进等成为这段时期的研究重点[4, 5]。土壤酶活性的研究作为土壤肥力指标而受到土壤学家的普遍重视( 周礼恺, 1987) 。20 世纪80 年代中期以后为土壤酶学与林学、生态学、农学和环境科学等学科相互渗透的时期, 土壤酶学的研究已经超越了经典土壤学的研究范畴, 在几乎所有的陆地生态系统研究中, 土壤酶活性的检测似乎成了必不可少的测定指标[7, 8]。由于土壤酶活性与土壤生物、土壤理化性质和环境条件密切相关( Dick, 1996) , 因而土壤酶活性
对环境扰动的响应、根际土壤酶功能的重要性、土壤酶研究技术以及土壤酶作为土壤质量。
一、土壤酶的来源
土壤酶主要来源于土壤微生物和植物根系的分泌物及动植物残体分解释放的酶, 包括氧化还原酶类、水解酶类、裂合酶类和转移酶类. 土壤酶是土壤新陈代谢的重要因素[ 5 ～7 ]。酶活性包括已积累于土壤中的酶活性, 也包括正在增殖的微生物向土壤中释放的酶活性, 它主要来自微生物以及其它有机组织(植物活体及其残体、动物活体及其遗骸)[ 8 ]。植物根系分泌释放土壤酶。来自植物根的酶, 可以是植物自然释放出来的, 也可以是根细胞溶解释放的细胞内酶进入土壤溶液。当根系表皮细胞脱落时, 便携带酶类进入周围的土壤介质中。植物死亡后, 整个植物根系留在土壤中, 继续向土壤释放酶类。因此, 植物根系生理活动, 使得根际范围内的土壤酶活性明显高于根际范围外酶活性。微生物释放分泌土壤酶。土壤微生物数量大、繁殖快, 能向土壤中提供可观的酶。微生物释放酶的大体过程是: 细胞死亡, 胞壁崩溃, 胞膜破裂, 原生质成分进入土壤, 酶类必然释放进入土壤。细胞未死亡, 而胞膜渗透性改变时, 酶也从细胞中释放出来。微生物种群不同, 释放的酶种类也不一样。植物根际酶活性的优势问题, 除了根系本身的作用外,与根际微生物是分不开的[ 7]。植物根系是微生的特殊生境, 根际内微生物的数量总比根际外高, 当微生物受到环境因素刺激时, 便不断向周围介质分泌酶, 致使根际内外酶活性存在很大差异。
土壤动物区系释放土壤酶。土壤是为数极多的动物居住的环境, 土壤动物区系提供的土壤酶数较少。首先是蚯蚓, 它可以分泌转化酶、磷酸酶等;其次是蚂蚁, 提供酶的数量和种类均居第二位。此外, 其它土壤动物, 如节肢动物, 软体动物等对土壤酶也有一定的贡献[ 7]。动物、植物残体释放酶。半分解和分解的根茬、茎秆、落叶、腐朽的树枝、藻类和死亡的土壤动物都不断向土壤释放各种酶类。翻压的绿肥和还田的各类作物秸秆是土壤酶的良好基质, 它们在腐解过程中也向土壤释放大量酶类。
二、土壤酶的作用及影响因素
2.1 土壤酶的作用
土壤酶是土壤生物化学过程的积极参与者, 在森林生态系统中的物质循环和能量流动
过程中扮演着重要的角色( 周礼恺, 1989; Burns et al, 2001; Kissetal, 1998)。尽管森林生态学和土壤学中有关森林土壤酶研究的报道较多( Facellietal, 1974; Setletal, 1991: Wood, 1991; Dilly et al. , 1996)[8]。但迄今为止, 尚无有关旅游风景区土壤酶研究进
展的文献综述。而土壤酶的作用主要体现在土壤质量的生物活性指标与土壤肥力的评价指标
2个方面。
2.1.1 生物活性指标
土壤微生物及其生物活性常常被作为自然和农业生态系统中土壤胁迫过程或生态恢复过程的早期敏感性指标, 尤其是80 年代末以来, 土壤酶作为土壤质量的生物活性指标一直是土壤酶学的研究重点[9]。土壤酶活性作为农业土壤质量的生物活性指标已被大量研究。有研究表明，农田的耕作方式会影响酶活性的高低，如土壤蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性在单作方式下低于轮作方式。另外，不同土地利用类型的酶活性也会有不同的表现，如森林土壤磷酸单脂酶和葡萄糖甘酶活性高于农田。土壤改良过程中应注意对各类凋落物的保护，凋落物在腐解过程中会向土壤中释放酶，从而增强土壤酶活性，这对于促进营养物质的循环代谢和提高有效养分具有重要意义。
2.1.2 土壤肥力的评价指标
某些土壤酶活性可以作为土壤生化过程强度的较好指标，为了全面综合的评价土壤肥力，我们不仅要研究土壤肥力状况、理化性质、生物性质及其影响影子，同时要注意研究土壤的生化反应。土壤酶直接影响着土壤有机质的分解转化和合成过程，因此，可以用土壤酶活性的总体评价土壤肥力水平和供肥能力。。有关研究表明，土壤过氧化氢酶、蔗糖酶活性可以用来评价土壤肥力的状况，土壤酶活性可以作为衡量土壤生物学活性及其生产力的指标。土壤酶活性与土壤肥力有很大的关系。过氧化氢酶作为土壤中的氧化还原酶类，其活性可以表征土壤腐殖质化强度大小和有机质转化速度。过氧化物酶在有机质氧化和腐殖质形成过程中起着重要作用。
2.2 土壤酶的影响因素
影响土壤酶活性的因素很多，诸如土壤理化性质、土壤生物区系、农业植被以及一些人为因素。但影响土壤酶的因素主要有土壤的物理性质、土壤微生物、土壤养分、植物和人为因素。
2.2.1 土壤的物理性质
土壤的物理性质是影响土壤酶活性的重要因素之一, 研究表明土壤粘粒含量, 土壤孔隙对酶活性有影响。Kiss指出, 粘土矿物对酶的吸附, 对酶在土壤中的积累、免遭变性和分解起着重要的作用[10]。Kindler等的研究表明, 土壤木聚糖酶和转化酶活性与土壤粒径密切相关。Dick等研究认为土壤压实对土壤生物及生物学参数影响是因为气体、水的扩散率改变, 水的渗透及土壤孔性等对养分循环有重要影响[11]。同时土壤结构决定土壤中的水、热、气的变化，进而影响土壤中酶的活性变化。
2.2.2 土壤微生物
土壤酶的研究与土壤微生物研究密切相关。近年来，关于土壤微生物与土壤酶活性关系的研究报道也很多。许多研究表明，放线菌、真菌和细菌等是土壤酶的主要来源。根际土壤的阿维属细菌能够分泌释放漆酶。真菌木霉属和腐霉属可以增强砂壤土纤维素酶、脲酶、和磷酸酶活性，这些酶与C、N、P等养分的循环有密切的关系。放线菌能够向土壤中释放氧化酶和醋酶，它们对腐殖质和木质素具有降解作用[12]。土壤微生物与土壤酶的来源和活性的关系研究对于土壤酶学的研究和发展具有重要意义，利用先进研究技术研究微生物与酶活性的相关性，揭示土壤酶来源、性质和功能，是土壤酶未来研究的热点。
2.2.3 土壤养分
土壤化学性质主要通过以下3个方面影响土壤酶活性: 1)土壤养分和能源状况直接影响生成酶的土壤微生物和植物根系的活动； 2)土壤有机质的含量、组成和有机-矿质复合体的组成、特性决定着酶的稳定性;；3)某些化学物质对土壤酶有激活或抑制作用。
2.2.4 植物
植物对土壤酶活性的影响主要是通过根系分泌物和根系分泌物作用于根际微生物区系而引起的，而植物根系活动的制约土壤酶的活性。植物根系分泌物、残体(含凋落物和根系脱落物)在土壤中分解过程中刺激了微生物活动, 从而增加了根际土壤酶活性。高等植物根系分泌物的种类和数量能够影响土壤微生物区系、生理类群及酶活性。在现实环境中, 由植物- 土壤- 根际微生物组成的土壤微生态系统极其复杂, 但在相同的土壤背景下, 因种植不同植物所造成的土壤根系微生态环境中的酶活性的差异显然是与各自的根系分泌物种类、数量密切相关。
2.2.5 人为因素
由于土壤酶对因环境因素引起的变化较敏感,其活性变化除受土壤自身理化性质以及微生物影响外, 一些外界的人为的因素也是影响土壤酶活性的重要原因。在这方面, 国内外的研究主要集中在重金属污染以及农药施用这两个方面。重金属对土壤酶的抑制作用可能是因为重金属抑制了与酶活性息息相关的微生物的生长代谢等生理活动有关[13]。所以重金属污染对土壤酶活性的影响因土壤类型、重金属种类、浓度以及土壤酶的种类而有所差别。近年来农药的使用将越来越多，农药污染也将成为国际非常关注的话题，研究表明：农药的性质和用量, 以及酶的种类, 土壤类型及使用条件等不同而有明显的不同, 结果可能是正效应, 也可能是负效应, 同时也可能生成适应降解这种土壤的酶系[14]。
三、土壤酶的发展前景展望
随着科技的发展土壤酶学也越来越被关注。土壤酶学的发展部在局限于单纯的酶的测定与分析，而是结合土壤微生物学、生物化学、分子生物学和生态学等相关学科所取得的进展, 土壤酶学的研究水平已经深入到分子水平和生态系统水平, 并且与全球生态问题的研究相合。通过土壤酶的分析来与农业生产实践相结合来提高粮食的生产产量。近年来环境保护将成为国际上最关注的话题，我们可以通过把土壤酶学和环境保护相结合来研究。
3.1 分子水平和生态系统水平的土壤酶研究
分子生物学技术、土壤微生物研究技术和生物化学的成就为土壤酶学向微观方向发展奠定了坚实的基础。近年来, 土壤酶研究已经深入到分子水平的研究。例如, DNA 技术、PCR 技术、凝胶电泳技术、荧光微型板酶检测技术( micro plate fluorimetricassay) 和超速冷冻离心技术等已开始应用于土壤酶与土壤微生物的相互关系研究[15-17]。不难想象, 随着土壤酶学向分子水平的发展, 土壤酶的来源、性质、功能及其在生态系统中的作用和地位必然会被逐步揭示出来.土壤酶在许多关键生态系统过程中扮演着重要的角色,因此土壤学和生态学领域均对土壤酶在生态系统中的地位和作用给予了高度的重视。由于土壤酶是土壤生物过程,如土壤有机质降解、矿质化和养分循环等的主要调节物质, 因此, 许多生态过程和功能的研究实际上已经离不开土壤酶系统的研究。
3. 2 与农业生产实践相结合
由于相关科学所取得的进步及当今人类所面临的生态环境挑战, 土壤酶学研究正面临着前所未有的发展机遇和挑战。土壤酶学的研究与发展一直与农业生产实践密切相关. 由于不良耕作、过度放牧、植被破坏和污灌等人为因素及干旱、风蚀和洪涝等自然因素已导致大量土壤退化, 因而探讨土壤退化机理和预测土壤退化对于提高农业生产力具有重要作用。由于土壤有机质与土壤理化性质密切相关, 所以土壤有机质常被认为是土壤的肥力中心, 与土壤质量密切相关[18] , 但在预测土壤耕作和田间管理对土壤质量的影响方面却因其变化太慢而存在局限性；而土壤微生物则因其对环境的敏感性太强而很难作为耕作和田间管理对土壤质量的影响指标；土壤酶活性则因其不仅与土壤理化性质密切相关, 而且与土壤水热状况、土壤生物学活性和土壤生态环境因子密切相关, 因而许多学者认为, 土壤酶活性作为监测农业生产过程对土壤质量影响的生物活性指标以及土壤质量变迁的指标是切实可行的. 目前, 土壤酶活性作为土壤质量的生物活性指标已被广泛接受。有关耕作措施、田间管理、植被扰动、放牧等自然和人类活动对土壤酶活性和微生物活性影响的研究很多。可以预见,
由于土壤质量退化的加剧和农业生产实践的要求, 土壤酶研究与生产实践的结合及其在生产实践中的指导作用仍然是21 世纪土壤酶学的发展趋势之一。
3. 3 与环境保护的研究相结合
由于土壤酶在降解有机污染物方面的特殊功能及土壤酶对重金属污染方面的特殊作用, 土壤酶研究在环境科学受到了特别的重视。化肥、除草剂、杀虫剂、灭菌剂以及污灌等对农业生态环境的影响受到各国学者和政府的高度重视, 如何消除和降解土壤有机污染物已成为土壤学、环境学、生态学和农学所面临的最大挑战。一般而言, 有机污染物的降解最终是在土壤酶的参与下进行的, 并且参与到与C、N、 P、S 等有关的物质循环中。同时, 尽管有机污染物质对土壤生物, 如微生物数量、微生物区系及动物数量和区系的危害会导致土壤酶活性的降低, 但由于土壤酶的相对稳定性有利于其对有害物质的降解。由于酶是一种特殊的蛋白质, 重金属离子能钝化其活性,因而土壤酶活性对重金属污染特别敏感, 所以利用土壤酶活性可以监测工业污染区、矿物采集区、污灌区的重金属污染状况,并且可以作为重金属污染土壤修复的生物活性指标[19]。另外, 酸雾、酸雨、臭氧等大气污染对土壤酶活性的影响也很大, 因而也可以用土壤酶活性作为监测大气污染对土壤质量的生物活性指标。目前, 全球生态环境问题的严重性及土壤酶学在环境科学和生态学中的特殊地位使21 世纪的土壤酶学面临着新的挑战。与环境保护的研究向结合是21 世纪土壤酶学的发展趋势之一。
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纤维素酶 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。 四、结果计算 土壤纤维素酶活性（μg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量（μg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；
土壤酸性磷酸酶活性的测定 1．试剂配制 (1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液 取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至 2 250ml.4摄氏度冰箱保存。 (2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀） 原液由以下成分组成: 三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g 溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL 或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯 (4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液： 36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤 置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。 培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶，用蒸馏水定容后在410nm处比色. 3．计算方法 土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示， W（mg·g-1·h-1）=M1/（m×t） 式中：M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量（mg）； t —反应时间（h）；=1h m—样品土壤的重量（g） 无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。每个处理做1个。 标准曲线的制作： 1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1L，低温保存。 2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加pH6.5通用缓冲液4ml，Cacl2.2H2O 溶液1ml，NaOH溶液4ml， ②混匀后，定量滤纸过滤到50ml容量瓶，定容后，再取各浓度标液1ml定容至50ml，以0号试管作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。 ③以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即对硝基苯酚含量n（mg）=a+b×A410.
土壤酶活性测定方法 土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h 内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品 实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯
分子生物学手段 在土壤污染生物修复中的应用 摘要: 污染土壤的修复技术主要有物理修复、化学修复和生物修复，文章 综述了分子生物学技术包括环境微生物群落降解基因分析、16S rRNA序列 分析技术以及荧光原位杂交技术在生物修复技术中跟踪污染土壤中降解微 生物行为、监测降解基因和微生物群落变化，揭示了其中的分子机制的应 用现状，对各项技术应用中需要注意的问题进行了讨论并对其发展前景进 行了展望。 关键词: 分子生物学；降解基因；16S rRNA；FISH Molecular biology techniques in bioremediation of soil: Current status and future Abstract：This review starts with a brief overview of the molecular biology techniques applied to the bioremediation of soil. The principles of the catabolic gene probe analysis of microbial community, 16S rRNA sequence analysis and fluorescent in situ hybridization (FISH) and their applications to monitoring the fate of contaminant-degrading microorganisms, detecting catabolic gene and analyzing the changes of microbial community in contaminated soil are highlighted. The problems and prospects of these techniques are discussed. Key words: molecular biology; catabolic gene; 16S rRNA; FISH
关于影响土壤酶活性因素的研究 摘要：本文对国内外土壤酶活性影响因素的研究进行了综述,总结了土壤微生物、团聚体、农药、重金属和有机物料等对土壤酶活性的影响,并对土壤纳米粒子与土壤酶活性关系的研究发展前景进行了展望。 关键词：土壤酶活性;微生物;团聚体;重金属;有机物料 Study progress on factors affecting soil enzyme activity Abstracts:In this article,the study on factors affecting soil enzyme activity in recent years was reviewed. Several aspects such as microbial,aggregation,heavy metals,organic manure and so on were included.At the same time,the effects of the soil inorganic nanometer particle (SINP) on soil enzyme activity inthe future research was forecasted. Key words:soil enzyme activity;microbial;aggregation;heavy metals;organic manure 酶是土壤组分中最活跃的有机成分之一,土壤酶和土壤微生物一起共同推动土壤的代谢过程[1]。土壤酶来源于土壤中动物、植物和微生物细胞的分泌物及其残体的分解物,其中微生物细胞是其主要来源[1,2]。土壤中广泛存在的酶类是氧化还原酶类和水解酶类,其对土壤肥力起重要作用。土壤中各有机、无机营养物质的转化速度,主要取决于转化酶、蛋白酶磷酸酶、脲酶及其他水解酶类和多酚氧化酶、硫酸盐还原酶等氧化还原酶类的酶促作用[2]。土壤酶绝大多数为吸附态,极少数为游离态,主要以物理和化学的结合形式吸附在土壤有机质和矿质颗粒上,或与腐殖物质络合共存[3]。 土壤酶活性反映了土壤中各种生物化学过程的强度和方向[4],其活性是土壤肥力评价的重要指标之一,同时也是土壤自净能力[1]评价的一个重要指标。土壤酶的活性与土壤理化特性、肥力状况和农业措施有着显著的相关性[5]。因此,研究土壤酶活性的影响因素,提高土壤酶活性,对改善土壤生态环境,提高土壤肥力有重要意义。本文对土壤酶活性影响因子的研究
土壤酶的测定 1．三角瓶用稀HNO 3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。 2．土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次，14.5×2=29g。 一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323） 1．试剂配制： (1)0.3%过氧化氢溶液： ①（1：100 30%的H 2O 2和水） ②（0.5molH 2O 2+49.5ml蒸馏水） ③（1ml30% H 2O 2+99ml蒸馏水） (2)3N硫酸： （10ml硫酸+50ml水） (3)0.1N高锰酸钾溶液： （1.58gKMnO
4+100ml蒸馏水） 2．操作步骤： 2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H 2O 2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色 3．结果计算 过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO 4的毫升数表示： M=（A－B）×T 式中： A： 空白消耗的0.1N KMnO 4毫升数 B： 滤液消耗的0.1 N KMnO 4毫升数 T： KMnO 4滴定度的校正值
以容量法测H2O2的酶活： Kappen （1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。此法根据H 2O 2与土壤相互作用时，未分解的H 2O 2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H 2O 2）测定H 2O 2的酶活 2 KMnO 4＋5H 2O 2＋3H 2SO 4→2MnSO 4＋K 2SO
土壤蔗糖酶(Solid-Sucrase,S-SC）试剂盒使用说明 分光光度法50管/24样货号：BC0240 产品简介： S-SC能够水解蔗糖变成相应的单糖而被机体吸收，其酶促作用产物与土壤中有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度密切关，是评价土壤肥力的重要指标。 S-SC催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与3，5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在540nm有特征光吸收，在一定范围内540nm光吸收增加速率与S-SC活性成正比。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰、甲苯（不允许快递）和蒸馏水。 产品内容： 试剂一：甲苯5mL×1瓶，4℃保存；（自备） 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存； 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前每瓶加入40mL蒸馏水充分溶解备用； 试剂四：液体45mL×1瓶，4℃保存； 标准品：粉剂×1支，4℃保存，含10mg无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用前加入1ml 蒸馏水溶解备用，4℃可保存1周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，可保存更长时间。 标准品准备：将标准品用蒸馏水稀释至0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/ml。 操作步骤： 试剂名称测定管对照管标准管风干土样（g）0.10.1- 试剂一（μL）1515-
振荡混匀，使土样全部湿润，37℃放置15min-试剂二（μL）250250- 试剂三（μL）750-- 蒸馏水（μL）-750- 混匀，放入37℃水浴培养24小时，10000g，4℃，离心5min，取上清液，同时准备标准品上清液或标准品（μL）200200200试剂四（μL）500500500 充分混匀，放入沸水浴中煮沸5min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀。 标准曲线的建立：540nm处蒸馏水调零，读标准管吸光值A。以浓度（y）为纵坐标，吸光度A（x）为横坐标建立标准曲线。 样品处理：测定管和对照管用蒸馏水稀释10倍后（可以吸取100μL，加入900μL蒸馏水稀释；如果吸光度大于1.5，可以适当加大稀释倍数），540nm处蒸馏水调零，读吸光值A。计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。 S-SC活力的计算： 根据标准曲线，将ΔA带入公式中（x）计算样品浓度y（mg/mL）。 单位的定义：每天每g土样中产生1mg还原糖定义为一个S-SC活力单位。 S-SC活力(U/g土样)=y×10×V反总÷W÷T=101.5×y 10：稀释倍数；T：反应时间，1d；V反总：反应体系总体积：1.015mL；W：样本质量，0.1g。
生物修复污染土壤技术研究进展 1土壤污染和生物修复概述 土壤是指陆地表面具有肥力、能够生长植物的疏松表层，其厚度一般在 2 m左右。土壤不但为植物生长提供机械支撑能力，并能为植物生长发育提供所需要的水、肥、气、热等肥力要素。 近年来，由于人口急剧增长，工业迅猛发展，固体废物不断向土壤表面堆放和倾倒，有害废水不断向土壤中渗透，大气中的有害气体及飘尘也不断随雨水降落在土壤中，导致了土壤污染。凡是妨碍土壤正常功能，降低作物产量和质量，还通过粮食、蔬菜，水果等间接影响人体健康的物质，都叫做土壤污染物。人为活动产生的污染物进入土壤并积累到一定程度，引起土壤质量恶化，并进而造成农作物中某些指标超过国家标准的现象，称为土壤污染。 土壤重污染对人体以及动植物危害的严重性以及其循环过程中不能被降解的特殊性无疑给科学家们提出了巨大的挑战。传统的修复技术，包括物理修复和化学修复，虽然在局部小范围的修复中应用效果明显，但其治理成本高，破坏土壤理化性质，存在二次污染风险，而且对于污染面积巨大且程度较轻的土壤难以实施应用。近年来，应用生物(包括植物和微生物)来修复重污染土壤的研究已经引起了各国科学家的广泛关注。生物修复方法对土壤生态环境不会有影响．是保证土壤生态健康和农业叮持续发展的重要措施[1]。 微生物修复 微生物修复是研究得最早、最深入、应用最为广泛的一种生物修复方法。它利用自然环境中的土着微生物或特效外源微生物的代谢活动，在人为优化的环境条件下加速对环境中污染物的转化、降解与去除[2]。 植物修复 ' 植物修复技术是一种新兴的绿色生物技术．能在不破坏土壤生态环境．保持土壤结构和微生物活性的情况下．通过植物的根系直接将大量的重金属元素吸收．通过收获植物地上部分来修复被污染的土壤。植物修复的机理通常包括植物
土壤酶活性测定 几种水解酶：芳基硫酸酯酶（Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)）, 葡萄糖苷酶（β-glucosidase(EC 3.2.1.21) ）和磷酸单酯酶（phosphmonoesterase(EC 3.1.3)）测定：这三种酶的测定都是依据人工合成底物（p-nitrophenyl sulphate, p-nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl phosphate,respectively）裂解后释放的p-nitrophenol 的量来测定。 Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)：称取1g土（湿重），与4ml 500mM乙酸缓冲液（acetate buffer）（pH5.8）和1ml底物（25mM）混匀。对照为4ml乙酸缓冲液加1ml灭菌蒸馏水。土壤稍作涡旋振荡，置于旋转摇床20℃，200rpm培养2h。然后，往样品中加1ml 无菌蒸馏水，往对照中加1ml底物。再加入1ml 500mM 氯化钙和4ml 500mM 氢氧化钠以终止反应。悬浮液在旋转摇床上20℃，200rpm振荡30min。9464×g离心5min，然后在400nm波长下测定上清夜中所提取的p-nitrophenol 的颜色深度。如果是在中性条件下测定，则用蒸馏水取代乙酸缓冲液。标准曲线制作：用蒸馏水配制p-nitrophenol溶液，浓度范围0-50ug/ml。 β-glucosidase(EC 3.2.1.21)：缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer）(pH6.0);底物浓度25mM，提取液用Tris缓冲液（pH12.0）. phosphmonoesterase(EC 3.1.3): 缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer）(pH4.0和9.0)（分别测定酸性和碱性磷酸酯酶），底物浓度为15mM。 脲酶Urease (EC 3.5.1.5): 称取5g土（湿土），加2.5ml脲（80mM）和20ml 75mM 硼酸缓冲液（pH10.0）。涡旋振荡，旋转摇床20℃，200rpm振荡反应4h。对照为加2.5ml灭菌蒸馏水和20ml硼酸缓冲液。4h后，处理中加2.5ml灭菌蒸馏水，对照中加2.5ml脲。然后用30ml酸化的2M氯化钾提取。悬浮液在旋转摇床20℃，200rpm振荡30min。9464×g离心5min，取1ml上清夜与9ml 蒸馏水、5ml水杨酸钠（sodium salicylate）/ 氢氧化钠溶液和2ml dichloroisocyanuric acid(Na+盐)混允，20±2℃静置1h，在690nm波长下测定溶液的颜色强度。对于中性土壤用用蒸馏水取代硼酸缓冲液。标准曲线用氯化铵标准溶液制作，浓度范围0-2.5ug/ml。 脱氢酶（Dehydrogenase）： INT（2(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride）还原酶活性（既脱氢酶活性）采用Von Mersi 和Schinner（1991）的方法测定。1g鲜土置于带盖的玻璃瓶中，加入1.5ml 1M Tris缓冲液（pH 7.0）和2ml INT（5mg/ml，溶于2%体积比的二甲替甲酰胺（N，N-dimethylformamide）中）。对照土壤加1.5ml Tris缓冲液和2ml蒸馏水。旋转摇床20℃，200rpm培养24h。然后，往样品中加2ml蒸馏水，而往对照土样中加2ml INT。然后加10ml N，N-dimethylformamide/ 甲醇（1：1，v/v）提取液终止反应，20℃，200rpm振荡1h。9464×g离心5min，464nm波长下测定上清夜的吸光值。对于中性土壤用蒸馏水取代Tris缓冲液。用INTF（iodonitrotetrazolium chloride）（Sigma）制作标准曲线，浓度范围0-27ug/ml提取液。 荧光素二乙酸酯水解（Fluorescein diacetate hydrolysis）： 称取3g鲜土，悬浮于50ml 磷酸盐缓冲液，加入250ul FDA（2mg/ml，溶于丙酮）。对照加250ul蒸馏水。土壤悬浮液在20℃，200rpm培养4h。培养结束后，样品中加250ul 蒸馏水，而对照中加250ul FDA。悬浮液涡旋振荡，取5ml置于含5ml丙酮的试管中以终
土壤酶活性测定方法 一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法 1. 试剂配制 （1）2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。 （2）3，5-二硝基水杨酸溶液1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超 过7天）。 （3）1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g N a2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中。 （4）1/15M 磷酸二氢钾1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。 （5）pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) （6）8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。 （7）甲苯。 （8）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL：取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄 糖母液（10mg还原糖/ml）。取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准 葡萄糖液（1mg/ml）； 2. 操作步骤 （1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL。加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，6000rpm离心10min。取1.0mL上清液（新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL；风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL）于50mL比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。 为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。 3．结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖（mg）=(a-b)×c 式中 a---从标准曲线查得的样品（加了基质）对应的葡萄糖浓度，mg/mL； b---从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度，mg/mL； c---换算成1g土的系数。 二、脲酶: 靛酚比色法 1. 试剂配制 （1）pH6.7柠檬酸盐缓冲液1L：取184g柠檬酸溶于300mL蒸馏水中，另取147.5g KOH溶于水，再将两种溶液合并，用1N NaOH将pH调至6.7，并用水稀至1L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，然后用乙醇稀释至100mL(A液)，保存在冰箱中。称取27g NaOH溶于100mL 水中（B液），保存在冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混合，并用蒸馏 水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液100mL：取10%的次氯酸钠溶液9mL，用水稀释定容于100mL 容量瓶中，即活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 （4）10%尿素溶液500mL：取50g尿素，用水稀释至500mL。 （5）甲苯。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/086448416.html, 土壤生物工程技术在河道坡岸生态修复中的应用 作者：刘艺灏 来源：《科技风》2017年第23期 摘要：土壤生物工程技术属于新型的集成工程技术，是利用存活植物来构筑边坡的新技术，在河道坡岸生态修复中，表现出良好的应用前景。本文就土壤生物工程的原理进行阐述，并针对土壤生物工程技术在河道坡岸生态修复中的应用做出总结。 关键词：土壤生物工程技术；河道坡岸生态；修复；应用 土壤生物工程是利用种植一些植物及其一些辅助工程来巩固边坡结构，减少水土流失，保护植被及改善周边生态环境的一项工程。近年来欧美一些发达国家用这种方法来加固边坡结构和保护环境，也有记载我国古代也用这种方法来达到稳定边坡的目的。1996年，Donald Gray 教授和Robbin Sotir女士撰写了论文“边坡稳定的生物技术和土壤生物工程”对美国边坡稳定和侵蚀控制中的宝贵的经验进行了总结，为土壤生物工程奠定了理论和实践基础。 随着人们保护环境意识的加强，逐步认识到土壤生物工程对生态修复有着重要的意义。现代土壤生物工程利用生态学原理，周密的考察和设计实际的植物和土壤生态系统，同时利用植物强化土壤的结构，限制表层的土壤颗粒，起到保护边坡的生态，防止水土流失，确保边坡的植被达到水平的作用。土壤生态技术同传统的工程技术相比，具有技术上、生态上、经济上和美学上的显著优势。但是，生物技术工程也不能完全取代传统的工程技术，两者要结合起来，达到进一步的完善。 一、土壤生物工程的原理 植物的根、茎或整体是具有生命力的土壤生物工程结构主体元素，将它们按照不同的方式和方法进行不同方位种植、插秧，建立一个个有强大生命的群体，起到稳固边坡，防止水土流失和修复生态的作用。 （一）对土壤的加固和稳定 植物的根系能够固定土壤，并且吸收其水分，使土壤的分子空间更加密集，从而使其结构更加稳固。 （二）控制水土流失
土壤蔗糖酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法） 一、原理 蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及 土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生 成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度 与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠 （11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯 2）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 3） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。 三、操作步骤 （1）标准曲线绘制 分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新 沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色， 以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶测定
土壤漆酶活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC1965 规格：100T/48S 产品内容： 试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×2瓶，4℃避光保存，临用前每瓶加7.5mL试剂一溶解。 试剂三：液体3mL×1瓶，常温保存。若有白色物质析出，放于37℃中溶解即可。 产品说明： 土壤漆酶（SL）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，广泛分布于真菌和高等植物中，具有较强的氧化还原能力，在纸浆生物漂白，环境污染物降解和木质纤维素降解以及生物检测方面有非常广泛的应用。 漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基，在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS，测定ABTS自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、震荡仪、30目筛（或更小）。操作步骤： 一、样本处理 新鲜土样风干，过30目筛。 二、测定操作 1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到420nm，蒸馏水调零。 2.加样表： 试剂名称测定管对照管 土样（g）0.030.03
试剂一（μL）135135 试剂二（μL）150- 37℃水浴反应10min。 试剂三（μL）1515 试剂二（μL）-150 4℃12000g离心15min，取200μL上清于420nm测定其吸光值，分别记为A测定管、A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。 三、土壤漆酶（SL）活性计算公式 （1）按微量比色皿计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟生成1nmol ABTS自由基所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 SL活性（U/g）=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T=0.833×△A÷W。 ε：ABTS自由基摩尔消光系数：36000L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，3×10-4L；W，样本质量，g；T：反应时间，10min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 （2）按96孔板计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟生成1nmol ABTS自由基所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 SL活性（U/g）=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T= 1.39×△A÷W。 ε：ABTS自由基摩尔消光系数：36000L/mol/cm；d：比色皿光径，0.6cm；V反总：反应总体积，3 ×10-4L；W，样本质量，g；T：反应时间，10min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 注意事项： 1.试剂一需临用前配制，并且尽快使用，4℃保存一周，若变色则不能使用。 2.测定之前进行预实验，若吸光值较高（A＞1.5），请减少土样质量再进行测定。若数值偏小可以延长反 应时间或增加土样质量进行测定。 3.离心后若上清仍然浑浊，可再次离心去除。
土壤与环境微生物研究法／李振高，骆永明，滕应编著．一北京：科学出版社，2008 过氧化氢酶（398-399）脲酶（404-405）磷酸酶（412-413） 关松荫/土壤酶及其研究法农业出版社 1986年七月第一版蔗糖酶274-276 土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法 （一）方法原理 土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。 （二）试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，加蒸馏水90ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：取184g柠檬酸溶于300ml蒸馏水中，另取147.5g KOH 溶于蒸馏水，再将二种溶液合并，用1N NaOH将pH调节至6.7，用水稀释至1L。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）： 62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A 液），存于冰箱中； 27克NaOH溶于100毫升水（B液）,存于冰箱中。 将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将两种溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg 氮的标准液（100ppm）。 （三）测定步骤 （1）标准曲线绘制 吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即为10ppm，吸取0、1、2、3、4、5、10、15、20 mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。即为0、0.2ppm、0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、1ppm、2ppm、3ppm、4ppm的标准曲线。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。 （2）土壤中脲酶活性的测定 称取10g土壤置于100ml容量瓶中。用2mL甲苯处理15分钟。往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置24 h。之后用38℃水定容至100ml（甲苯浮在刻度线上）。与此同时，进行以水代替基质（10ml 10%尿素用10ml蒸馏水代替），及无土对照测定。 培养结束后，将悬液过滤。吸取3mL（视情况而定）滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。 以每克土壤在37℃下24h内酶解尿素释放的NH3-N 的毫克数来表示脲酶活性。
土壤生物工程———边坡生态修复的新技术土壤生物工程是一项建立在可靠的土壤工程基础上的生物工程，即采用存活植物及其他辅助材料来构筑各类边坡（山地斜坡、江河湖库堤岸、海岸坡岸等）结构，实现稳定边坡，减少水土流失和改善栖息地生境等功能的集成工程技术。利用植物稳定边坡的方法自古就有，近20年来又在欧美风靡一时，成为边坡稳定、侵蚀控制和生境修复的重要工程手段。 土壤生物工程的生态修复作用与效果，已经越来越为人们所认识。现代土壤生物工程要求运用生态学的原理，对实际的植物和土壤系统作出周密的考察和设计，利用植物对土壤结构的强化，对表层土壤颗粒运动的限制，以及对边坡生态系统的改善等作用，不仅能够稳定边坡和控制水土流失，还能确保边坡植被水平和垂直结构合理，生态系统演替有序和景观优美。同传统的工程技术相比，土壤生物工程的技术、生态、经济和美学优势是显而易见的。当然，土壤生物工程不能完全替代传统的工程技术，在工程实际中通常是两者联合使用、相互完善。 土壤生物工程的原理 与其他工程不同，土壤生物工程采用有生命力植物的根、茎（枝）或整体作为结构的主体元素，把它们按一定的方式、方向和排列插扦、种植或掩埋在边坡的不同位置；在植物群落生长和建群过程中加固和稳定边坡，控制水土流失和实现生态修复。 众多研究表明：植物能降低土壤空隙的压力，吸收土壤水分；同时植物根系能提高土壤的剪切力，增强土体的黏附力，从而使土壤结构趋于坚固和稳定。边坡植物可以截留降雨，延滞径流，调节土壤湿度，减少风力对土壤表面的影响；还可以通过拦截、蒸发蒸腾和存储等方式来促进土壤水循环，促进土壤发育和表层活土的形成，调节近地面温度和湿度以促进植物生长，提供并改善多种生境，恢复边坡的生态功能和生物多样性。 土壤生物工程的基本技术 土壤生物工程要求使用大量的可以迅速生长新根的木本植物，最常用的木本灌木和乔木是：柳、杨类、山茱萸类、或其他当地物种。除了要求迅速生根之外，用于河道坡岸的植物，特别是在水位线附近的植物还必须有良好的耐水性能。土壤生物工程的种植技术比较简单，主要有3种形式（见图）：（1）单枝扦插：直接扦插能够成活并生长根系的乔灌木枝干（如柳枝条等）。其工程特点为工作量小，成本低，有广泛的适应性，经常与柴笼和灌丛垫联合使用。 （2）捆栽：也叫柴笼，将枝条捆扎成一束，通常按等高线水平浅埋入岸坡高水位以上的位置。其工程特点为施工简单，造型容易，多用于坡度较缓的边坡水土流失控制。柴笼生长成型后具有很好的景观效果。 （3）层栽：也称灌丛垫，植物枝条的结构是交互成层或成排形状，枝条组成篱笆状，既可按水平或垂直方向布置，也可按不同的角度插栽。通常与其他结构例如土工布、石笼、堆石等联合使用，其施工技术较为复杂。生长成型后，具有较强的抗侵蚀、抗冲蚀和稳固岸坡的功能，而且景观效果很好。 上述3种基本的种植技术和方法，从点、线、面结合起来，可以构筑各种不同类型的边坡、不同形状的坡面和不同景观效果的生态坡岸。 在河道生态坡岸上的应用 上海市环境科学研究院和华东师范大学河口海岸国家重点实验室对土壤生物工程技术和方法进行了系统的研究和开发，并于2004年初在上海市浦东新区机场镇使用土壤生物工程技术构筑生态河道的生态坡岸。示范工程表明，土壤生物工程对河道坡岸的生态系统有明显的修复和改善作用：（1）植物根系对坡岸的稳定作用 许多研究表明，土壤的剪切力或黏结力与土壤中根系的生物量成正比关系。经过9个月的生长，坡岸土壤中植物根系新增生物量达每立方米0.12～0.34公斤（干重），大大增强了河道坡岸的稳定性。而没有采用土壤生物工程的坡岸，虽然经过疏浚和整治，但坡岸长期裸露，植被得不到恢复，造成严重的坡岸侵蚀，先前的疏浚和整治功亏一篑。 （2）对河道坡岸栖息地的改善
土壤纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法） 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与?3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可 用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L； 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至1L； 取11ml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml 水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，
蔗糖酶测定（比色法）： 蔗糖酶是一种可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能够被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶，为土壤生物体提供充分能源，其活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律。 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。因此，蔗糖酶的活性可以根据水解生成物与某些物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物含量来确定。现介绍3，5-二硝基水杨酸比色法，该方法以蔗糖为基质，根据葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸反应生成黄色产物，来确定土壤蔗糖酶活性。 试剂 1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称取0.5克二硝基水杨酸，溶于20mL 2mol/L氢氧化钠和50毫升水中，再加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过一周）。 2）pH值为5.5的磷酸缓冲液：1/15mol/L磷酸氢二钠（11.867g Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中）0.5毫升加1/15mol/L 磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1升蒸馏水中）9.5毫升配成。 3）8％蔗糖溶液。 4）甲苯 5) 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg 溶于100ml蒸馏水中，即成葡萄糖标准溶液（5mg/ml）。再将此液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/ml）。 操作步骤 称取5g土，置于50mL三角瓶中，加入5滴甲苯，15min后注入15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸缓冲液，摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。 到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。 每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。 在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。