浅谈蛋白质质谱分析方法及应用
董义龙
(单位：毕节学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:06320904031）
摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综
述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式
和应用，并对其发展前景着出展望。
关键词：蛋白质质谱分析原理与方法
蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上。作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行，调节代谢，抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。
1 蛋白质组学研究的背景和意义
1．1蛋白质组学的产生
20世纪90年代开始的人类基因组计划(}Iuman Genome Project，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。后因组时代中功能基因组(Functional Genomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。它摒弃经典分子生物学零敲碎打地研究个别基因的习惯，力求从细胞水平上解决基因组问题以建立对生命现象的整体认识。但是，生命现象的主要体现者是蛋白质，而蛋白质有其自身的特定活规律仅仅从基因的角度来研究是远远不够的l 31。因此，产生了一门在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质组学(Proteomics)。
1．2蛋白质组学的概念
“蛋白质组”是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams等于1994年在意大利一次学术会议上首次提出的，最早见诸于文献是在1995年7月的(Electrophoresisj)杂志上【41指的是基因组编码的全部蛋白质。』4一义上来讲，蛋白质组(proteome)是指：“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。蛋白质组是一个动态的概念，它是对应于一个基因组的所以蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。它不仅在同一个机体的不同组织和细胞表
达情况不同，在同一机体的不同发育阶段、直至消亡的全过程中也不断变化；机体处于不同生状态下不同，在不同外界环境下也是不同的。实际上每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体不同时间和空间出现并发挥功能的不同组合的结果。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。这一术语一经提出，很快得到国际生物学界的广泛关注。第～次国际性的“蛋白质组学”会议于1997年召开，同年出版了第
一部蛋白质组学专著。2000年三月首次发表了一个生物体的完整蛋白质组。2001年二月和同年六月分别公布了人类基因组框架图和序列图谱，极大地促进了蛋白质组学的兴起，成为后基因组计划的重要组成部分。
1．3蛋白质组学研究的主要手段
蛋白质组研究包括对蛋白质的表达模式的研究和对蛋白质功能模式研究的两个方面。它核心实验工具是双向凝胶电泳和以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学。蛋白质组分析首先要求分离亚细胞结构、细胞或组织等不同生命结构层次的蛋白质，目前一般采用1975年由‘Farrell 等创立的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术pJ。双向电泳图谱通过扫描仪扫描并数字化通过分析软件(如PDQUEST)可对数字化的图谱进行各种图像分析，包括分析蛋白质在图谱上的定位，分离蛋白质的计数，图谱间蛋白质差异表达的检测等。对分离出的蛋白质进行鉴定是蛋白质表达模式的又一重要内容。为适应大规模蛋白质组分析，质谱已成为蛋白质鉴定的核心技术。除此之外，还有Edman降解法测N端序列，氨基酸组成分析等。由这些技术测得的完整蛋白质分子量、蛋白质的肽指纹图谱以及部分肽序列等数据，通过相应的数据库的搜寻来鉴定蛋白质。生物信息学是蛋白质组学中的一个重要的技术平台，它研究生物信息的采集、加工、分析、存储和传播等各个方面，它通过综合应用数学、计算机科学、工程科学以及生物学的技术、方法分析大量而复杂的生物学数据来揭示生物学的奥秘，是蛋白质组学中的不可或缺的一部分，其在蛋白质组学中的研究有两个重要应用：…是构建和分析双向凝胶电泳图谱，二是数据库的搜索与构建。
2质谱原理、发展及生物质谱技术
2．1质谱及质谱分析的基本原理
质谱技术具有较好的灵敏度、准确度，能准确测定蛋白质。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要的地位。[1,2]质谱有进样器、离子源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析系统等组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）等，各种质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的且准确快速的途径。目前，酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用已成为鉴定蛋白质的发展趋势。
1）质谱分析蛋白的原理：
质谱法分析蛋白的基本原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白。通常结合相应的处理及其他技术，能够比较准确、快速地鉴定蛋白质。
2）基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）
简而言之，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/ 电荷之比（M/Z）来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。基质辅助激光解吸附质谱技术（MALDI）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间（TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。
3）电喷雾电离质谱（ESI-MS）
电喷雾电离质谱（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细
管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。
电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液-质联用（LC-MS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。
4）快原子轰击质谱技术
快原子轰击质谱技术（FABMS）是一种软电离技术，是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特加适用于多肽和蛋白质等的分析研究。
FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMSMS串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息。
3质谱分析蛋白的方法
用于质谱分析蛋白质的方法主要有三种：肽质量指纹图谱法（PMF）、串联质谱法（CID）和梯形肽片段测序法（ladderpeptide sequencing）。
3.1肽质量指纹图谱（PMF）
肽质量指纹图谱（PMF）即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白质切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的相对分子质量，将所得的蛋白酶解肽段质量数在相应的数据库中检索，寻找相似肽指纹谱，从而绘制“肽图”。由此可见，分子质量的精确度是PMF的关键指标所在，但蛋白质的翻译后修饰可能使PMF的质量数与理论值不符，故这就需要与序列信息适当结合。
3.2串联质谱法（CID）
串联质谱法（CID）是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳定离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。串联质谱的肽序列图需要读出部分氨基酸序列与前后的离子质量和肽段母质量相结合，这种鉴定方法称为肽序列标签（PST）。
3.3梯形肽片段测序法（ladder peptide sequencing）
梯形肽片段测序法（ladder peptide sequencing），与Edman法有相似之处，是用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，产生包含仅异于1个氨基酸残基质量的系列肽，名为ladder，经质谱检测，由相邻肽峰的质量差而得知相应氨基酸残基。其中的问题是由于酶解速度不一，易受干扰。
4 蛋白质质谱分析法的研究进展
自约翰·芬恩和田中耕一发明了确认生物大分子结构的分析方法及其质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施，已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一。质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：灵敏度高，能为亚微克级试样提供信息；能最有效地与色谱联用；适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定；同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。
4.1 质谱分析方法与蛋白质分析的联系
蛋白质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，其复杂结构主要包括一级、二级、
三级或四级结构。目前蛋白质测定主要是指针对蛋白质一级结构包括分子量、肽链氨基酸（二级结构）及多肽或二硫键数目和位置（三级结构）作出量效关系确定。近年来，涌现出较为成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术，其主要有：（1）电喷雾电离质谱（Electrosprayioni-sation，ESI- MS）；（2）基质辅助激光解析电离质谱（Matrixas- sistedlaserdesorption/ionization，MALDI）；（3）快原子轰击质谱；（4）离子喷雾电离质谱；（5）大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前3种研究得最多，应用得也最广泛。现代研究结果发现，越来越多的小肽与蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷，如测序速度较慢、样品用量较大、对样品纯度要求很高、对于修饰氨基酸残基往往会错误识别而对N末端保护的肽链则无法测序。C末端化学降解测序法则由于无法找到异硫氰酸苯酯（PITC）这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。由于蛋白降解为多肽技术的提升以及质谱测定的飞速发展，使得质谱广泛应用于蛋白质的分析和测定。近年来随着ESI- MS及MALDI等质谱软电离技术的发展与完善，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100 kDa，使蛋白质分子测定成为可能。目前基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱法（MALDI- TOF/MS）已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一。目前蛋白质组研究为蛋白质提供了一级结构（序列）谱库，能为解析FAST（超高速）谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据。
5 蛋白质质谱分析的应用
有研究表明，用MALDI- TOF质谱分析蛋白质最早一例是于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF上测出质量数高达60 kDa的蛋白质，精确度开始只有0.5％，后改进到0.1％～0.2％。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究，3条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。MALDI- TOF/MS以及ESI- MS可以清楚地解析蛋白质多肽的一级结构。近年来，FABMS- MS发展突飞猛进，推动了蛋白质多肽二级结构的测定，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高。其主要是通过MS- MS的方式将2个以上质谱仪器进行联合运用，采用前质谱选择特定肽段，破坏后进行后续质谱的分析，可以有效实现二级质谱对蛋白质的分析。大规模数据库和一些分析软件（如SEQUEST）的应用使得FABMS- MS可以进行更大规模的测序工作，如采用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出1 484种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分，并利用质谱鉴定磷酸化蛋白及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白（SDNP）的分子结构
等。科学工作者通过多种方式收集蛋白质的结构信息将其绘制成为肽质量指纹图谱，可以有效地分析蛋白性质，为医学、生命科学提供信息支持。如目前通过分离手段以及质谱联合手段发现的组织蛋白酶B、热急蛋白27、mRNA连接蛋白P62等对癌症治疗起到了非常重要作用。广泛地采用多种分离手段联合质谱对生物大分子进行全面的精确的分析取得了突出成效。如采用双向凝胶电泳- 质谱测定技术、液质联用（HPLC- MS）、气质联用（GC- MS）、ESI-MS测量法、FABMS- MS方法进行蛋白质分析；如采用HPLC-MS/MS对卵巢癌患者血液中的肿瘤标志蛋白质CA125进行测定具有治疗学价值。另外继人类基因组学（HGP）之后，目前又一个重大世界课题即蛋白质组学（Proteomictechniques）得到了人们广泛的关注，蛋白质组学广泛地应用于医学和生命科学领域。我国目前开展了“人类肝脏蛋白质组学及毒理学研究”，其中测定蛋白质主要手段中以质谱居于首位，其次为凝胶图像分析、蛋白质和多肽的N端、C端测序及氨基酸组成分析等，由此可看出质谱分析在蛋白质组学的定量以及结构和指纹鉴定中有着了无可取代的地位。在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性对测定结果有很大影响，因此质谱测序现在仍很
难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。笔者相信，随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电
泳的应用以及质谱技术的不断完善，质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。但也要清醒地认识到，质谱的灵敏度虽然高，但仍然难解决细胞组织痕量调控蛋白游离显示的问题，此外质谱的发展导致质谱仪价格非常昂贵。所以，需要积极地解决质谱自身发展的关键技术，才能使质谱在蛋白质分析中的作用更加的优化和凸显。化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：首先实现蛋白降解成多肽，通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（m/z值）的多肽离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的m/z值，分析鉴定未知蛋白质。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而备受科学家的广泛注意。
5.1傅立叶变换-离子回旋共振质谱法在蛋白质分析中的应用
传统上, 蛋白质的鉴定是从头测序,多数是自动的逐步的化学降解(Edman 降解)蛋白质,然后分离多肽片段。这些局部顺序依靠重叠的片段拼装组合出整个蛋白质的顺序,但是更多的用于探针从基因库分离出编码该蛋白的基因。随着序列数据库的增大,很明显,即使相对较短或不完善的序列(缺口,模糊的残基)对蛋白质的鉴定都是很有用的。当意识到质谱能比较理想的产生期望的数据时, 用从蛋白质或多肽提取的信息和序列数据库相关联的方法, 而不是从头测序进行蛋白质鉴定的观念已经逐渐地深入心
5.2准确质量测定对蛋白质结构分析的应用价值
氨基酸顺序测定的第一步就是蛋白质分子量的确定,这能为测定蛋白质分子中多肽链的数目和用质谱方法测定各个肽段的氨基酸顺序提供最基础的数据。质量准确性的提高不仅能提高数据库搜索的速度, 还能大大提高鉴定的可信度。用丰度为99%的13C标记物培养基培养细菌, 使磷脂中的12C被13C所取代,一旦C原子数已知,有n个碳原子质量数就会增加n,比较分别用ESI? FT? ICRMS 和(CID) FT? ICRMS测得的天然和99%丰度的13C 标记物培养基中磷脂的谱图, 准确质量测定使其元素组成为唯一的可能。Demirev 等组合使用完整蛋白质的准确质量测定和蛋白组数据库, 显著提高了鉴定微生物的特异性。He 等最近组合使用了高的磁场(9.4 T ),大的Penning阱的直径(101.6mm )及低的离子浓度, 用L2ESI? FT? ICRMS 检测两种肽时质量分辨能力很高,这有可能成为蛋白组学研究的新突破点。ESI? FT? ICRMS 的准确质量测定还能可信的证实不确定的离子组成。
5.3蛋白质分子中氨基酸序列的测定
蛋白质一级结构测定的一个最灵敏和最普遍的方式就是先用二维聚乙酰胺凝胶电泳分离蛋白质混合物, 以胰蛋白酶消解, 质量分析(分辨和分离一个特别的肽段)并最终用质谱方法产生一个至少是部分的氨基酸一级结构。肽质量图谱(Peptidemassmapping)是蛋白质一级结构测定一种最常用的手段。肽质量图谱是基于序列特异性蛋白酶水解蛋白质衍生出来的肽的一个基团的准确质量的测定, 是蛋白质鉴定的一个高效的方法。不同氨基酸序列的蛋白质用序列特异性的蛋白酶水解后将会产生一系列该蛋白独特的质量指纹。因此,如果用选择好的质量数(观察到的肽质量指纹)在一个包含有该特异蛋白的序列数据库中搜索, 该蛋白就能依赖这个数据库正确的鉴定了。采用纳流量液相色谱与傅立叶变换2离子回旋共振质谱联用, 提供了一系列的胰蛋白酶消解后的母离子和子离子的质量, 质量的准确性达到了10-6数量级,从而进一步确证了人肝的三种二乙酰基还原酶。另外采用n2ESI? FT?ICRMS在pmol 数量级的灵敏度上获得了蛋白质消解物的准确的质量指纹图谱,缩小了数据库的搜索范围并降低了搜索的噪声,测得了该种乙醛氧化酶的序列。应用ESI? FT? ICRMS 和红外多光子解离( IR multiphoton dissociation,IRMPD )可对一
种糖激酶进行分子量和肽的一级结构的精确测定。
6 高效液相色谱电喷雾质谱法用于茶多糖蛋白的纯度和相对分子质量的测定
1）凝胶法：分别将已知的蓝色葡聚糖、葡聚糖- 系列标准品（-. ，-. ，-. ）溶解于蒸馏水中，质量浓度为G E 6。上9#@0’4#$ A 凝胶柱，以1D* E 6 F’7* 洗脱，流速16 E 13(，自动收集仪每13( 收集管洗出液，并逐管检测（于(1 检测多糖的蒽酮.硫酸衍生物），分别得到柱外体积（死体积）（用蓝色葡聚糖测得）和标样洗脱体积#（用-. 测得）、#（用-. 测得）、#（用-. 测得）。以# E 为纵坐标，*DG &为横坐标作图，得&标准曲线方程：# E ,? *DG &然后以相同的条件将样品上柱，得到-A7，代入公式（中，求其&。
2）5/67.89:.;9 法：干燥气体流速6 E 13(，干燥气体温度J，雾化器压力K/’（@C3），毛细管电压=，质谱扫描范围。
7 液相色谱一质谱法比较分析正常人与胃癌患者的胃组织蛋白质
7.1样品的制备
样品为胃癌患者的胃组织，其中包含该患者正常的胃组织及癌症组织(术后病理学诊断为胃癌，病理分型均为低分化腺癌)。取材癌组织侵及胃壁全层，取癌组织中央坚硬部位(要求全层)，手术中无菌清理后，置于一80℃低温冰箱中保存待检。将正常胃组织与胃癌组织分别置于表面皿中并在冰上剪碎，用含0．0596吐温一20的pH 7．4的0．01moL／L磷酸盐缓冲溶液(PBS)反复清洗直至清洗液为无色以去除残余的血液，以含1 mmol／L蛋白酶抑制剂的8 mol／L尿素溶液为蛋白质提取液进行冰上匀浆，然后在功率为85 W时，工作10 S，停止10 S，循环超声5次条件下提取蛋白质。提取液于4℃、16 000 r／min下离心30 min，取蛋白质溶液上清液，采用考马斯亮蓝(BRADFORD)法测定蛋白质浓度。蛋白质提取液经反相液相色谱分离，收集差异馏分并旋转蒸发浓缩至干，然后重新溶解于50 mmol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris)一HCI(pH 8．3)中，按m(提取蛋白质)：m(胰蛋白酶)=50：1的比例加入胰蛋白酶，其中提取蛋白质质量由考马斯亮蓝法测定得到。于37℃摇床上反应24 h，然后加1“L甲酸进行酸化终止反应，置于一20℃冰箱中保存备用。
7.2 RP-LC分离蛋白质提取液的条件
预柱：自填装的C8反相硅胶柱(40 mm×0．5mm，XBP填料，5 ttm，孔径20 nm，天津博纳司)；分析柱：反相有机聚合物色谱柱(250 mm×4．6 mm，5仙m，深圳纳微公司)。流动相A 为含有0．1％三氟乙酸(TFA)的水溶液，流动相B为含有0．196 TFA的乙腈溶液，流速为0．5 mL／min；梯度洗脱程序：O一10 min，296 B一10％B；10—20 min，10％B一35％B；20—55 min，35％B一50％B；55—80 min，50％B一80％B，保持20 min。上样量：80斗g正常部分和癌症部分提取蛋白质。检测波长为214 nm。7.3 LC-MS／MS鉴定蛋白质提取物中差异蛋白质的条件
LC条件：色谱柱为实验室自填充的C18反相微柱(5 cm x300 ttm，5灿m，孔径为20 rim，天津博纳公司的填料)。流动相A为含2％乙腈和0．1％甲酸的水溶液，流动相B为含2％水和0．1％甲酸的乙腈溶液，流速5 ttL／min；梯度洗脱程序：0—8min，O％B一10％B；8—20 min，10％B一40％B；20．1 min，80％B，保持10 min。
质谱条件：采集时间30 min；扫描范围m／z 400—2 000；喷雾电压2．0 kV；加热毛细管温度150℃；归一化碰撞能量设置为35％；在一级质谱扫描中选取信号最强的2个母离子进行串联质谱分析，其中动态排除重复2次，每次180 s，重复容忍时间30 8。
7.3 蛋白质检索
采用BioWorks软件通过Sequest算法检索数据库，数据库为安装Bioworks软件时自带的数
据库。搜索结果按照如下参数筛选：当单电荷肽段的相似度指标五。值≥1．9；双电荷肽段的墨。。值≥2．2；三电荷肽段的墨。值≥3．75，并且当排名第一和第二肽段五。值的相对差值大于0．08时，认为检索结果为阳性。
8 结果与讨论
8．1 HPLC分离胃组织蛋白质提取物
在相同的色谱条件下对人的正常胃组织和胃组织的蛋白质提取物进行分离，所得的谱图如图1所示。图l显示通过匀浆超声可以从胃组织中提取出大量的蛋白质。图l还显示了正常胃组织和胃癌组织的蛋白质组分在保留时间上的差异。分别收集保留时间为27～29 min。45—47 min，86～88 rain馏分，并分别用胰蛋白酶酶解，然后进行LC-MS／MS鉴定。
8．2差异蛋白质的LC·MS／MS鉴定
收集差异最明显的一个时间段(保留时间为45—47 min)的馏分，并经胰蛋白酶酶解，按照1．4节描述的条件进行LC-MS／MS鉴定。对正常胃组织及胃癌组织的蛋白质提取物色谱分离后收集的馏分分别作两次重复分析，其分析谱图如图2(正常组织)及图3(癌症组织)所示。对分析结果进行数据库检索，以两次分析均鉴定出的蛋白质作为鉴定结果，列于表1。裹1 胃癌组织及正常胃组织差异部分共有及特异性蛋白质鉴定信息Table I Identified common proteins udspecific proteinsin differential components of huron stomachtumor tissue and normal tissueNumber gi Number‘pl of protein Mr of protein ScoreSpecific proteins in tumor tissue
l 4507359 8．56 22476．6 70．2
2 5030431 4．82 41563．2 26．5
3 1766170
4 5．46 33923．0 lO．2
4 12314197 6．49 38659．8 lO．1
5 1702847l 5．30 183060．7 10．1
6 38016180 5．54 65767．8 lO．1
7 1255659 6．19 255799．6 lO．1
8 14249342 5．34 55391．2 10．1
9 29648324 5．48 101956．3 8．6
10 29729554 4．7l 154788．9 8．6
1l 6321891 6．1l 433177．8 8．2
12 385766 4．56 1839．1 8．2
13 18027762 6．06 66322．7 8．2
14 37541779 9．02 56314．3 6．6
15 34878777 5．73 113662．7 6．2
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[10] 质谱分析蛋白的原理与方法浅述
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
浅谈蛋白质质谱分析方法及应用 董义龙 (单位：毕节学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:06320904031） 摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综 述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式 和应用，并对其发展前景着出展望。 关键词：蛋白质质谱分析原理与方法 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上。作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行，调节代谢，抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。 1 蛋白质组学研究的背景和意义 1．1蛋白质组学的产生 20世纪90年代开始的人类基因组计划(}Iuman Genome Project，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。后因组时代中功能基因组(Functional Genomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。它摒弃经典分子生物学零敲碎打地研究个别基因的习惯，力求从细胞水平上解决基因组问题以建立对生命现象的整体认识。但是，生命现象的主要体现者是蛋白质，而蛋白质有其自身的特定活规律仅仅从基因的角度来研究是远远不够的l 31。因此，产生了一门在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质组学(Proteomics)。 1．2蛋白质组学的概念 “蛋白质组”是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams等于1994年在意大利一次学术会议上首次提出的，最早见诸于文献是在1995年7月的(Electrophoresisj)杂志上【41指的是基因组编码的全部蛋白质。』4一义上来讲，蛋白质组(proteome)是指：“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。蛋白质组是一个动态的概念，它是对应于一个基因组的所以蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。它不仅在同一个机体的不同组织和细胞表 达情况不同，在同一机体的不同发育阶段、直至消亡的全过程中也不断变化；机体处于不同生状态下不同，在不同外界环境下也是不同的。实际上每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体不同时间和空间出现并发挥功能的不同组合的结果。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。这一术语一经提出，很快得到国际生物学界的广泛关注。第～次国际性的“蛋白质组学”会议于1997年召开，同年出版了第
广州辉骏生物科技有限公司 蛋白质质谱鉴定 一、技术概述 质谱是将待测物质变为气态离子并将离子按质荷比（m/z）进行分离，检测各种离子谱峰的强度而实现分析的一种方法。 蛋白质定性通常采用质谱分析结合数据库检索的方法，所分析的样本可以是蛋白质溶液、蛋白质胶条或胶点。 简单蛋白样本，例如双向电泳斑点或纯化蛋白，通常采用MALDI-TOF/TOF质谱（MS/MS）进行分析。 混合蛋白样本，例如蛋白溶液，或SDS-PAGE条带，通常采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术进行分析。应用领域有：亚细胞组分的全谱分析，IP、co-IP、Pull-down后的互作蛋白鉴定，或其他中等复杂蛋白样本的鉴定。 二、技术原理 串联质谱（MS/MS）检测蛋白的原理是：蛋白先经胰酶消化成肽段，肽段在质谱仪中离子化后，会带上一定量的电荷，通过检测器分析，可得到各肽段的质荷比（m/z），从而得知各肽段的相对分子质量。为获得肽段的序列信息，质谱仪会选取某些肽段进行破碎，再次分析，获得二级质谱。用检索软件选择相应的数据库对质谱数据进行分析，同时以打分的形式评判鉴定结果，当打分大于某个阈值时，即判定质谱鉴定成功，反之则鉴定失败。 LC-MS/MS方法是将蛋白酶切消化为肽段混合物，之后这些肽段先经高效液相色谱分离形成简单的组分，再进行串联质谱（MS/MS）分析；因此适合于混合蛋白样本的鉴定。 三、技术优势 1. 采用高效液相色谱和质谱联用的分析方法，可以一次性鉴定成百上千种蛋白质。 2. 鉴定准确性和灵敏度高。 四、技术流程 蛋白样本制备——蛋白酶解——串联质谱分析（或LC-MS/MS分析）——数据库检索——蛋白质鉴定结果
蛋白质质谱分析研究进展作者：汪福源蛋白质质谱分析研究进展摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用，并对其发展前景作出展望。关键词：蛋白质，质谱分析，应用前言：蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。1．质谱分析的特点质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。2．质谱分析的方法近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。3．蛋白质的质谱分析蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。3.1蛋白质的质谱分析原理以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。3.2蛋白质和肽的序列分析现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI
质谱分析蛋白的原理与方法浅述 摘要：随着质谱技术的不断发展与成熟，利用质谱法进行蛋白质分析愈来愈广泛和深入。本文简要阐述蛋白质质谱分析的原理和方法。 关键字：蛋白质质谱分析原理与方法 概述 质谱技术具有较好的灵敏度、准确度，能准确测定蛋白质。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要的地位。[]质谱有进样器、离子源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析系统等组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解读电离飞行时间质谱（）和电喷雾电离质谱（）等，各种质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的且准确快速的途径。目前，酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用已成为鉴定蛋白质的发展趋势。 质谱分析蛋白的原理： 质谱法分析蛋白的基本原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的值，分析鉴定未知蛋白。通常结合相应的处理及其他技术，能够比较准确、快速地鉴定蛋白质。 基质辅助激光解读电离飞行时间质谱（） 简而言之，基质辅助激光解读电离飞行时间质谱是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量电荷之比（）来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。基质辅助激光解吸附质谱技术（）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。产生的离子常用飞行时间（）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。[] 电喷雾电离质谱（） 电喷雾电离质谱（）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。 电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液质联用（）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。
蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子,存在于所有生物细胞,约占细胞干重质量的50%以上。随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃，最富生命力的前沿研究领域之一。本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式和应用，并对其发展前景作出展望。 1 质谱分析的特点与方法 1.1 质谱分析具有很高的灵敏度，能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 1.2 质谱分析的方法质谱分析的软电离技术主要有下列几种：（1）电喷雾电离质谱；（2）基质辅助激光解吸电离质谱；（3）快原子轰击质谱；（4）离子喷雾电离质谱；（5）大气压电离质谱。以前三种近年来研究最多，应用也最广泛。 2 蛋白质的质谱分析 2.1 蛋白质的质谱分析原理原理是通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z值）的蛋白质离子分开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 2.2 蛋白质和肽的序列分析现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman 法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白质容易很多。近年来随着电喷雾电离质谱（ESI）及基质辅助激光解吸质谱（MALDI）等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da,目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI TOP MS）已成为测定生物大分子尤其是蛋白质．多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质研究所必不可缺的关键技术之一，目前在欧洲分子生物实验室（EMBL）及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDI TOP MS 蛋白质一级结构（序列）谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据。 2.3 蛋白质谱分析方式 a.蛋白图谱，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获得待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。b.利用待测分于在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相序的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂。C.与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N 端或C端逐一解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸。（1）蛋白消化：蛋白的基因越大，质谱检测的准确率越低。因此。在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶，它于蛋白的赖氨酸和精氨酸处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。 （2）基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法（MALDI TOP MS）：简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行发挥，样品然后置于激光离子发生器。激光作用于样品混合物，使化学基质洗手光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷。这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质谱分析仪。最后，由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽质量/电荷比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白，此法成为多肽质量
基于质谱分析的蛋白质组学 在21世纪，生命科学的研究进入了后基因组时代，蛋白质组学作为其中的一个重要分支于20世纪90年代中期应运而生。由于蛋白质的复杂性，传统的蛋白质鉴定方法如末端测序等已无法满足蛋白质组学研究中的一系列需要。因此，质谱技术作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟，并作为样品制备和数据分析的信息学工具被广泛地应用。质谱技术具有灵敏度、准确度、自动化程度高的优点，能准确测量肽和蛋白质的相对分子质量，氨基酸序列及翻译后修饰、蛋白质间相互作用的检测[1]，因此质谱分析无可争议地成为蛋白质组学研究的必然选择。 1. 蛋白质组学 蛋白质组学（proteomics ）是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学时代一门新的科学。包括鉴定蛋白质的表达、修饰形式、结构、功能和相互作用等。根据研究目的，蛋白质组学可以分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。表达蛋白质组学用于细胞内蛋白样品表达的定量研究。以绘制出蛋白复合物的结构或存在于一个特殊的细胞器中的蛋白为研究目的的蛋白质组学称为结构蛋白质组学，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白的表达对细胞的作用[2]。功能蛋白质组学以细胞内蛋白质的功能及蛋白质之间的相互作用为研究目的，通过对选定的蛋白质组进行研究和分析，能够提供有关蛋白质的磷酸化、糖基化等重要信息。 蛋白质组学研究的核心就是能够系地的鉴定一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质及蛋白质的性能。蛋白质组学的主要相关技术有双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、质谱分析等[2]。由于蛋白质的高度复杂性和大量低丰度蛋白质的存在，对分析技术提出了巨大挑战，生物质谱技术则是适应这一挑战的必然选择。 2. 生物质谱技术
蛋白质质谱分析的应用 蛋白质质谱分析技术可应用于蛋白质鉴定、蛋白质从头测序、蛋白质定量分析、蛋白质结构鉴定、蛋白基因组学等多个应有领域。 蛋白质鉴定 用质谱鉴定蛋白质主要有两种方法。肽质量指纹谱分析，通过输入蛋白水解肽的质量作为搜库参数对未知蛋白进行分析，数据库可以通过已知蛋白质建立。如果数据库中的蛋白质序列与实验值匹配的预测质量显著相关，则表明该蛋白质存在于原始样品中。因此，纯化步骤限制了肽质量指纹图谱方法的通量。肽质量指纹图谱可通过MS/MS实现。 质谱也是鉴定蛋白质翻译后修饰的优选方法，因为它比其他方法（例如基于抗体的方法）更具优势。 蛋白质从头测序 蛋白质从头测序质谱分析通常在不事先了解氨基酸序列的情况下进行，这是通过蛋白质的肽片段质量确定氨基酸的过程。研究证明从头测序可以成功地确认和扩展数据库搜索的结果。 由于从头测序是基于质量的，并且某些氨基酸具有相同的质量（例如亮氨酸和异亮氨酸），因此精确的手动测序可能很困难。于是在数据库搜索和从头测序之间使用序列同源搜索应用程序协同工作以解决这一固有限制变得非常必要。 如果数据库中已经记录了序列，那么数据库搜索的优点就是可以快速识别序列。数据库搜索的其他固有限制包括序列修改/突变（某些数据库搜索未充分考虑对“已记录”序列的更改，因此可能会丢失有价值的信息）、未知信息（如果未记录序列，则找不到），误报以及数据不完整或数据损坏。 蛋白质定量 用质谱法对蛋白质进行定量（定量蛋白质组学）有几种方法。比较常用的如，将稳定的（例如非放射性）碳（13C）或氮（15N）重同位素掺入一个样品中，另外一个样品则用相应的轻同位素（例如12C和14N）标记。分析前将两个样品混合，由于质量差异，可以区分衍生自不同样品的肽。它们的峰强度之比对应于肽（和蛋白质）的相对丰度比。同位素标记的最常用方法是SILAC（在细胞培养物中通过氨基酸稳定同位素标记）、胰蛋白酶催化的18O标记、ICAT（同位素编码的亲和标记）和iTRAQ（相对和绝对定量的等压标记）。可以在不标记样品的情况下进行“半定量”质谱分析。通常，需要通过MALDI分析（线性模式）完成。单个分子（通常是蛋白质）的峰强度或峰面积与样品中蛋白质的量相关，但是，单个信号取决于蛋白质的一级结构、样品的复杂程度以及仪器的设置。其他类型的“无标记”定量质谱分析使用分解的蛋白质的图谱计数（或肽计数）作为确定相对蛋白质量的手段。 蛋白质质谱分析还可应用于蛋白质结构鉴定、蛋白基因组学等。
中国科学: 化学 2014年第44卷第5期: 739~ 745 SCIENTIA SINICA Chimica https://www.doczj.com/doc/0814901894.html, https://www.doczj.com/doc/0814901894.html, 《中国科学》杂志社SCIENCE CHINA PRESS 评述质谱分析专刊 表达蛋白质质谱分析 刘晓慧①②, 殷薛飞②, 申华莉②, 陆豪杰①②, 杨芃原①②* ① 复旦大学化学系，上海 200032 ②复旦大学生物医学研究院，上海 200032 *通讯作者, E-mail: pyyang@https://www.doczj.com/doc/0814901894.html, 收稿日期: 2014-01-26; 接受日期: 2014-03-26; 网络版发表日期: 2014-04-11 doi: 10.1360/N032014-00008 摘要对基因编码的蛋白质进行系统分析可以为注释基因组信息和研究疾病发生机理提供参考. 质谱因其高通量、高灵敏度和高精度等特点成为蛋白质表达谱研究的核心技术. 过去10年，质谱技术的发展大大促进了蛋白质表达谱的研究. 本文综述了蛋白质表达谱的定性和定量研究进展，并展望了进一步的研究方向. 关键词 质谱 表达蛋白质谱定量蛋白质组 1 引言 人类基因组工作草图完成后[1, 2],估算基因组中约有20300个蛋白质编码基因[3]. 对蛋白质的鉴定工作主要依赖于对氨基酸序列的解析. 20世纪80年代开始, 随着电喷雾(ESI)和基质辅助激光解析(MALDI)等新“软电离”技术的出现, 质谱分子量分析范围达到几千, 并能提供丰富的结构信息, 开始广泛应用于生物大分子的研究[4]. 基因组学的研究进一步推动了质谱在蛋白质鉴定方面的应用, 其提供的蛋白编码基因组序列信息, 使得质谱检测到的多肽质荷比信息得以与基因编码的蛋白质序列进行比对, 实现了对蛋白质快速高效的鉴定. 质谱技术以其高通量、高灵敏度和高精度等特点成为蛋白质表达谱研究的核心技术. 质谱技术的发展也大大推动了蛋白质表达谱研究工作的进展. 然而基因组编码的蛋白质质谱研究仍然存在很大的挑战: 生物体蛋白质表达的时间空间分布不同; 表达丰度动态范围大, 约6~12个数量级[4, 5]; 基因转录过程中引起的可变剪切、基因多态性以及两百多种翻译后修饰的存在[6], 增加了蛋白质表达谱研究的复杂程度. 对蛋白质进行定性研究的同时进行定量研究, 对于阐述蛋白质的全局构成和调控规律具有重要意义. 2 蛋白质表达谱的定性研究研究策略 2.1 针对蛋白质表达时空不同分布的定性研究策略 蛋白质是生命活动的执行者, 细胞内不同的亚细胞器、生物体不同的组织器官其功能不相同, 蛋白质表达也有差异. 为了降低分析样品的复杂程度, 利用亚细胞器和组织间蛋白质表达的互补性, 科学家们从细胞水平和组织水平开展了蛋白质表达谱的研究. 2002年启动的人类肝脏蛋白质组计划(Human Liver Proteome, HLP), 中国的研究人员首次采用亚细胞器蛋白质组学策略对人类肝脏组织表达的蛋白质进行分析, 研究团队分别就细胞核、线粒体、胞浆、细胞质膜、内质网和高尔基体等细胞膜系统, 开发了一系列高效纯化和鉴定亚细胞器蛋白质的方法[7~10], 2010年公布了人类肝脏蛋白质组计划第一个数据集[11] (共计6788个蛋白质). 2012年通过分析三种不同组织来源的细胞系(肝癌细胞系、胃癌细胞系和结
蛋白质质谱分析研究进展 摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用，并对其发展前景作出展望。 关键词：蛋白质，质谱分析，应用 前言： 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。 自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。 1．质谱分析的特点 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 2．质谱分析的方法 近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。 3．蛋白质的质谱分析 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。 3.1蛋白质的质谱分析原理 以往质谱(ＭＳ)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的Ｍ/Ｚ值，分析鉴定未知蛋白质。 3.2蛋白质和肽的序列分析 现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括Ｎ末端序列测定的化学方法Edman法、Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的Ｎ末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对Ｎ末端保护的肽链则无法测序[4]。Ｃ末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，
蛋白质间的相互作用存在于生物体每个细胞的生命活动过程中，互交叉形成网络，成细胞中一系列重要生理活动的基础。其中，多数蛋白质是通过与配体分子结合或者是作为1个大的生物复合体的一部分，与细胞完整性维持、遗传物质复制、基因表达调控、信号转导、免疫应答等一系列生命过程。研究蛋白质间相互作用的方式和程度，将有助于蛋白质功能的分析、疾病致病机理的阐明和治疗和新型药物的开发等众多难题的解决。因此，确定蛋白质间相互作用关系、绘制相互作用图谱已成为蛋白质组学研究的热点。近年来有许多方法被用于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交技术，免疫共沉淀技术，串联亲和纯化技术，化学交联技术，蛋白质芯片技术，荧光共振能量转移技术，噬菌体展示技术等。 酵母双杂交技术 Fields和song等首先在研究真核基因转录调控中建立起来的，是在真核细胞中检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用的方法。该系统是通过两个分别称之为“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”的融合蛋白形成一个完整的转录激活因子，从而激活报告基因的表达，通过在营养缺陷型培养基上生长或呈现显色反应来检测系统的功能。酵母双杂交系统可在全基因组规模上进行蛋白质一蛋白质相互作用高通量的研究。 免疫共沉淀技术 免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 串联亲和纯化技术 串联亲和纯化(TAP)是一种能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术，经过两步特异性亲和纯化，可快速得到生理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用的蛋白质。该技术通过在靶蛋白质一端嵌入一个特殊的蛋白质标签(TAPtag)，不破坏靶蛋白质调控序列，且靶蛋白质表达量与体内水平相当；经过两步连续的亲和纯化获得接近自然条件的特定蛋白质复合体，后用质谱技术或Edman 降解法进行蛋白质鉴定。与传统的研究蛋白质相互作用的技术相比，TAP 技术具有周期短、假阳性结果少等优点。 化学交联技术 交联剂是能在线型分子间起架桥作用从而使多个线型分子相互键合交联成网络结构的物质。促进或调节聚合物分子链间共价键或离子键形成的物质。化学交联剂是能够和蛋白质反应的带有双功能团的化学试剂。通过功能团和氨基酸残基反应，偶联两个蛋白质或者更多的蛋白质形成网状交联。功能团决定了交联剂的反应特异性。化学交联试剂捕获感兴趣的发生了相互作用的蛋白质对，结合生物质谱的高解析能力，快速、高通量地获取蛋白质高级结构信息。
质谱分析在 蛋白质组学中的应用 （摘要 (2) 1、质谱 (2) 2、蛋白质组学 (2) 3、质谱分析在蛋白质组学中的应用 (4) 参考文献 (6) 附录1································ 8） 16120901（生技） 20092348 王德美
摘要： 蛋白质组是基因组研究的继续，以基质辅助激光解吸附飞行时间质谱和电喷雾质谱为代表的现代生物质谱技术，为蛋白质组的研究提供了必要的技术手段。主要通过获取蛋白质、多肽的分子量以及修饰片段的信息，研究蛋白—蛋白间相互作用、翻译后修饰乃至基因表达水平的变化等方面的情况，从而扩充和完善蛋白质组学的研究【1】。本文旨在收集整理相关信息，反映质谱技术在蛋白质组学中应用的发展现状，为相关人员提供初级资料。 1、质谱 质谱（Mass SPectrometry）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。质谱仪【2】是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。 1.1原理 质谱分析原理是通过进样使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散——离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。 1.2生物质谱仪器 长期以来，由于生物样品的非挥发性、热不稳定性以及分子量大等特征，质谱的应用仅局限于对小分子的分析。从上世纪八十年代起这一情况发生了戏剧性变化，基质辅助激光解吸附（MALDI）和电喷雾（ESI）技术【1】的发展促进了质谱仪器的巨大发展，新的质量分析器的研发和各种多级的复杂的仪器的设计和组合层出不穷。 1.2.1生物质谱仪器的组成与分类 用于生物领域的质谱仪通常包括三个部分【3】：离子源、质量分析器和检测器。质量分析器是质谱的核心元件，决定着生物质谱的灵敏度、分辨率、质量准确度和生成大量信息的碎片离子谱图的能力。目前在生物质谱领域有四种基本的质量分析器：飞行时间、四极杆、离子阱和傅利叶变换离子回旋共振、Orbitrap【4】，它们的设计和性能不尽相同，各有其优点和劣势。这些分析器可以独立使用，也可以串联使用以发挥各自的优点。 2、蛋白质组学 2.1背景 基因组研究自从开展以来已经取得了举世瞩目的成就【5】，大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。不仅如此, 在细胞合成蛋白质之后, 这些蛋白质往往还要经历翻译后复杂的加工修饰，基因组学远远无法解决这些问题，因此蛋白质组学(proteomics)应运而生【6】。蛋白质组(proteome)一词是马克.威尔金斯
蛋白质谱技术的发展及应用-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
质谱技术的发展及应用 2003年人类基因组精细图绘制完成，是人类科学史上一个里程碑式的事件。后基因组时代的研究重点自然落在了蛋白质头上。为啥？因为中心法则告诉我们，基因的产物——蛋白质，是生命活动的最终执行者。与基因组类比，研究生物体内全套蛋白质的科学，就是蛋白质组学。基因组计划完成的同年，人类蛋白质组计划启动，令人激动的是，2014年人类蛋白质组的草图也完成了。而蛋白质组学能够飞速发展的最大功臣非质谱莫属。质谱的应用范围非常广泛，但这里只讨论蛋白质组学中的质谱。 简单地说，质谱法（mass spectrometry）就是对肽段离子的重量（质荷比，m/z）进行测量的分析方法。样品经质谱仪（mass spectrometer）检测得到质谱图（mass spectrum），通过对质谱图的分析就可以对样品中的蛋白进行鉴定、定量。亲，图1的这种典型的蛋白质组学流程都很熟悉吧。蛋白首先都要被特异性的酶（通常为Trypsin）切割为肽段，再进行后续分析，这在蛋白质组学中被称为“自下而上”的研究策略（Bottom-up proteomics）。我们平时见到的质谱分析基本都是这种类型。提到蛋白质组，即会联想到一系列高大上的名词，iTRAQ、SWATH、SILAC、Shotgun、Label-free等等。很多概念容易弄混淆，下面我们就来理理清楚。 图1. 典型的蛋白质组学流程 大体上，质谱研究蛋白主要是鉴定和定量。通过二级质谱图（MS2或者MS/MS）进行数据库搜索匹配鉴定蛋白。通过各种标记或非标记的手段对不同样品中的蛋白进行比较就是定量。蛋白定量比较是质谱最重要的用途，图2是对定量方法的一个简单总结。非标定量（Label-free）不需要标记，不同样品分别处理、分别进质谱检测；优点是处理简单、无需标记、价格便宜、可以比较很多组样品，缺点是对操作步骤、LC、质谱稳定性要求严格。SILAC是在细胞培养基中加入稳定同位素标记的氨基酸，在代谢水平标记蛋白，一级质谱图进行定量，可以做到三组样品混合后进行比较，定量准确，但是不能标记组织样本，养细胞成本也较贵。双甲基化标记是通过化学反应的办法在肽段水平进行标记，一级质谱定量，也可以三组对比，标记试剂都比较便宜，而且可以标记任何来源的样品。iTRAQ和TMT是商品化的试剂盒，肽段水平标记，二级质谱定量；分别可以做到最多8组和10组样品间蛋白质组的比较。
蛋白质质谱分析的发展历史 质谱法是准确测定蛋白质质量和表征蛋白质的重要方法，根据各种用途，目前市场上已开发出了多种鉴定方法和鉴定仪器，可应用于包括鉴定蛋白质及其翻译后修饰、蛋白质复合物、它们的亚基和功能的相互作用，以及蛋白质组学中蛋白质的整体测量。质谱法也可用于定位各种细胞器中的蛋白质，并鉴定不同蛋白质之间以及膜脂之间的相互作用。 蛋白质质谱分析步骤图解（图片：百泰派克提供） 质谱法中用于蛋白质电离的两种主要方法是电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸/电离（MALDI）。这些电离技术需要与质谱分析仪（例如串联质谱）结合使用。通常，可以通过“自上而下”的方法完整地分析蛋白质或者先将蛋白质分解成片段然后“自下而上”地对蛋白质进行分析。有时分析较大的肽片段也可使用折中的“自中而下”的分析方法。 随着MALDI和ESI的发展，二十世纪八十年代，利用质谱进行蛋白质研究开始普及。这些电离技术在蛋白质表征中发挥了重要作用。基质辅助激光解吸电离（MALDI）是由Franz Hillenkamp和Michael Karas于80年代后期开发的。Hillenkamp，Karas和他们的研究人员通过将氨基酸丙氨酸与氨基酸色氨酸混合并用266 nm脉冲激光照射，使氨基酸丙氨酸离子化。尽管取得了一定进展，但直到1987年田中浩一（Koichi Tanaka）使用了“超细金属加液体基质法”，将大小为34,472 Da的蛋白质羧肽酶-A的生物分子离子化，电离技术才取得突破。 1968年，Malcolm Dole报告了电喷雾离子化法与质谱的首次联合使用。在MALDI普及的同一时期，电喷雾离子化法由开发者John Bennett Fenn公开。由于对生物大分子的鉴定和结构分析方法的研究做出的巨大贡献，John Fenn, 田中浩一及Kurt Wuthrich共同获得了2002年诺贝尔化学奖。这些电离方法极大地促进了用质谱法研究蛋白质的发展。也因为如此，蛋白质质谱在蛋白质表征中起着主导作用。 本文由百泰派克整理编辑。 百泰派克从事蛋白质理化性质分析及结构解析、以质谱技术为基础的蛋白质组学、代谢组学