关于影响土壤酶活性因素的研究
摘要：本文对国内外土壤酶活性影响因素的研究进行了综述,总结了土壤微生物、团聚体、农药、重金属和有机物料等对土壤酶活性的影响,并对土壤纳米粒子与土壤酶活性关系的研究发展前景进行了展望。
关键词：土壤酶活性;微生物;团聚体;重金属;有机物料
Study progress on factors affecting soil enzyme activity Abstracts:In this article,the study on factors affecting soil enzyme activity in recent years was reviewed. Several aspects such as microbial,aggregation,heavy metals,organic manure and so on were included.At the same time,the effects of the soil inorganic nanometer particle (SINP) on soil enzyme activity inthe future research was forecasted.
Key words:soil enzyme activity;microbial;aggregation;heavy metals;organic manure
酶是土壤组分中最活跃的有机成分之一,土壤酶和土壤微生物一起共同推动土壤的代谢过程[1]。土壤酶来源于土壤中动物、植物和微生物细胞的分泌物及其残体的分解物,其中微生物细胞是其主要来源[1,2]。土壤中广泛存在的酶类是氧化还原酶类和水解酶类,其对土壤肥力起重要作用。土壤中各有机、无机营养物质的转化速度,主要取决于转化酶、蛋白酶磷酸酶、脲酶及其他水解酶类和多酚氧化酶、硫酸盐还原酶等氧化还原酶类的酶促作用[2]。土壤酶绝大多数为吸附态,极少数为游离态,主要以物理和化学的结合形式吸附在土壤有机质和矿质颗粒上,或与腐殖物质络合共存[3]。
土壤酶活性反映了土壤中各种生物化学过程的强度和方向[4],其活性是土壤肥力评价的重要指标之一,同时也是土壤自净能力[1]评价的一个重要指标。土壤酶的活性与土壤理化特性、肥力状况和农业措施有着显著的相关性[5]。因此,研究土壤酶活性的影响因素,提高土壤酶活性,对改善土壤生态环境,提高土壤肥力有重要意义。本文对土壤酶活性影响因子的研究
进展进行了综述,以期为土壤酶活性的深入研究和土壤培肥理论及其应用提供研究思路和方向。
1 土壤微生物
在土壤酶学研究中,一直关注的是土壤贮积酶,即存在于无微生物增殖土壤中的酶[1],其理论依据是:土壤生物释出的酶极易钝化和酶解,而贮积酶活性则能保持较长时间。但是,越来越多的研究[6,7]表明,在测得的土壤酶活性值中,活体微生物对土壤酶的影响相当大。有报道[8]指出,脲酶、磷酸酶和纤维素酶的活性与微生物量有较密切的关系,3种酶的活性随着生物量的增加而不断增强,二者变化基本保持同步。脱氢酶活性与土壤微生物的关系不明显,其变化规律与生物量相比呈现不规则性。而蔗糖酶活性与土壤微生物数量、土壤呼吸强度有直接依赖性[1]。Naseby[9]通过向根际接种遗传改性微生物,使根际土壤的碱性磷酸酶、磷酸二酯酶及芳基硫酸酯酶的活性增强,同时使β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶及N-乙酰基氨基葡糖酶的活性减弱,该结果说明,遗传改性微生物生成的酶,对土壤的碳、磷转化具有重要作用。还有研究[10]表明,玉米生长的中前期,土壤微生物量碳、氮与土壤过氧化氢、蔗糖酶、脲酶、蛋白酶活性及速效养分的相关性均达到显著或极显著水平。鉴于酶与微生物之间显著的相关性,Mawdsley等[11]和Naseby等[12]曾通过测定胞表酶的活性来研究遗传改性微生物对土壤代谢的影响。对VA菌根真菌改善植物磷营养的机理研究[13- 15]表明,VA真菌分泌的磷酸酶能矿化土壤有机磷,同时,由VA真菌分泌的谷酰胺合成酶和谷酰胺脱氢酶酶促的对氨态氮和硝态氮的同化,也改善了植物的磷营养[16]。
因此,对不同土壤微生物与不同土壤酶关系的研究,将是土壤酶未来研究的热点。其重要意义在于,土壤微生物的生物多样性决定了其功能的多样性,而土壤微生物作为媒介,由其生成和释出的酶催化的诸多生物化学过程,是土壤功能多样性的前提和基础。
2 土壤水气热条件
土壤水分、空气和热量状况对土壤酶活性的影响是明显的,一方面,其与土壤微生物的活性和类型有显著的相关性,因此,必然对土壤酶的活性产生巨大影响。另一方面,不同水分条件、空气组成和水分状况,也会直接影响土壤酶活性的存在状态与活性强弱。
一般情况下[1],土壤湿度较大时,酶活性较高,但土壤过湿时,酶活性减弱。Birch[3]研究了具有连续雨季和旱季地区的土壤酶活性,他指出当旱季结束雨季开始时,土壤酶活性显著增强[3]。土壤含水量减少时,酶活性也减弱。
土壤温度直接影响释放酶类的微生物种群及数量,因此,土壤温度是影响酶活性的因素
之一[1]。有研究[17,18]表明,当温度由10℃上升到60或70℃时,土壤酶活性显著增加;但随着温度的进一步升高,脲酶迅速钝化;在150℃下加热24 h或115℃下加热15 h,土壤酶会完全失活。
因为土壤CO2和O2与土壤微生物的活动状态有关,所以土壤空气对土壤酶活性有直接影响。Overrein(1963)[1]指出,氧与脲酶活性有关;除半纤维素酶外,蔗糖酶、淀粉酶、纤维素酶、脲酶、磷酸酶和硫酸酶同土壤氧的摄取量均呈正相关。
由此可见,土壤水气热对土壤酶活性的影响是非常显著的,如同对微生物的研究要注意水气热条件的合理设置一样,对某些土壤酶的研究,也必须考虑到其所适应的最佳水气热条件的控制和选择。尤其对污染土壤酶的修复研究及有机肥料的生化处理与制造的研究,更要强调水气热条件的分析设定。
3 土壤酸碱性
土壤酸碱性直接影响着土壤酶参与生化反应的速度。有些酶促反应对pH值变化很敏感,甚至只能在较窄的pH范围内进行[1]。和文祥等[18]、Franken-berger等[19]研究发现,土壤脲酶的两个最适pH值为pH=6.5～7.0或pH=8.8～9.0,土壤磷酸酶的最适pH值为4.0～5.0,6.0～7.0,8.0～10.0,分别称为酸性、中性、碱性磷酸酶。当pH在5.0以下时,过氧化氢酶和脱氢酶的活性几乎完全丧失,而转化酶和脲酶受酸度的影响较小,但与土壤腐殖质含量呈正相关[20]。另有研究[21]表明,pH对脲酶的巯基、氨基、羧基等组成部分所处状态及蛋白质构型(三级结构)的影响,也会导致酶活性的改变。徐冬梅等[22]研究表明,低酸度先对脲酶、中性磷酸酶产生一定的激活效应,进而转化为抑制,而[H+]离子浓度为0～55 mmol/kg时,外源酸对转化酶与酸性磷酸酶的活性表现为明显的激活效应。
4 土壤有机质、氮、磷及微量元素
土壤中有机质含量只有百分之零点几至百分之几,虽然数量比率不高,但其对土壤理化性质影响很大。土壤酶可以吸附在有机物质上,一系列的土壤酶,如脲酶、二酚氧化酶、蛋白酶以及水解酶等,都曾以“酶-腐殖物质复合物”的形式从土壤中提取出来,这些提取物中的酶仍可保留有活性,在某些情况下,还有较强的抗分解能力和热稳定性[23]。一般而言,土壤全氮、全磷含量与有机质含量是成比例的,所以土壤N,P含量与土壤酶活性有关[1]。土壤有机质、全氮、全磷通过直接和间接效应成为影响脲酶和酸性磷酸酶、转化酶活性的主要因素[24]。酶的活性与有机质分布剖面有关,而且随剖面加深而降低[25]。土壤转化酶、蛋白酶、磷酸酶和脲酶活性与土壤有机质(有机碳)呈极显著相关(P <0.01)或显著相关(P <0.05),与全氮显著
相关;过氧化氢酶、转化酶、蛋白酶、磷酸酶、脲酶与速效氮、速效磷较显著相关、显著相关或极显著相关;脲酶与全磷呈极显著相关[26]。杨远平[27]对毕节地区土壤磷酸酶活性的研究也表明,土壤磷酸酶活性与全氮、有机质、速效磷、水解氮等关系密切。樊军等[28]研究表明,土壤脲酶、碱性磷酸酶、蛋白酶活性随土壤有机碳含量的增加而增加,蔗糖酶、过氧化氢酶活性与有机碳之间的关系因施肥种类及种植方式的不同而不同。汪远品等[29]较为系统全面地测了贵州省主要耕作土壤的脲酶活性,其回归分析表明,土壤脲酶活性主要受土壤有机质及氮、磷、钾等因素的影响,其中土壤基础铵量对耕作土壤脲酶活性影响最大。微量元素是植物、微生物和酶的激活剂和抑制剂,土壤的微量元素含量可能是决定土壤酶活性的一个重要生态学因素[30]。微量元素对土壤酶活性的影响,取决于土壤的性质及不同酶类对微量元素的专有特性,对某些酶起激活作用的微量元素,对另一种酶则可能起抑制作用[31,32]。而且,同一微量元素的含量不同时,既可以起激活酶的作用,也可以起到抑制酶的作用[30]。李跃林等[32]研究表明,锌和锰对土壤蛋白酶活性影响的正效应最大,即促进作用较大。锌在一定程度上对脲酶和过氧化氢酶有负效应,即有一定的抑制作用,而锰对其有正效应,即促进作用。
5 土壤团聚体和粘粒
土壤团聚体是反映土壤理化性质和养分状况的一个指标,是由微小矿物颗粒复合而成的稳定结构,一般可分为大团聚体(>250μm)和微团聚体(50～250μm),直径为0.5～3 mm的团聚体是决定土壤肥力水平的重要因素之一[33]。不同粒径团聚体的酶活性不一样,小团聚体的酶活性要比大团聚体中的高[3]。团聚体的稳定性也与酶活性有关,如脲酶活性与土壤团聚体的稳定性及土壤容重呈显著负相关,转化酶活性与土壤团聚体的稳定性呈显著的正相关[34]。周礼恺等[1]提出,黑土、棕壤脲酶活性主要集聚在微团聚体上,相当于土壤粒级的粘粒部分。随粒径增大,脲酶活性有下降趋势。糖酶主要吸附在粉砂粒上[3]。粘粒和粉砂对酶吸附量的多少,与这些土粒的矿物组成有关。
粘粒由于具有颗粒细、表面积大及某些矿物结构的特定特征,而使其成为土壤中最活跃的矿物组分。粘粒是土壤具有许多物理、化学性质的根源[35],其可与土壤腐殖质共同组成复合胶体。土壤酶只有一小部分存在于土壤溶液中,其大部分被土壤粘粒、腐殖质等物质吸附,其可通过阳离子交换反应的方式与粘粒矿物结合[23]。粘粒对酶的吸附量受酸度、温度等环境条件影响,土壤pH值越低(低于酶蛋白的等电点),粘粒吸附的酶越多[23]。由于脲酶为一弱酸性酶,所以脲酶在弱酸性介质中的吸附量大于弱碱性介质;在20～60℃时,各土壤粘粒的脲酶吸附量随温度升高而降低[36]。土壤中性磷酸酶和蛋白酶活性与脲酶的分布规律一致,主
要吸附在土壤胶粒和粘粒部分;土壤硫酸酶活性与粘粒总表面积有关;磷酸酶活性绝大部分为粘粒吸附[1]。不同土壤粘粒对酶吸附量也不同,冯贵颖等[36]研究表明,土壤粘粒对脲酶均有吸附,且吸附数量不尽相同,同一土壤粘粒,表现为原样土壤粘粒的吸附量大于去有机质土壤粘粒;不同土壤粘粒对酶的吸附量,表现为原样土娄土>原样黑垆土>原样黄绵土>去有机质黑垆土>去有机质黄绵土>原样黄褐土>去有机质土娄土>去有机质黄褐土。
6 农药及重金属污染物
6.1 农药
近年来,化学农药在农业上的广泛应用,对农业生态及人类生存环境造成了严重污染。农药施入土壤,对土壤酶活性也产生了强大影响。沈标等[37]研究表明,农药中常含有的氯苯对脲酶活性具有轻微刺激作用;氯苯质量浓度在100,200,300 mg /kg时均可使脱氢酶活性提高,但对脱氢酶活性的刺激促进作用随氯苯质量浓度的递增而下降;当氯苯质量浓度为200 mg /kg时,其对蔗糖酶活性有较轻的抑制作用。农药“六六六”有降低自然土壤中过氧化氢酶活性的作用[38]。和文祥等[39]研究表明,杀虫双对土壤脲酶、多酚氧化酶和过氧化氢酶具有明显的抑制作用,在低浓度时抑制幅度较大,高浓度时抑制幅度较小;和文祥[40]还指出,杀虫双对碱性和酸性磷酸酶活性的强烈抑制,达极显著负相关,而中性磷酸酶对杀虫双反应较为迟钝。
6.2 重金属
重金属随工业三废的排放以及肥料的施用进入土壤,由于其的难降解性和难移动性而对土壤生态系统产生破坏,从而影响土壤酶活性。但土壤酶活性的降低主要是由于酶合成作用的下降以及由此引起的微生物生长受到抑制,而不是重金属对酶的直接抑制[41]。有研究[42]表明,Cd,Zn,Pb共存时,其对脲酶的影响表现出协同抑制负效应;对过氧化氢酶却表现出一定拮抗作用或屏蔽作用,尤其Pb浓度较高时,屏蔽作用较为明显;对转化酶和碱性磷酸酶的影响随Cd浓度增加而降低,其中以Cd的抑制作用最为显著。和文祥等[43]研究表明,不同状态(溶液态、粘粒态和土壤态)脲酶对Hg,Cd的反应表现出类似的规律性变化,即Hg,Cd抑制脲酶活性,其中Hg+ Cd复合污染的影响幅度最大,Hg的生态毒性最强。汞的加入降低了土壤脲酶活性,且随汞浓度增加,土壤脲酶活性减小。这主要是因为汞与酶活性部位——巯基和含咪唑基的配位体结合形成了非常稳定的化学键,因而对脲酶具有较强的抑制作用[44]。不同pH 值下,汞镉对脲酶活性的抑制作用有明显差别,pH=6.0时,汞、镉对土壤脲酶活性抑制幅度最大,pH=7.5时则相反[45]。
7 有机物料及培肥方式
不同培肥方式对土壤酶活性影响不同,有机肥料具有较强的酶活性[34,46-48]。与土壤有机质相比,土壤酶活性能够更迅速地反映管理与培肥措施对土壤肥力的影响[49]。和文祥等[50]对肥料长期定位试验的研究发现,培肥模式中厩肥处理可显著提高土壤总体酶活性;施用厩肥酶活性增幅最高,化肥则较小,无肥反而降低。有研究[51]表明,以牲畜粪作有机肥时,施用猪粪的土壤脲酶活性较高。而绿肥能提高脱氢酶的活性[3]。另有报道[34,52,53]指出,在黑钙土中分别添加5%的草木樨、玉米秸秆、麦秆3种有机物料,对蛋白酶活性的影响表现为玉米秸秆>麦秆>草木樨;对脲酶活性和磷酸酶活性的影响表现为草木樨>玉米秸秆>麦秸。对长期不同施肥水平,冬小麦连作旱地农田土壤脲酶与碱性磷酸酶动力学参数的测定[54]结果表明,动力学参数(Km,Vmax,Vmax/Km)从几个方面反映了不同施肥条件下土壤酶活性的特征及不同酶之间的差别,有机肥对脲酶的Vmax,Vmax/Km及碱性磷酸酶的Km,Vmax影响最大[54]。另外,化肥的施用与对照相比也提高了土壤酶活性,但幅度较小。而施用化肥提高土壤酶活性的原因,是由于化肥能促进作物根系代谢,使根系分泌物增多,微生物繁殖加快,从而有利于土壤酶活性的提高[55]。
8 结语
由上述分析可见,土壤酶活性的影响因素非常复杂,土壤中微生物种类、水气热状况、酸碱度、结构组成、养分丰缺、污染程度及培肥方式等都显著地影响着土壤酶活性。由于土壤酶活性是评价土壤肥力的重要指标之一,所以有关土壤生物活性影响因素的研究将一直是土壤培肥理论和应用研究的重要组成部分。从发展趋势看,未来如下几个方面的研究可能具有重要的意义:第一,通过对不同土壤酶活性与上述相应影响因素的相关性及影响程度的研究,筛选出反映不同土壤肥力因素变化的特征酶,最终确立土壤肥力诊断的酶学标准。第二,对土壤微生物酶与土壤贮积酶间的关系及其在土壤有机培肥和土壤污染修复中的作用进行研究,相关进展可能为有机培肥机理研究和土壤酶修复研究奠定理论基础。第三,土壤纳米粒子与土壤酶活性的关系研究,将是今后土壤生物学活性影响因素研究的一个发展方向。
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探究影响酶活性的因素 一、探究温度对酶活性的影响 （一）实验原理（注：市售a-淀粉酶的最适温度约600C）： 1．淀粉遇碘后，形成紫蓝色的复合物。 2．淀粉酶可以使淀粉逐步水解成麦芽糖和葡萄糖，麦芽糖和葡萄糖遇碘后不显色。 （二）方法步骤： 1、取3支试管，编上号（A、B、C），然后分别注入2mL可溶性淀粉溶液。 2、另取3支试管，编上号（a、b、c），然后分别注入1mL新鲜淀粉酶溶液。 3、将装有淀粉溶液和酶溶液的试管分成3组，A和a试管放入热水（约600C）、B和b放 入沸水，C和c放入冰块中，维持各自的温度5min。 思考题1、不能只用不同温度处理淀粉溶液或酶溶液，这是为什么？ 4、分别将淀粉酶溶液注入相同温度下的淀粉溶液中，摇匀后，维持各自的温度5min。 5、在3支试管中各滴入1-2滴碘液，摇匀后观察这3支试管中溶液颜色变化并记录。 思考题2、在试管A、B、C中分别能观察到什么现象？ 思考题3、通过上述实验，你能得出什么结论？ 思考题4、在上述实验中，自变量是什么？无关变量是什么？ 思考题5、探究温度对酶活性的影响实验中是否可以用斐林试剂来检验实验结果？ 为什么？ 二、探究PH值对酶活性的影响 （一）实验原理：思考题6、请依据下面所列实验操作步骤，写出该实验的实验原理。
（二）操作步骤：用表格显示实验步骤：（注意操作顺序不能错） 思考题7、请在上表中填入你所观察到的实验现象。 思考题8、通过上述实验，你能得出什么结论？ 思考题9、在上述实验中，自变量是什么？无关变量是什么？ 思考题10、在设计“影响酶活性的条件”实验中最关键的一步是什么？ 附加实验：思考题11、能否用淀粉酶探究PH对酶活性的影响？ 课堂练习： 1.（多选）在证明酶的催化作用受温度影响的实验时，有学生取两支试管分别将淀粉溶液与唾
纤维素酶 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。 四、结果计算 土壤纤维素酶活性（μg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量（μg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；
关于影响土壤酶活性因素的研究 摘要：本文对国内外土壤酶活性影响因素的研究进行了综述,总结了土壤微生物、团聚体、农药、重金属和有机物料等对土壤酶活性的影响,并对土壤纳米粒子与土壤酶活性关系的研究发展前景进行了展望。 关键词：土壤酶活性;微生物;团聚体;重金属;有机物料 Study progress on factors affecting soil enzyme activity Abstracts:In this article,the study on factors affecting soil enzyme activity in recent years was reviewed. Several aspects such as microbial,aggregation,heavy metals,organic manure and so on were included.At the same time,the effects of the soil inorganic nanometer particle (SINP) on soil enzyme activity inthe future research was forecasted. Key words:soil enzyme activity;microbial;aggregation;heavy metals;organic manure 酶是土壤组分中最活跃的有机成分之一,土壤酶和土壤微生物一起共同推动土壤的代谢过程[1]。土壤酶来源于土壤中动物、植物和微生物细胞的分泌物及其残体的分解物,其中微生物细胞是其主要来源[1,2]。土壤中广泛存在的酶类是氧化还原酶类和水解酶类,其对土壤肥力起重要作用。土壤中各有机、无机营养物质的转化速度,主要取决于转化酶、蛋白酶磷酸酶、脲酶及其他水解酶类和多酚氧化酶、硫酸盐还原酶等氧化还原酶类的酶促作用[2]。土壤酶绝大多数为吸附态,极少数为游离态,主要以物理和化学的结合形式吸附在土壤有机质和矿质颗粒上,或与腐殖物质络合共存[3]。 土壤酶活性反映了土壤中各种生物化学过程的强度和方向[4],其活性是土壤肥力评价的重要指标之一,同时也是土壤自净能力[1]评价的一个重要指标。土壤酶的活性与土壤理化特性、肥力状况和农业措施有着显著的相关性[5]。因此,研究土壤酶活性的影响因素,提高土壤酶活性,对改善土壤生态环境,提高土壤肥力有重要意义。本文对土壤酶活性影响因子的研究
土壤酸性磷酸酶活性的测定 1．试剂配制 (1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液 取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至 2 250ml.4摄氏度冰箱保存。 (2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀） 原液由以下成分组成: 三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g 溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL 或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯 (4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液： 36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤 置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。 培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶，用蒸馏水定容后在410nm处比色. 3．计算方法 土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示， W（mg·g-1·h-1）=M1/（m×t） 式中：M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量（mg）； t —反应时间（h）；=1h m—样品土壤的重量（g） 无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。每个处理做1个。 标准曲线的制作： 1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1L，低温保存。 2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加pH6.5通用缓冲液4ml，Cacl2.2H2O 溶液1ml，NaOH溶液4ml， ②混匀后，定量滤纸过滤到50ml容量瓶，定容后，再取各浓度标液1ml定容至50ml，以0号试管作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。 ③以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即对硝基苯酚含量n（mg）=a+b×A410.
影响酶活性的因素 a.温度： 温度（temperature）对酶促反应速度的影响很大，表现为双重作用：（1）与非酶的化学反应相同，当温度升高，活化分子数增多，酶促反应速度加快，对许多酶来说，温度系数（temperature coefficient）Q10多为1～2，也就是说每增高反应温度10℃，酶反应速度增加1～2倍。（2）由于酶是蛋白质，随着温度升高而使酶逐步变性，即通过酶活力的减少而降低酶的反应速度。以温度（T）为横坐标，酶促反应速度（V）为纵坐标作图,所得曲线为稍有倾斜的钟罩形。曲线顶峰处对应的温度，称为最适温度（optimum temperature）。最适温度是上述温度对酶反应的双重影响的结果，在低于最适温度时，前一种效应为主，在高于最适温度时，后一种效应为主，因而酶活性迅速丧失，反应速度很快下降。动物体内的酶最适温度一般在35～45℃，植物体内的酶最适温度为40～55℃。大部分酶在60℃以上即变性失活，少数酶能耐受较高的温度，如细菌淀粉酶在93℃下活力最高，又如牛胰核糖核酸酶加热到100℃仍不失活。 最适温度不是酶的特征性常数，它不是一个固定值，与酶作用时间的长短有关，酶可以在短时间内耐受较高的温度，然而当酶反应时间较长时，最适温度向温度降低的方向移动。因此，严格地讲，仅仅在酶反应时间已经规定了的情况下，才有最适温度。在实际应用中，将根据酶促反应作用时间的长短，选定不同的最适温度。如果反应时间比较短暂，反应温度可选定的略高一些，这样，反应可迅速完成；若反应进行的时间很长，反应温度就要略低一点，低温下，酶可长时间发挥作用。 各种酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。在适宜的温度范围内，温度每升高10℃，酶促反应速度可以相应提高1～2倍。不同生物体内酶的最适温度不同。如，动物组织中各种酶的最适温度为37～40℃；微生物体内各种酶的最适温度为25～60℃，但也有例外，如黑曲糖化酶的最适温度为62～64℃；巨大芽孢杆菌、短乳酸杆菌、产气杆菌等体内的葡萄糖异构酶的最适温度为80℃；枯草杆菌的液化型淀粉酶的最适温度为85～94℃。可见，一些芽孢杆菌的酶的热稳定性较高。过高或过低的温度都会降低酶的催化效率，即降低酶促反应速度。 最适温度在60℃以下的酶，当温度达到60～80℃时，大部分酶被破坏，发生不可逆变性；当温度接近100℃时，酶的催化作用完全丧失。 一般而言，温度越高化学反应越快，但酶是蛋白质，若温度过高会发生变性而失去活性，因而酶促反应一般是随着温度升高反应加快，直至某一温度活性达到最大，超过这一最适温度，由于酶的变性，反应速度会迅速降低。 热对酶活性的影响对食品很重要，如，绿茶是通过把新鲜茶叶热蒸处理而得，经过热处理，使酚酶、脂氧化酶、抗坏血酸氧化酶等失活，以阻止儿茶酚的氧化来保持绿色。红茶的情况正相反，是利用这些酶进行发酵来制备的。
土壤酶的测定 1．三角瓶用稀HNO 3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。 2．土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次，14.5×2=29g。 一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323） 1．试剂配制： (1)0.3%过氧化氢溶液： ①（1：100 30%的H 2O 2和水） ②（0.5molH 2O 2+49.5ml蒸馏水） ③（1ml30% H 2O 2+99ml蒸馏水） (2)3N硫酸： （10ml硫酸+50ml水） (3)0.1N高锰酸钾溶液： （1.58gKMnO
4+100ml蒸馏水） 2．操作步骤： 2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H 2O 2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色 3．结果计算 过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO 4的毫升数表示： M=（A－B）×T 式中： A： 空白消耗的0.1N KMnO 4毫升数 B： 滤液消耗的0.1 N KMnO 4毫升数 T： KMnO 4滴定度的校正值
以容量法测H2O2的酶活： Kappen （1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。此法根据H 2O 2与土壤相互作用时，未分解的H 2O 2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H 2O 2）测定H 2O 2的酶活 2 KMnO 4＋5H 2O 2＋3H 2SO 4→2MnSO 4＋K 2SO
土壤酶活性测定方法 土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h 内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品 实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯
土壤酶活性测定 几种水解酶：芳基硫酸酯酶（Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)）, 葡萄糖苷酶（β-glucosidase(EC 3.2.1.21) ）和磷酸单酯酶（phosphmonoesterase(EC 3.1.3)）测定：这三种酶的测定都是依据人工合成底物（p-nitrophenyl sulphate, p-nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl phosphate,respectively）裂解后释放的p-nitrophenol 的量来测定。 Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)：称取1g土（湿重），与4ml 500mM乙酸缓冲液（acetate buffer）（pH5.8）和1ml底物（25mM）混匀。对照为4ml乙酸缓冲液加1ml灭菌蒸馏水。土壤稍作涡旋振荡，置于旋转摇床20℃，200rpm培养2h。然后，往样品中加1ml 无菌蒸馏水，往对照中加1ml底物。再加入1ml 500mM 氯化钙和4ml 500mM 氢氧化钠以终止反应。悬浮液在旋转摇床上20℃，200rpm振荡30min。9464×g离心5min，然后在400nm波长下测定上清夜中所提取的p-nitrophenol 的颜色深度。如果是在中性条件下测定，则用蒸馏水取代乙酸缓冲液。标准曲线制作：用蒸馏水配制p-nitrophenol溶液，浓度范围0-50ug/ml。 β-glucosidase(EC 3.2.1.21)：缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer）(pH6.0);底物浓度25mM，提取液用Tris缓冲液（pH12.0）. phosphmonoesterase(EC 3.1.3): 缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer）(pH4.0和9.0)（分别测定酸性和碱性磷酸酯酶），底物浓度为15mM。 脲酶Urease (EC 3.5.1.5): 称取5g土（湿土），加2.5ml脲（80mM）和20ml 75mM 硼酸缓冲液（pH10.0）。涡旋振荡，旋转摇床20℃，200rpm振荡反应4h。对照为加2.5ml灭菌蒸馏水和20ml硼酸缓冲液。4h后，处理中加2.5ml灭菌蒸馏水，对照中加2.5ml脲。然后用30ml酸化的2M氯化钾提取。悬浮液在旋转摇床20℃，200rpm振荡30min。9464×g离心5min，取1ml上清夜与9ml 蒸馏水、5ml水杨酸钠（sodium salicylate）/ 氢氧化钠溶液和2ml dichloroisocyanuric acid(Na+盐)混允，20±2℃静置1h，在690nm波长下测定溶液的颜色强度。对于中性土壤用用蒸馏水取代硼酸缓冲液。标准曲线用氯化铵标准溶液制作，浓度范围0-2.5ug/ml。 脱氢酶（Dehydrogenase）： INT（2(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride）还原酶活性（既脱氢酶活性）采用Von Mersi 和Schinner（1991）的方法测定。1g鲜土置于带盖的玻璃瓶中，加入1.5ml 1M Tris缓冲液（pH 7.0）和2ml INT（5mg/ml，溶于2%体积比的二甲替甲酰胺（N，N-dimethylformamide）中）。对照土壤加1.5ml Tris缓冲液和2ml蒸馏水。旋转摇床20℃，200rpm培养24h。然后，往样品中加2ml蒸馏水，而往对照土样中加2ml INT。然后加10ml N，N-dimethylformamide/ 甲醇（1：1，v/v）提取液终止反应，20℃，200rpm振荡1h。9464×g离心5min，464nm波长下测定上清夜的吸光值。对于中性土壤用蒸馏水取代Tris缓冲液。用INTF（iodonitrotetrazolium chloride）（Sigma）制作标准曲线，浓度范围0-27ug/ml提取液。 荧光素二乙酸酯水解（Fluorescein diacetate hydrolysis）： 称取3g鲜土，悬浮于50ml 磷酸盐缓冲液，加入250ul FDA（2mg/ml，溶于丙酮）。对照加250ul蒸馏水。土壤悬浮液在20℃，200rpm培养4h。培养结束后，样品中加250ul 蒸馏水，而对照中加250ul FDA。悬浮液涡旋振荡，取5ml置于含5ml丙酮的试管中以终
探究影响酶活性的因素 」、探究温度对酶活性的影响 （一）实验原理（注：市售a-淀粉酶的最适温度约60 0C）： 1 ?淀粉遇碘后，形成紫蓝色的复合物。 2 ?淀粉酶可以使淀粉逐步水解成麦芽糖和葡萄糖，麦芽糖和葡萄糖遇碘后不显色。 （二）方法步骤： 1、取3支试管，编上号（A、B、C）,然后分别注入2mL可溶性淀粉溶液； 2、另取3支试管，编上号（a、b、c）,然后分别注入1mL新鲜淀粉酶溶液； 3、将装有淀粉溶液和酶溶液的试管分成3组，A和a试管放入热水（约60°C）、B和b放 入沸水，C和c放入冰块中，维持各自的温度5min ； 思考题1、不能只用不同温度处理淀粉溶液或酶溶液，这是为什么 4、分别将淀粉酶溶液注入相同温度下的淀粉溶液中，摇匀后，维持各自的温度5min ； 5、在3支试管中各滴入1-2滴碘液，摇匀后观察这3支试管中溶液颜色变化并记录； 思考题2、在试管A、B、C中分别能观察到什么现象 思考题3、通过上述实验，你能得出什么结论 思考题4、在上述实验中，自变量是什么无关变量是什么 思考题5、探究温度对酶活性的影响实验中是否可以用斐林试剂来检验实验结果 为什么 二、探究PH值对酶活性的影响 （一）实验原理：思考题6、请依据下面所列实验操作步骤，写出该实验的实验原理。
思考题7、请在上表中填入你所观察到的实验现象。 思考题8、通过上述实验，你能得出什么结论 思考题9、在上述实验中，自变量是什么无关变量是什么 思考题10、在设计影响酶活性的条件”实验中最关键的一步是什么 1.（多选）在证明酶的催化作用受温度影响的实验时，有学生取两支试管分别将淀粉溶液与唾 液混合后，分别将试管放在冰水、沸水中5min后，待试管冷却后分别加入3滴碘液，结果两支试管都变蓝，证明酶的催化作用需要适宜的温度。此实验的不足之处是
实验报告-不同因素对酶的影响
成绩： 酶的基本性质实验一一底物专一性剂、激活剂和抑制、最适温度 实验名称: 实验类型： 分离鉴定实验 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤 五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析（必填） 七、讨论、心得 I .酶的基本性质——底物专一性 一、实验目的和要求 1. 了解酶的专一性。 2.掌握验证酶的专一性的基本原理及方法。 3.学会排除干扰因素，设计 酶学实验。二、实验基本原理 酶是一种具有催化功能的蛋白质。酶蛋白结构决定了酶的功能——酶的高效性，酶催化的 反应（酶促反应）要比相应的没有催化剂的反应快 103-1017倍。 酶催化作用的一个重要特 点是具有高度的底物专一性，即一种酶只能对某一种底物或一类底物起催化作用，对其他底物 无催化反应。根据各种酶对底物的选择程度不同，它们的专一性可以分为下列几种： 1. 相对专一性 一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应。 2. 绝对专一性： 有些酶对底物的要求非常严格只作用于一种底物，而不作用于任何其他 物质。如脲酶只能催化尿素进行水解而生成二氧化碳和氨。如麦芽糖酶只作用于麦芽糖而不作 用其它双糖，淀粉酶只作用于淀粉，而不作用于纤维素。 3.立体异构专一性 有些酶只有 作用于底物的立体异构物中的一种，而对另一种则全无作用。如酵母中的糖酶类只作用于 D-型 糖而不能作用于 L-型的糖。 本实验以唾液淀粉酶、蔗糖酶对淀粉、蔗糖水解反应的催化作 用来观察酶的专一性。采用 Benedict 试剂检测反应产物。 Ben edict 试剂是碱性硫酸铜溶液，具有一定的氧化能力，能与还原性糖的半缩醛羟基 发生氧化还原反应，生成砖红色氧化亚铜沉淀。 Na 2CO+ 2H 2O 2NaOH + fCO CuSO+ 2NaOH Cu （OH ） ■ 2 + Na z SO 还原糖（一CHO or — C=O ）+ 2Cu （OH ） 2 CU 2O （砖红色或黄色）+ 2H 2O +糖的氧化产物 在分子结构上，淀粉几乎没有，而蔗糖、棉子糖全无半俪基，它们均无还原性，因此它 们与Ben edict 试剂无呈色反应。 淀粉被淀粉酶水解，产物为葡萄糖；蔗糖和棉子糖被蔗糖 酶水解，其产物为果糖和葡萄糖，它们都为具有自由半缩醛羟基的还原糖，与 Ben edict 试剂共 热，即产生红棕色 Cu2 O 沉淀。本实验以此颜色反应观察淀粉酶、蔗糖酶对淀粉和蔗糖的水解作 用。三、实验材料与试剂 1、实验材料⑴ 蔗糖酶（样品W ）:⑵新鲜唾液（含唾液淀粉酶）；2、实验试剂⑴ 蔗糖酶液 沖门七穿实验报告 课 程名称：生物化学实验（甲） 专业： 姓名： 学号： 日期： 地点： 指导老师：
土壤纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法） 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与?3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可 用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L； 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至1L； 取11ml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml 水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，
影响淀粉酶酶活性的因素 一、目的 了解淀粉在水解过程中遇碘后溶液颜色的变化。观察温度、pH、激活剂与抑制剂对淀粉酶活性的影响。 二、原理 人唾液中淀粉酶为α—淀粉，在唾液腺细胞中合成。在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，经过一系列被称为糊精的中间产物，最后生成麦芽糖和葡萄糖。 淀粉→紫色糊精→红色糊精→麦芽糖、葡萄糖 淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分别呈蓝色、紫色与红色，麦芽糖、葡萄糖遇碘不变色。 唾液淀粉酶的最适温度为37－40℃，最适pH为6.8。偏离此最适环境时，酶的活性减弱。 低浓度的氯离子能增加淀粉酶的活性，是它的激活剂。铜离子等金属离子能降低该酶的活性，是它的抑制剂。 三、试剂和仪器 1．碘液：称取2g碘化钾溶于5ml蒸馏水中，再加1g碘。待碘完全溶解后，加蒸馏水295ml，混合均匀后贮存于棕色瓶内。 2．1％淀粉溶液：称取1克可溶性淀粉放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸1分钟，冷后再加蒸馏水定容至100ml。 3．0.4％的盐酸溶液 4．0.1％的乳酸溶液。 5．1％的碳酸钠溶液。 6．％的氯化钠溶液。 7．％的硫酸铜溶液。 8．仪器：试管试管架吸管玻璃棒白磁板烧杯漏斗恒温水浴量筒冰浴四、操作步骤 1．淀粉酶液的制备：实验者先用蒸馏水嗽口，然后含一口蒸馏水于口中，轻嗽一、二分钟，吐入小烧杯中，用脱脂棉过滤，除去稀释液中可能含有的食物残渣。最后将数人的稀释液混合在一起，再进行过滤，以避免个体差异。 2．pH对酶活性的影响 取4支试管，分别加入0.4%盐酸（pH＝1），0.1％乳酸（pH＝5），蒸馏水（pH＝7），与1％碳酸钠（pH＝9）各2毫升，再向以上四支试管中各加入2毫升淀粉溶液及淀粉酶液。混合摇匀后置于37℃水浴中保温。2分钟后，从蒸馏水试管中取出一滴溶液，置于白磁板上，用碘液检查淀粉的水解程度，待蒸馏水试管内的溶液遇碘不再变色后，取出所有的试管，各加碘液2滴，观察溶液颜色的变化。根据观察结果说明pH对酶活性的影响。 3．温度对酶活性的影响 取3支试管各加入3毫升2％淀粉溶液，另取三支试管，各加入1毫升淀粉酶液。将6支试管分为三组，每组中盛放淀粉溶液与淀粉酶液的试管各1支。三组试管分别置于0℃、37℃、70℃的水浴中，5分钟后将各组中的淀粉溶液到入淀粉酶液中，继续保温。2分钟后从37℃试管中取出一滴溶液，置于白磁板上，用碘液检查淀粉的水解程度，待37℃试管内的溶液遇碘不再变色后，取出所有的试管，各加碘液2滴，观察溶液颜色的变化。根据观察结果说明温度对酶活性的影响。 4．激活剂与抑制剂对酶活性的影响
土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。
2.1土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。 磷酸苯二钠比色法 1.试剂配制 （1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。 （2）pH5醋酸盐缓冲液。 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0） A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL） B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL） 14.8ml A + 35.2ml B混合即得 （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 （5）甲苯。 （6）0.3%硫酸铝溶液。 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。 2.操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。 3.结果计算 磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚（mg）=a*8 式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数 8—换算成1g 土的系数 1 / 1
探究温度对酶活性影响的实验设计 龙岩长汀一中曾宪琰 1 实验设计理念 由于在第一课时学生已经学习了酶的发现和酶的概念以及酶的特性，在此基础上，教 师引导学生设计实验，提出预期，让学生分组进行实验探究，观察思考，进行讨论，由学生 自己总结出结论。这样的实验设计能体现学生自主、探究、合作的学习方式，有利于培养学生科学的思维方法和研究方法，提高学生的实验设计探究能力和科学素养。 2 实验目标 2.1 知识目标理解温度对酶影响的实质。 2.2 能力目标①通过探究温度对酶活性影响的因素，发展学生的科学探究能力；② 培养学生观察、分析问题，解决问题的能力；③培养学生实验操作能力；④提高学生收集资 料和语言表达能力。 2.3 情感目标①通过探究温度对酶活性影响的因素，培养学生的探索精神、创新精 神和合作精神；②培养学生实事求是和严谨的科学态度；③激发学生对生物科学的兴趣和热爱，培养学生理论联系实际。 3 课前准备 3.1 实验材料用具的准备①质量分数为2%的新配制的淀粉酶溶液；②质量分数为3%的可容性淀粉溶液；③热水，蒸馏水，冰块，碘液，菲林试剂。④试管，量筒，大烧杯，小 烧杯，滴管，试管架，酒精灯，三脚架，石棉网，温度计，火柴。 3.2 寻找资料请同学上网或上图书馆找资料，内容为：除温度外还有哪些条件影响 酶的活性？酶与社会的联系，酶与人类生活的关系，酶的活性与动物体内环境的相对稳定有 什么关系。 4 实验过程 4.1 设置探究情景，提出探究课题教师设置探究情景：生活中的加酶洗衣粉的包装 袋上，往往注明这种洗衣粉的适用温度范围，从而联想温度是否影响酶的活性，提出探究课题：设计一个探究温度影响淀粉酶活性的实验。 4.2 介绍科学探究的方法，引导学生设计探究实验方案因为我校学生的实验动手能 力差，平时课上又很少进行探究实验，所以教师明确地把科学探究的步骤告诉学生：提出问题→作出假设→设计实验→实验探究→阐述和交流实验结果与结论。有利于学生按照正确的 研究的思路去分析和解决问题，使学生更好地学习科学方法。教师引导学生根据课题进行思
土壤酶活性测定方法 一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法 1. 试剂配制 （1）2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。 （2）3，5-二硝基水杨酸溶液1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超 过7天）。 （3）1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g N a2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中。 （4）1/15M 磷酸二氢钾1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。 （5）pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) （6）8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。 （7）甲苯。 （8）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL：取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄 糖母液（10mg还原糖/ml）。取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准 葡萄糖液（1mg/ml）； 2. 操作步骤 （1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL。加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，6000rpm离心10min。取1.0mL上清液（新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL；风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL）于50mL比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。 为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。 3．结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖（mg）=(a-b)×c 式中 a---从标准曲线查得的样品（加了基质）对应的葡萄糖浓度，mg/mL； b---从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度，mg/mL； c---换算成1g土的系数。 二、脲酶: 靛酚比色法 1. 试剂配制 （1）pH6.7柠檬酸盐缓冲液1L：取184g柠檬酸溶于300mL蒸馏水中，另取147.5g KOH溶于水，再将两种溶液合并，用1N NaOH将pH调至6.7，并用水稀至1L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，然后用乙醇稀释至100mL(A液)，保存在冰箱中。称取27g NaOH溶于100mL 水中（B液），保存在冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混合，并用蒸馏 水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液100mL：取10%的次氯酸钠溶液9mL，用水稀释定容于100mL 容量瓶中，即活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 （4）10%尿素溶液500mL：取50g尿素，用水稀释至500mL。 （5）甲苯。
土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法 （一）方法原理 本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。 （二）试剂 1）1%精胶 2）甲苯 3）铜-磷酸盐溶液：① 27.3g CuCl2·H2O溶于1 L水；②64.5g Na2HPO4·12H2O 溶于500mL 水，加入7.2g NaOH，稀释至1L；③57.21g Na2B4O7溶于1.5L 水，加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L，使用按照1：2：2的体积分数前将上述①、②、③混合。 4）甘氨酸标准溶液的配制：取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至1 L （1mL含50μg NH3-N）。 （三）操作步骤 （1）标准曲线绘制 取0、5、10、15、20 mL 甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20 mL，然后加入20 mL 新配制的铜-磷酸盐溶液。显色后，用分光光度计在650nm处测定，绘制标准曲线。 （2）土壤蛋白酶活性测定 称取5g土壤置于100mL 三角瓶中，加入甲苯2mL ，放置15 min，加入20mL 1%精胶溶液，于37℃恒温培养24h，于此同时，以水代替基质作为对照。 培养结束后，将悬液过滤，取10mL 滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mL。显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NH3-N含量。 以每克土壤在37℃下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（μg）表示蛋白酶活性。
土壤蔗糖酶测定方法：3,5- 二硝基水杨酸比色法 分析意义：对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。 （一）方法原理 蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 （二）试剂 1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876gNa2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯 2）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 3） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（保存期不过7天） （三）测定步骤 （1）标准曲线绘制 分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。（2）土壤蔗糖酶测定 称取5 g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5mlpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3mlDNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。 溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色。 为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。 （3）结果计算