人乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株的建立及特性
李文静1，张磊2，赖娅娜2，唐金海3，钟山亮1，恽文3，赵建华1(210009 江苏南京，南京医科大学附属省肿瘤医院临床检验中心1、科研科第三实验室2和普外科3)
[摘要] 目的建立人乳腺癌多西紫杉醇（Docetaxel，Doc）耐药细胞模型MCF-7/Doc，初步探讨其生物学特性。方法采用Doc低浓度逐步加量诱导法建立MCF-7/Doc耐药株；通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、MTT 法药物敏感试验及流式细胞术评价其生物学特性；实时荧光定量PCR和Western blot分别检测多药耐药基因MDR1 mRNA和蛋白的表达。结果经10个月的诱导成功建立MCF-7/Doc细胞株，可在100 ng/ml Doc培养液中稳定生长，耐药指数为亲代敏感细胞MCF-7/S的33.3倍，对其他多种化疗药物呈交叉耐药状态。光镜下，药物处理后细胞变圆变小、核分裂像减少；MCF-7/Doc倍增时间较MCF-7/S延长（41.6h vs 30.6h；P<0.01）。与亲代相比，耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、S期减少；MDR1基因表达水平增高90.7倍，蛋白表达转为阳性，而雌激素受体阳性表达丢失。结论MCF-7/Doc细胞具有典型的多药耐药性，MDR1基因和蛋白过表达是其获得性耐药的主要机制之一。
[关键词] 乳腺癌细胞；多西紫杉醇；多药耐药；P糖蛋白
[中图分类号] R737.9
乳腺癌属全身性疾病，综合治疗非常关键，其中化疗是不可替代的重要手段之一；然而多药耐药（multi-drug resistance, MDR）常导致治疗失败以及后期肿瘤的复发和转移，严重威胁患者生存。多西紫杉醇（Doc）是在天然抗肿瘤药物紫杉醇的基础上，经结构修饰后获得的一种新型抗肿瘤药物，溶解性好，药效更优。临床实践表明，以Doc为主的联合化疗是乳腺癌、尤其是淋巴结阳性患者最有希望的治疗方案[1]，但耐药问题也不容忽视，据报道其对转移性乳腺癌的治疗反应率为
[基金项目]江苏省社会发展科技计划项目（BS），国家自然科学基金资助项目（）
第一作者：李文静，女，硕士研究生，主要方向：临床检验诊断学，电话：，E-mail：
通讯作者：赵建华，女，硕士生导师，研究员，主要从事临床检验诊断学及肿瘤学研究：电话：, E-mail：
30-50%[2]。已知耐药细胞株是研究肿瘤MDR发生和逆转的重要模型，国内外报道现已建立多种乳腺癌耐药细胞株，但关于Doc乳腺癌耐药细胞株的建立国内还未见报道。为此，本文通过低剂量逐步加量法体外诱导建立人乳腺癌多西紫杉醇耐药株，并对其生物学及耐药特性进行了初步研究。
1 材料和方法
1.1 材料乳腺癌细胞株MCF-7/S为典型的雌激素受体（ER）阳性细胞株，分离自人乳腺腺癌组织上皮（上海细胞生物所）；Doc、顺铂和卡铂(齐鲁制药)，紫杉醇(太极制药)、多柔比星(海正药业)、吉西他滨(豪森药业)、他莫昔芬(扬子江药业)、甲氨蝶呤和依托泊苷(恒瑞医药)、羟喜树碱(李时珍药业)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma)；鼠抗人P-gp单克隆抗体(ABcam)；辣根过氧化物酶（HRP）标记抗小鼠IgG (康为生物) 、HRP标记抗兔IgG（博士德生物）。
1.2 细胞培养MCF-7/S细胞培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml 链霉素的DMEM高糖培养液, 在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，经2-3次传代后至指数生长期进行实验。
1.3 MCF-7/Doc的建立首先测定Doc对MCF-7/S的半数致死浓度(IC50)；以IC50的1/1000 Doc为起始浓度作用MCF-7/S细胞24h，生理盐水洗五遍，撤药常规培养并每天换液去除死细胞，约7-18天后存活细胞生长恢复，待进入对数生长期后传代1次，继续培养至生长良好且稳定时进行浓度逐步递增性诱导（梯度为10 ng/ml）；如此反复，历时10个月，直至细胞能在100 ng/ml Doc培养液中稳定地传代生长。双目倒置显微镜下观察各时段细胞的生长情况。
1.4 生长曲线测定将对数期MCF-7/S和MCF-7/Doc细胞经胰酶消化后制成2×104单细胞悬液，接种于24孔板，接种后第1～5天计数，每次计数3孔取平均值，绘制生长曲线。按Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间：T d=Tlg2/lg(N T/N0)，T d为倍增时间(h)，T为细胞数由N0增至N T所用的时间，N为细胞数。
1.5 细胞IC50及耐药指数RI的检测
1.5.1MCF-7对Doc的敏感性取1×105/ml MCF-7/S或MCF-7/Doc单细胞悬液，接种于96孔板，100μl/孔；培养24h后加入含相应浓度药物的培养液100μl/孔，每个药物浓度设4个复孔，同时设空白组和无药对照组；继续培养48 h，MTT法染色，CliniBio128 酶标仪检测550 nm处的吸光度（A）值，计算生长抑制率：生长抑制
率= 1-(实验组平均吸光值/对照组平均吸光值)×100%；根据生长抑制率计算IC50[3] 和RI ，RI= IC50（MCF-7/Doc）/ IC50（MCF-7/S）。独立重复3次。
1.5.2交叉耐药性按上述方法分别检测MCF-7/S和MCF-7/Doc细胞对常规化疗药物：紫杉醇、表柔比星、甲氨蝶呤、羟喜树碱、卡铂、顺铂、依托泊苷、吉西他滨及内分泌治疗药物他莫西芬的IC50，计算各RI。
1.6 细胞周期分布取对数期细胞消化制成单细胞悬液，1ml预冷70%酒精固定，-20℃过夜，PBS洗两次，碘化丙啶（PI）避光染30分钟，以流式细胞仪（美国BD FACSCalibur）于FLA-2参数下检测细胞周期，定量分析各时期的百分率及凋亡、坏死细胞的百分率。独立重复3次。
1.7 MDR1基因相对定量使用TRIZOL法，提取细胞总RNA，测A260/A280值（NanoDrop2000）并计算其纯度和RNA含量；按BU-Script RT KIT说明，逆转录合成cDNA。取2μl cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR；BIO-RAD iCycle扩增仪）。MDR1引物：上游GTTGCTGCTTACATTCAGGTTTC和下游ACCAGCCTATCTCCTGTCGC，Taqman探针：TTGGTGCCTGGCAGCTGGAAGAC；β-actin引物：上游ACCGAGCGCGGCTACAG和下游CTTAATGTCACGCAGATTTCC，探针：TTCACCACCACGGCCGAGC。以2-ΔΔCt计算MDR1 mRNA的相对表达量。
1.8 Western Blot检测P-gp和ER的表达蛋白上样量80μg，100V电泳2h；300mA 湿转2h；室温封闭1h；P-gp鼠单抗（1:500）、ER兔单抗(1:200)、β-actin鼠单抗(1:5000) 4℃过夜；HRP标记抗鼠二抗（1:2000）、HRP标记抗兔二抗（1:9000）室温1h；ECL液暗室发光显影。
1.9统计学分析采用SPSS16.0统计软件作t检验和单因素方差分析。
2结果
2.1 细胞形态学观察光镜下，上皮来源的MCF-7/S细胞贴壁生长，呈长梭形或多角形、排列均匀，可见较多分裂像细胞。加入Doc 24h后，细胞发生明显改变，胞体变圆变小，折光性增强，分裂像细胞数明显减少，且敏感细胞不断死亡，需数次换液不断清除死细胞，最后仅存少数贴壁细胞。这些细胞不规则突起增多，胞体变大，空泡增多，继续培养中仍会有少量细胞崩解死亡，但随着撤药时间的延长，存活细胞最终可恢复原来形态并成团生长（图1）。
2.2 细胞生长曲线 MCF-7/S 和MCF-7/Doc 细胞的倍增时间分别为30.6±1.11h 、41.6±1.58h ，后者是前者的1.36倍，增殖速度明显减慢（t =﹣9.797，P =0.001；图
2)。
2.3 细胞的耐药特性 与MCF-7/S 相比，MCF-7/Doc 不仅对Doc 有较高的耐药性，对其他多种药物也存在不同程度的交叉耐药性；其中对甲氨蝶呤、羟喜树碱有强的耐药，对紫杉醇、表柔比星、吉西他滨有较强耐药，对他莫西芬有轻度耐药，而对卡铂、顺铂及依托泊苷无明显耐药性（表1）。
表1 MCF-7/S 和MCF-7/Doc 细胞的药物敏感性
细胞生长曲线
50100
150200
12345
培养时间(天)
细胞数/100
0MCF-7/S MCF-7/Doc
a . MCF-7/S
b . 加药24小时后 f . 20天左右完全恢复
c . 撤药3-5天
d . 撤药7-10天
e . 撤药15天左右 图1 多西紫杉醇作用前、后及细胞恢复的全过程(放大倍数10×10)
药物
IC50/mg·L-1
RI MCF-7/S MCF-7/Doc
多西紫杉醇 2.49±0.87 82.89±5.21 33.29 紫杉醇0.39±0.13 7.80±2.07 20.00
表柔比星0.86±0.24 18.37±0.98 21.36
甲氨蝶呤0.02±0.01 3.71±0.99 185.35
羟喜树碱0.14±0.03 44.33±2.60 310.00
卡铂39.57±6.36 43.67±2.36 1.10
顺铂 4.57±0.94 4.63±0.84 1.01 依托泊苷11.25±1.26 14.69±1.97 1.31
吉西他滨0.32±0.08 7.27±1.84 22.72
他莫西芬 5.03±0.11 14.87±2.03 2.96
2.4 细胞周期流式细胞仪结果显示，与MCF-7/S相比，MCF-7/Doc处于G0/G1期细胞增加、S期细胞减少、G2/M期细胞增加（表2、图3）。
表2MCF-7/S和MCF-7/Doc细胞的周期分布
细胞类型
细胞周期(%)
G0/G1S G2/M MCF-7/S 54.19±1.14 41.02±6.37 1.57±0.34
MCF-7/Doc 68.87±6.44 25.67±7.67 5.46±2.67
2.5 MDR1基因和P-gp 、ER 蛋白的表达 RT-qPCR 结果显示，MCF-7/Doc 细胞MDR1 mRNA 表达水平是MCF-7/S 的90.66±6.28倍（F =611.445，P <0.001）。Western blot 结果显示，MCF-7/S 不表达P-gp ，而MCF-7/Doc 表达阳性，同时ER 表达缺失（图4）。
3 讨论
体外低剂量逐步加量诱导肿瘤细胞耐药株的方法已较成熟，此外，还有高剂量短时刺激法及上述两种方法的结合，相比之下，低剂量逐步加量法虽然操作繁琐、费时，但风险较小、易把握、成功率较高。本文基于该方法成功诱导出人乳腺癌耐多西紫杉醇MCF-7/Doc 细胞株。与亲代细胞相比，MCF-7/Doc 生长速度明显减缓，被阻滞于G 0/G 1期，群体倍增时间延长，说明MCF-7/S 在建模中经Doc
诱导获得耐药性后处于慢周期甚至静息状态，对化疗药物的敏感性降低，从而具MCF-7/S MCF-7/Doc
图3 MCF-7/S 和MCF-7/Doc 细胞的周期分布差异
β-actin 42KD
ER 67KD
MCF-7/S MCF-7/Doc
P-gp 141KD
图4 MCF-7/S 和MCF-7/Doc 细胞P-gp 、ER 的表达情况
备了MDR特性。
MDR是指肿瘤细胞一旦对一种化疗药物产生耐药性，对其它结构和功能不同的化疗药物也产生交叉耐药，是一种独特的广谱耐药现象。本研究也发现Doc诱导的MCF-7/Doc耐药株不仅对Doc耐药，而且对从未接触过的其它化疗药物如甲氨蝶呤、羟喜树碱、紫杉醇、表柔比星、吉西他滨等也表现为交叉耐药；说明可能有共同的途径参与了MCF-7/ Doc 耐药的形成，如P-gp的高表达。已有报道P-gp 表达主要与生物碱类、蒽环类和鬼臼碱类抗癌药物耐药有关，而与烷化剂和铂类药物没有交叉耐药[4]。我们的结果“MCF-7/Doc耐药株对卡铂和顺铂无明显耐药”也支持了这一点，同时也为临床Doc耐药后药物选择提供了重要信息。
MDR是临床化疗急需攻克的主要难题，其相关机制的研究较多但仍未阐明。耐药过程可能涉及：药物转运体致药物外排的增加、药物经代谢或解毒的失活、药物靶点的突变或异常表达、DNA修复增强或凋亡减少，等等。其中P-gp过表达是目前公认的MDR生物学基础，也被认为是耐药细胞经典或最基本的标志[5]。P-gp 是一种分子量为170 kD的跨膜糖蛋白，由人类MDR基因家族中与耐药有关的MDR1基因编码。它不仅作为药物外排泵保护细胞免受有毒物质侵袭，而且还可参与细胞的增殖、分化和凋亡，介导MDR产生[6]。本研究通过RT-qPCR及Western Blot 发现MCF-7/Doc高表达MDR1/P-gp，而MCF-7/S不表达，证实P-gp在Doc获得性耐药过程中被诱导产生并起关键作用。Naito等报道以MDR1/P-gp为靶点，3uM MS-209（一种喹啉类逆转剂）可完全逆转多药耐药实体瘤移植模型及细胞模型对Doc的抗性[7]。可见P-gp与Doc 耐药密切相关，至于其它耐药相关蛋白或机制的影响目前正在研究中，还有待阐明。
Iseri等[8]发现不同耐药程度的细胞株MCF-7/30nM Doc和MCF-7/120nM Doc，其基因表达模式不同；与MCF-7/S相比，某些基因如MDR1、细胞外基质（ECM）相关基因、细胞因子和生长因子信号通路基因、活性氧(ROS)代谢和上皮间质转化(EMT)相关基因等，在MCF-7/120nM Doc中的表达差异比在MCF-7/30nM Doc中更明显，从而说明MCF-7获得MDR表型是一个逐步渐变、Doc剂量依赖的过程，也即相关基因表达差异程度随着耐药性的不断增强而增高。此前，他们也发现EMT 过程与MCF-7耐Doc有关，在获得耐药性的同时，锌指转录因子slug和波形蛋白表达上调而钙粘蛋白（E-cadherin）表达下降[9]。
另外，本研究还显示，耐药细胞对内分泌治疗药物他莫西芬的敏感性也降低，
推测可能与ER表达丢失有关。研究发现，一些耐药相关微RNA通过对ER的调节可影响MCF-7细胞对他莫西芬的敏感性；如在乳腺癌中，miR-221/miR-222、miR-206通过直接与ERa的3’UTR相互作用，抑制其翻译，是转录后水平调节ER 的一个分子机制，其异位表达可使MCF-7细胞对他莫昔芬产生抵抗[10,11]。至于ER表达缺失是MDR产生的伴随现象，还是彼此因果关系尚不清楚，但这种交叉耐药现象使肿瘤治疗变得更加复杂和困难，需要深入研究。
由此可见，利用MCF-7/Doc模型，我们还可以进一步在其它相关代谢、转运或靶作用基因或蛋白，EMT以及微RNA调控水平上研究MDR产生的具体机制和涉及的信号通路以及逆转靶点等，为全面认识和攻克MDR奠定坚实基础。
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形态生长方式类型培养条件 人乳腺癌细胞MCF7 上皮样贴壁生长常规该细胞是从一名69岁的白人女性 乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立的。该细胞保留了多个分化乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成隆突结构( domes );该细胞表达WNT7B 癌基因；TNF- a可以抑制MCF-7细胞的生长；抗雌激素处理能调节细胞胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)的分泌。ER(+),PR(+),Her-2(-) 人乳腺癌细胞MDA-MB-231 上皮样贴壁生长三阴MDA-MB-231是从一名 51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受体和WNT7B癌基因。属于高转移性恶性乳腺癌细胞系，易成瘤，且常用 于肿瘤转移研究 人乳腺导管癌细胞MDA-MB-435S 上皮样贴壁生长三阴，转移性乳腺导管腺 癌MDA-MB-435S 是一种纺锤形的细胞，1976年由其亲本(MDA-MB-435)中筛选得到。MDA-MB-435是从一名31岁的转移性乳腺导管腺癌女性患者胸水中分离得到的。但近来证明MDA-MB-435细胞被M14黑色素瘤细胞污染。 人乳腺癌细胞MDA-MB-453 上皮样；多角形贴壁生长三阴，转移性乳腺癌 该细胞系由Cailleau R在1976年从一名48岁的患有转移性乳腺癌的白人女性的心包渗出液中分离建立的。该细胞表达FGF的受体。 人乳腺癌细胞MDA-MB-157 上皮样贴壁生长髓样癌该细胞源自一位患有 乳腺髓样癌的44岁黑人女性，表达WNT7B癌基因，细胞与细胞边界处有细胞桥粒、微绒毛、张力细丝。 人乳腺癌细胞SK-BR-3 上皮样贴壁生长这株细胞是1970年由Trempe G和 Old LJ从一位43岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离得到的。该细胞亚显微结构特征包括微丝和桥粒、肝糖原颗粒、大溶酶体、成束的细胞质纤丝；过表达 ______________ HER2/c-erb-2 基因产物。 人乳腺导管癌细胞ZR-75-1 上皮样贴壁生长该细胞产生高水平的黏液素 MUC-1 mRNA，低水平的MUC-2 mRNA，但不表达MUC-3基因；表达雌激素受体。 人乳腺导管癌细胞HCC38 上皮样贴壁生长该细胞于1992年从一位50岁的白 人女性乳腺导管癌组织中分离建立，该患者曾有平滑肌肉瘤的病史，其母亲死于乳腺 癌；该细胞癌基因her2/neu- , p53+ ;上皮细胞特异性标志物EGP2 (上皮糖蛋白2) 和CK19
姜黄素逆转紫杉醇耐药研究进展 蒋洁敏，康向东 上海中医药大学附属普陀医院检验科，上海 200062 摘要：紫杉醇是从天然植物红豆杉属树皮中提取的单体双萜类化合物，具有良好的抗癌活性，广泛用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多种癌症的治疗，被列为乳腺癌和卵巢癌的一线化疗药物。但与其他化疗药类似，耐药性是限制紫杉醇临床应用的一个主要原因。以姜黄素为代表的低毒高效中药单体成为逆转紫杉醇耐药性的研究热点。兹以姜黄素与紫杉醇用药间协同性研究进行综述，以期为临床寻找化疗辅助药物提供参考。 关键词：姜黄素；紫杉醇；逆转耐药；综述 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.039 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2016)03-0129-05 Research Progress in Drug Resistence of Curcumin Reversing Paclitaxel JIANG Jie-min, KANG Xiang-dong (Department of Laboratory Medicine, Putuo Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China) Abstract: Paclitaxel is a kind of monomer diterpene compound extracted from the taxus chinensis, which has good anti-cancer activity. It is widely used in the treatment of breast cancer, ovarian cancer, lung cancer and other cancers. It also has been listed as the first-line chemotherapy medicine on breast cancer and ovarian cancer. However, the drug resistance is the main obstacle to clinical application similar to other kinds of chemotherapy medicine. The low toxicity and high efficient traditional medicine monomer, represented by curcumin, has become the research focus on reversing paclitaxel resistance. This article summarized the research on synergy between curcumin and paclitaxel, with a purpose to provide references for finding clinical assistant chemotherapeutic medicine. Key words: curcumin; paclitaxel; reversing medicine resistance; review 紫杉醇抗肿瘤活性发现于20世纪70年代，临床应用已超过20年[1]。其主要作用机制是能使快速分裂的肿瘤细胞在有丝分裂阶段被牢牢固定，抑制微管解聚。微管的破坏导致肿瘤细胞阻滞在G2-M期，并形成异常的有丝分裂纺锤体，从而阻断肿瘤细胞复制， 通讯作者：康向东，E-mail：xd_kang@https://www.doczj.com/doc/006631580.html, 最终发挥其抗肿瘤的作用[2]。然而，化疗耐药性的出现，使紫杉醇临床应用受到限制。目前，克服紫杉醇耐药、增强肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性已成为紫杉醇用药新的发展战略。姜黄素是从姜黄、郁金、莪术、石菖蒲等植物根茎中提取的一种酚类衍生物，可通过对核因子κB（NF-κB）、过氧化物酶体增殖物激活受体C（PPARC）、腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 医师协会中西医结合医师大会第三次会议论文集.福州,2012. [17] 肖烈钢,何本夫,朱成全.加味四君固本汤与Iressa联合抑制肺癌细 胞增殖的实验研究[J].中国中医药信息杂志,2012,19(6)：43-45. [18] KOBAYASHI S, BOGGON T J, DAYARAM T, et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J]. New England Journal of Medicine,2005,352(8)：786-792. [19] PAO W, MILLER V A, POLITI K A, et al. Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain[J]. PLoS Medicine, 2005,2(3)：225-235. [20] SATTLER M, REDDY M M, HASINA R, et al. The role of the c-Met pathway in lung cancer and the potential for targeted therapy[J]. Therapeutic Advances in Medical Oncology,2011,3(4)：171-184. [21] TURKE A B, ZEJNULLAHU K, WU Y L, et al. Preexistence and clonal selection of MET amplification in EGFR mutant NSCLC[J]. Cancer Cell,2010,17(1)：77-88. [22] 熊杏安,王梦,蔡志强.表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂的耐药 机制[J].国际肿瘤学杂志,2014,41(7)：515-517. [23] 肖海娟,许建华,孙珏,等.中医药逆转肿瘤多药耐药机制研究进展[J].中国中医药信息杂志,2012,19(6)：108-110. （收稿日期：2015-01-23）（修回日期：2015-05-27；编辑：梅智胜）
紫杉醇在乳腺癌治疗的应用 目的：探究紫杉醇在乳腺癌治疗的应用。方法：选取笔者所在医院2011年3月-2014年3月收治的诊断为乳腺癌的92例患者，将其按照随机数字表法分为对照组和治疗组两组，每组46例。对照组采取CAF方案即环磷酰胺、柔比沙星、氟尿嘧啶进行联合化疗；治疗组给予紫杉醇、阿霉素进行化疗。两组患者治疗一段时间后（一疗程，即3周），观察其临床疗效及治疗过程中肿瘤转移情况。结果：对照组总有效率71.74%，在治疗中出现腰椎转移1例，胸椎转移4例，这5例患者均及早行乳腺癌根治术；治疗组总有效率41.30%，在治疗中发现腰椎转移2例，均及早行乳腺癌根治术，治疗组总有效率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），两组患者在化疗期间均未出现不良反应（发热、恶心、呕吐等）。结论：紫杉醇在乳腺癌治疗中，其临床效果显著，无明显不良反应，有一定的临床应用价值，值得推荐，但真正的意义在于怎样预防乳腺癌的发生。 标签：紫杉醇；乳腺癌；治疗；应用 乳腺癌是女性恶性肿瘤中较为常见的一种，严重威胁女性的身体健康。其发病与诸多因素有关，如月经初潮时间早于12岁、生育第1胎年龄较晚（≥35岁）、孕妇生育后未哺乳等。轉移途径有局部扩散、淋巴转移、血运转移，其中较为常见的转移方式是淋巴转移。男性乳腺癌占男性全部癌肿的0.2%～1.5%，发病率约1%。乳腺癌关键是预防，成年女性要知道一些关于预防该病的一些常识。社会在进步，医学也在发展，治疗乳腺癌的方法也越来越多，紫杉醇作为新一代的化疗药物，紫衫烯环的二砧类化合物是其主要的活性成分，柔比沙星为恩环类抗生素，可抑制RNA的合成，也可阻止DNA的复制，采用紫杉醇、阿霉素联合进行化疗，可取得较好的临床效果[1-3]。现将笔者所在医院2011年3月-2014年3月收治的诊断为乳腺癌的92例患者作为研究对象，现报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 选取笔者所在医院2011年3月-2014年3月收治的诊断为乳腺癌的92例患者，将其按照随机数字表法分为两组，对照组和治疗组，每组46例，所有患者均无其他转移，一般情况尚可。对照组年龄32～69岁，平均（45.0±2.2）岁，病程1.1～5.2年，平均（2.4±1.1）年，其中绝经前26例，占56.52%，绝经后20例，占43.48%；治疗组年龄33～71岁，平均（48.0±2.1）岁，病程1.0～5.8年，平均（3.4±1.0）年，其中绝经前28例，占60.87%，绝经后18例，占39.13%。两组患者一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 治疗方法 对照组：柔比沙星、环磷酰胺、氟尿嘧啶联合用药，其剂量分别为60 mg/m2、500 mg/m2、500 mg/m2，1次/d。治疗组：紫杉醇、阿霉素联合用药。阿霉素剂
人乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株的建立及特性 李文静1，张磊2，赖娅娜2，唐金海3，钟山亮1，恽文3，赵建华1(210009 江苏南京，南京医科大学附属省肿瘤医院临床检验中心1、科研科第三实验室2和普外科3) [摘要] 目的建立人乳腺癌多西紫杉醇（Docetaxel，Doc）耐药细胞模型MCF-7/Doc，初步探讨其生物学特性。方法采用Doc低浓度逐步加量诱导法建立MCF-7/Doc耐药株；通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、MTT 法药物敏感试验及流式细胞术评价其生物学特性；实时荧光定量PCR和Western blot分别检测多药耐药基因MDR1 mRNA和蛋白的表达。结果经10个月的诱导成功建立MCF-7/Doc细胞株，可在100 ng/ml Doc培养液中稳定生长，耐药指数为亲代敏感细胞MCF-7/S的33.3倍，对其他多种化疗药物呈交叉耐药状态。光镜下，药物处理后细胞变圆变小、核分裂像减少；MCF-7/Doc倍增时间较MCF-7/S延长（41.6h vs 30.6h；P<0.01）。与亲代相比，耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、S期减少；MDR1基因表达水平增高90.7倍，蛋白表达转为阳性，而雌激素受体阳性表达丢失。结论MCF-7/Doc细胞具有典型的多药耐药性，MDR1基因和蛋白过表达是其获得性耐药的主要机制之一。 [关键词] 乳腺癌细胞；多西紫杉醇；多药耐药；P糖蛋白 [中图分类号] R737.9 乳腺癌属全身性疾病，综合治疗非常关键，其中化疗是不可替代的重要手段之一；然而多药耐药（multi-drug resistance, MDR）常导致治疗失败以及后期肿瘤的复发和转移，严重威胁患者生存。多西紫杉醇（Doc）是在天然抗肿瘤药物紫杉醇的基础上，经结构修饰后获得的一种新型抗肿瘤药物，溶解性好，药效更优。临床实践表明，以Doc为主的联合化疗是乳腺癌、尤其是淋巴结阳性患者最有希望的治疗方案[1]，但耐药问题也不容忽视，据报道其对转移性乳腺癌的治疗反应率为 [基金项目]江苏省社会发展科技计划项目（BS），国家自然科学基金资助项目（） 第一作者：李文静，女，硕士研究生，主要方向：临床检验诊断学，电话：，E-mail： 通讯作者：赵建华，女，硕士生导师，研究员，主要从事临床检验诊断学及肿瘤学研究：电话：, E-mail：
MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶（25ml培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞
细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代；每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基 +5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37℃ 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA溶液，消化5-10min 传代的比例：1：2~1：4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO
如何看懂乳腺癌常见免疫组化指标 很多乳腺癌患者和家属都苦于看不懂乳腺癌常见的免疫组化指标而无法对医生的治疗进行判断，今天海南亚洲制药集团的小编就这个问题为您详细阐述。 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，它的发病常与遗传有关，以及40-60岁之间、绝经期前后的妇女发病率较高。仅约1-2%的乳腺患者是男性。通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤。是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。治疗乳腺癌主要有手术、化学药物治疗、放射治疗和现代中药治疗等手段，临床必须根据病期早晚，选择不同方法联合应用，选择合理时，比单一方法疗效好。近年来研究发现人参皂苷Rh2（最佳含量16.2%）抑制癌细胞增殖作用的能力最强，是人参皂苷中的最主要抗癌活性成分。人参皂苷Rh2通过抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞分化凋亡对多种肿瘤有效，也为应用于乳腺癌治疗提供了新的武器。 乳腺癌为激素依赖性肿瘤，就是说乳腺癌细胞的生长依赖雌激素和孕激素的刺激，雌孕激素通过与乳腺癌细胞上相应受体结合发挥作用，免疫组化表现为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阳性。PR的形成直接受ER的控制和调节，故PR阳性的乳腺癌，ER大多为阳性。但有些细胞在癌变过程中，其受体系统保留很少或完全丧失，不能再作为激素的靶细胞，其生长不再受激素的控制与调节，表现为ER阴性乳腺癌。 乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR） 临床上可以通过对雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的检测，得出肿瘤细胞内激素受体含量的水平，从而提示乳腺癌的预后信息和指导内分泌治疗。据报道高分化肿瘤或临床分期较低的肿瘤ER、PR更可能阳性；乳腺癌ER阳性率约为50%～80%,PR阳性率约为50%。ER及PR阳性肿瘤对内分泌治疗反应性高，有效率达55％～60％，受体阴性者有效率5％～8％。ER和(或)PR阳性患者较ER和(或)PR阴性患者有较好的预后。 乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素调节蛋白PS2 雌激素调节蛋白PS2是由激素依赖细胞分泌的，可以通过自分泌和旁分泌起作用，是预测乳腺癌预后和内分泌治疗疗效的另一项重要指标。通常ER阳性乳腺癌细胞，PS2也呈现高水平表达。PS2在乳腺癌表达的阳性率在43%～58%之间。PS2与ER表达的正相关性，在绝经前的妇女(50岁以下)表现更为明显。PS2(+)ER(+)病例大约占83%，很少ER(-)和PR(-)，而PS2(+)(约4%)。作为乳腺癌抗雌激素治疗预测指标，PS2可能优于ER、PR，若三者结合则可达到满意的预测效果。 乳腺癌常见免疫组化指标：预后指标PS2 PS2作为预后指标，对无淋巴结转移者的意义尤为重要。No(无淋巴结转移)的乳腺癌患者，在采取单纯手术治疗的情况下,约20%～30%的患者会复发。有研究发现，PS2阳性与阴性两组在N0患者复发率相差31%,死亡率相差13%。因此PS2成为确定N0组患者属于危险组或非危险组的参考指标之一。PS2检测对淋巴结阳性(N+)患者也同样可分成危险组和非危险组,两组预后差别非常明显。乳腺癌ER(-)、PR(-)、PS2(-)的患者预后差,治疗失败率为83%,5年存活率仅为41%。 乳腺癌常见免疫组化指标：标记细胞增殖状态的抗原Ki67 Ki67是一种标记细胞增殖状态的抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可少的，阳性说明癌细胞增殖活跃。Ki67的监测多用于判断肿瘤的良、恶性及恶性程度，也用于探讨细胞增殖活性、细胞周期与肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为及预后的关系。 乳腺癌常见免疫组化指标：细胞周期蛋白(CyclinD1) 细胞周期是由细胞周期素(cyclin)、细胞周期素依赖蛋白激酶(CDK)和细胞周期素依赖蛋白激酶抑制蛋白(CKI)来进行调控的。不同时相(G1、S、G2、M)间存在关键的调控点。细胞周期蛋白(CyclinD1) 与特定的CDK结合构成复合体，可在G1/S 交界处将信号转导途径与细胞周期调控联系起来，完成各个时期的转换。其过度表达可缩短G1 期，并减少对生长因子的依赖
研究多西他赛解救治疗紫杉醇耐药转移性乳腺癌患者的临床效果分析 发表时间：2016-10-26T16:43:07.820Z 来源：《健康世界》2016年第19期作者：宋振玉 [导读] 差异具有统计学意义。提示在阑尾切除术中实施腰硬联合麻醉，能降低患者不良反应发生率，安全性较高。 青岛市胶州中心医院 266300 摘要：目的：探讨多西他赛解救治疗紫杉醇耐药转移性乳腺癌患者的的临床应用价值。方法：回顾分析我院收治的80例紫杉醇耐药转移性乳腺癌患者的临床资料，收治时段在2014年1月-2016年5月间；所有患者均实施多西他赛治疗，分析患者的耐药性、临床疗效、毒副反应以及生存情况等。结果：①耐药性：80例患者中，原发耐药率为40%，继发耐药率为80%；②治疗效果：客观缓解率达到65.0%，临床获益率为87.5%；原发耐药和继发耐药无明显的差异性，（P>0.05）；③毒副反应：主要以IV级中性粒细胞减少以及III级白细胞计数为主；④生存情况：原发耐药患者的PFS为（2.74±0.45）月，继发耐药患者显示为（5.72±1.32）月，具有差异性，（P<0.05）结论：紫杉醇耐药转移性乳腺癌患者经多西他赛解救治疗后，可获得较好的临床获益以及客观缓解效果，而原发耐药性患者对多西他赛治疗的反应差。 关键词：多西他赛；紫杉醇耐药；转移性乳腺癌；临床效果 紫杉醇和多西他赛是转移性乳腺癌主要的主要药物，但较多的临床研究表明紫杉醇与多西紫杉醇具有一定程度上的交叉耐药性，但也有报道证实[1]使用多西他赛可以治疗紫杉醇耐药转移性乳腺癌。鉴于此，本次选取2014年1月-2016年5月时间段的紫杉醇耐药转移性乳腺癌患者80例实施多西他赛治疗，分析该药的安全性，现将全部内容整理如下。 1.资料与方法 1.1 一般资料 以我院收治的80例紫杉醇耐药转移性乳腺癌患者（2014年1月至2016年5月间）为研究对象。其中，临床资料不全者、脏器功能障碍者、精神性疾病患者以及未签署知情同意书者皆不在入选之列；全部的患者经病理检查均为紫杉醇耐药转移性乳腺癌病症；年龄在32-73岁间，年龄均值（51.52±7.41）岁，雌/孕激素受体阳性比例显示为61.2%。 1.2 纳入标准 原发耐药：①所有患者均为紫杉醇治疗无效的乳腺癌病患；②曾给予紫杉醇进行放射性治疗者；③所有患者的无病生存期要低于12个月。 继发耐药：①所有患者经紫杉醇解救治疗已经达到PR或CR阶段，且于治疗中发生疾病变化的乳腺癌者；②曾有紫杉醇辅助化疗的历史；③患者的无病生存期超过12个月者。 1.3 治疗方法 紫衫治疗：该方法主要根据综合癌症网络（NCCN）规定的使用标准，三周疗剂量：剂量设定为：对患者实施紫杉醇175mg/m2的剂量采取静脉滴注治疗，1天1次，将21天为一周期；周疗剂量：使用紫杉醇80mg/m2以静脉滴注方式治疗，每周治疗1次。 多西他赛治疗：采取静脉滴注60-100mg/m2的多西他赛治疗，1天1次，1个周期是21d，有效者应连续该药治疗到病症有转化或不良反应超出患者忍受范围内可停止。 1.3 观察内容 ①对患者的治疗后的效果进行评价，参考实体瘤治疗的诊断标准，分为全部改善（CR）、部分改善（PR）、情况稳定（SD）以及好转（PD）；客观缓解率=（CR例数+PR例数）/总数×100%，临床获益率=（CR例数+PR例数+SD例数）/总例数×100%，临床疗效均持续超过24周，并详细统计患者的耐药情况以及无进展生存期情况（PFS）。②毒副作用：参考世界卫生组织的（WHO）化疗药物毒性反应诊断的规定，观察患者出现的血液毒副反应情况。 1.4 统计学方法 利用SPSS20.0软件分析数据资料，计数、计量资料分别采用X2表、t表检验，P<0.05有统计学意义。 2结果 2.1 患者耐药分析 本次研究发现，80例患者中，原发耐药率达到40%（32/80）；继发耐药率为80%（48/60）。 2.2 患者的治疗效果分析 经分析，患者的客观缓解率达到65.0%（52/80），临床获益比例为87.5%（70/80）；原发耐药、继发耐药缓解的例数为54例、56例，对应的比例为67.5%、70.0%；临床获益比率达到82.5%（66/80）、80.0%（64/80）；不同的耐药间并未有明显的差异性， （P>0.05），不具有可比性。 2.3 患者血液毒副反应分析 80例患者中的血液学毒副反应主要以IV级中性粒细胞减少以及III级白细胞计数减少最为突出，分别总数的77.5%、47.5%，详见表1 表1 患者紫杉醇耐药的血液学毒副作用情况 2.4 患者的生存情况 经分析患者的PFS达到（4.32±1.06）月、原发耐药患者的PFS为（2.74±0.45）月，继发耐药患者为（5.72±1.32）月，原发耐药患者
MCF-7是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10- 15%的小 牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25%的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶(25ml 培养瓶)静置消化2—5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该 细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受体和WNT7BS基因 培养基L15: Leibovitz Medium 血清10%FBS 细胞传代方法1:2~1:4 传代；每周2~3次 细胞传代情况C5 细胞冻存条件MDA-MB-231人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37 C 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA 溶液，消化5-10min 传代的比例：1 : 2~1: 4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度：1-2 X 10 6/管，液氮保存 MDA-MB-231人乳腺癌细胞复苏方法：取出冻存管后，投入37 C水浴中，震荡解冻2 min , 酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，加入 5 ml 37 C预热的培养基，并清洗冻存管一次，将离心管离心( 1000 rpm , 5 min),弃去上清液，再加入 2 ml培养■基，转入培养瓶中培养。 产品名称：人正常乳腺细胞Hs 578Bst 规格：70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点：细胞代数为4-5代左右 包装：内层无菌自封袋；专用防压泡沫盒；外层防压保温气泡袋；说明书 细胞来源：ATCC、sciencell、ICLC
紫杉醇 【中文名称】：紫杉醇 【英文名称】：Paclitaxel 【定义】：从紫杉(Taxus brevifolia)的树皮中提出的一种化合物。是微管的特异性稳定剂，可促进微管的装配和保持微管稳定。 【所属】：属于萜类，双萜生物碱 【分子式为】：C47H51NO14，分子量：853.90 【结构式】： 【理化性质】：从甲醇析出针状结晶或无定形粉末；熔点213～216℃(分解)； [α]D20-49°(甲醇)；UV最大吸收(甲醇)：227，273nm(ε29800， 1700)；为白色结晶粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮 等有机溶剂 【结构特点】：含有酯键，对碱不稳定；含有环氧丙烷环，具有抗癌活性；含有的N原子处于酰胺状态，不显碱性；紫杉醇结构中无苷键，对酸 相对稳定；紫杉醇可与MnO2发生氧化反应，且不易还原。 【高效分离纯化紫杉醇的方法】 包括：ａ、萃取，以红豆杉为原料获得含有紫杉醇的提取物；ｂ、去除胶质，除去提取物中的胶质杂质；ｃ、分离纯化。 紫杉醇生产工艺如下： 红豆杉树皮粉碎（越细越好），８５％～９５％酒精，３５－５５℃热回流浸提三次，５０－７０℃真空减压浓缩至热测比重１．１～１．２
ｇ／ｍｌ，氯仿萃取，萃取液浓缩成膏状，得紫杉醇含量１％氯仿膏，将紫杉醇含量１％氯仿膏加氯仿溶解完全，加硅胶搅拌均匀，凉干，过筛，填装到层析柱中，氯仿－甲醇梯度洗脱，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，得紫杉醇含量５～８％半成品，将紫杉醇含量５～８％半成品加丙酮溶解完全，加硅胶搅拌均匀，凉干，过筛，填装到层析柱中，丙酮－石油醚梯度洗脱，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，得紫杉醇含量２０～２５％半成品，用丙酮－石油醚系统结晶３～４次，抽滤，５０℃真空减压干燥，得紫杉醇含量７５～８０％半成品，１６Ｍｐａ压力层析分离，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，目标段浓缩物丙酮－石油醚结晶，抽滤，干燥，得紫杉醇含量≥９９．５％成品； 去除胶质的过程为：高压硅胶层析柱层析去除胶质，同时将紫杉烷化合物分离为紫杉醇、三尖杉宁碱、７－表紫杉醇３部分。 【药理作用】 ①作用机理微管在维持正常细胞功能，包括有丝分裂过程中染色体的移动、细胞形成的调控、激素分泌和细胞受体的固定等具有重要作用。微管蛋白是微管形成的重要基础。紫杉醇就是作用于微管月踢缺管蛋白系统，可促进微管蛋白装配成微管，并抑制微管的解聚，从而导致微管束的排列异常，形成星状体，使仿锤体失去正常功能，导致瘤细胞死亡闭。 ②药效学紫杉醇主要影响L一1210细胞的周期移行，使细胞阻碍断在q期和M期[51。使瘤细胞不能分裂变大，井出现多核细胞，阻断有丝分裂。 ③药效学紫杉醇静脉给药后广泛分布于各组织中，其中肝、脾、肺及大肠中放射性较高小肠、脂肪及骨髓中次之，脑及肌肉中放射性较低。给药后12h尿排泄多于粪中排泄量，给药后72h尿粪中的总排泄量占给药量的74%，.. 胆汁中排泄量在给药后3h即占给药量的59.4%，.. 终末半衰期平均为5.3-17.4ho ④量效关系紫杉醇存在个体差异，AUC波动范围较大[6,7]，在 4.367 一 16.0128mg几.h之间，疗效与剂量无多大关系，而疗效与用药后的即刻浓度(Cmax)有一定关系。提示为了改善病人的疗效而进行血浓度测定，并根据监测结果指导合理用药是必要的。
CMF方案(转移)：CTX 600mg/M2 d1; MTX 40mg/M2 day 1and 8;5FU 600mg/M2day 1and 8;每21天重复×6常用可切除乳癌的辅助化疗。 CAF方案：CTX 500mg/M2 day 1;ADM 50mg/M2 day 1; 5FU 500mg/M2 day 1；+PR 40-65%。此方案是目前乳腺癌术后推崇的化疗方案。有人认为CAF方案4个疗程的结果与CMF方案6个疗程相同。 FAC方案：5FU 500mg/M2,d1 and d8其余同CAF方案。CMF方案(术后标准辅助化疗)：CTX 100mg/M2 po, day1-14天；MTX 40mg/M2 iv day 1-8天；5FU 600mg/M2 iv day 1 and 8天；每4周重复×6周期。 AC方案：CTX 600mg/M2 day 1 ADM 60mg/M2 iv day 1;每3周重复一次。2004CSCO年会中报告，阿霉素的剂量超过60mg/M2后并不能提高化疗的疗效。在传统的AC 化疗方案基础上加用泰素175mg/M2在乳腺癌的辅助治疗中的疗效已得到肯定。 CAP方案：CTX 500mg/M2 day 1 and 8; ADM 40mg/M2 iv day 1; DDP 50mg/M2 iv d3 and d8； MCF方案：MMC 20mg iv d1; CTX 1000mg iv d1; 5FU iv gtt qd×5天。（本人用于晚期乳腺癌，效果很好）。 MVD方案：MMC 8mg/M2 d1 + VDS 3mg d1 and d8；DDP 30mg/M2 iv gtt qd×3天。针对ADM产生耐药后的乳腺癌病人，有两个方案可供选择：多西紫杉醇+Xe和紫杉醇+吉西他滨(GEM)方案。 治疗失败后或高危组病人可选方案： MV方案：MMC 20mg/M2 iv day 1; VLB M2 iv day 1 and 21;每6-8周重复。 DV方案：DDP 20mg/M2 iv day 1→5；VP16 60mg/M2 iv day 1→5天。 NA方案：NVB 25mg/M2 iv day1 and 8；ADM 50mg/M2 iv day 1；q3w 重复。CR+PR 74%(有的医院肿瘤化疗专家对乳腺癌术后有腋淋巴结转移的病人，直接用此化疗方案化疗6个疗程。)。 PA方案：PXL 175-225mg/M2 iv gtt d1; ADM 50mg/M2 iv day 重复，CR+PR 69-93% PFL方案：PXL 175mg/M2 iv gtt day 1; LV 300mg/M2 iv gt day 1→3; 5FU 350mg/M2 iv gtt day 1→+PR 52%. PP方案：PXL 75-85mg/M2 iv gtt day 1; DDP 40mg/M2 iv gt day 1,q1w重复×6周期。CR+PR 81% IAF方案：IFO M2 iv gtt day1→5；ADM 30mg iv day 1；5FU 500mg/M2 iv gtt day 1 and 8；q4w重复。 当ADM治疗失败后，可用PXL and /or NV治疗。目前研究认为，对部分绝经前、淋巴结阳性乳癌术后用Zoladeex〔诺雷德〕可以获得与CMF方案同样疗效.。注射埋植剂支，每4周注射1次。中国生物治疗网杨教授特别指出，目前认为ADM的标准用量是60mg/M2，表阿霉素在剂量<90mg/M2时呈剂量依赖关系，但剂量>90mg/M2时则量效关系不明显。对晚期乳腺癌辅助化疗，特别是有高危因素的病人，还是推荐使用蒽环类联合化疗，如AC、CAF、CEF等联合化疗方案。高剂量的HDCT化疗方案不能作为早期或晚期乳癌的标准化疗方案。
紫杉醇的抗癌研究 摘要 延长生命并提高存活质量是抗癌的新要求。植物药的紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxo1)是从红豆杉的树皮、树根及枝叶中提取的一种化合物,是近年国际市场上最热门的抗癌药物,并已取得了巨大的进展。美国肿瘤研究所认为,紫杉醇是人类未来20年间最有效的抗癌药物之一。 关键词紫杉醇抗癌疗效 第一部分综述 随着近年来癌症患者的增多, 癌症给病人和家人带来了肉体和精神上的伤害, 各种抗癌剂的副作用带来的反应使病人在延长生命的同时也饱受副反应之苦。延长生命并提高存活质量是抗癌的新要求。只有向天然药物要药。近年海洋药物的研究逐步深入, 海洋药物中的皂苷抗癌作用备受关注。美国国家癌症协会( N C I ) 在上世纪5 0 年代末为了寻找安全有效的抗肿瘤药物, 在35000 种植物提取物中进行筛选,这项运动历时20 余年,紫杉醇于1992 年12 月29 日被美国FDA 批准用于治疗晚期卵巢癌。 紫杉醇(paclitaxel , 商品名Taxol) 是一种在红豆杉科( Taxaceae L.) 红豆杉属( Taxus L.) 生长缓慢的长绿乔木中分离提取到的天然化合物。紫杉醇是目前全世界公认治疗肿瘤的有效药物,也是全球抗癌药物研究的热点。近年来,紫杉醇无论在药理活性、分离测定方法、提取纯化技术、化学结构修饰、类似物的化学结构及其生物活性和主要活性物质的人工合成或半合成,还是新的药物制剂与剂型及其类似物的开发与利用等方面的研究,都取得了巨大的进展。 植物药的紫杉醇是近年国际市场上最热门的抗癌药物, 并已取得了巨大的进展。美国肿瘤研究所认为, 紫杉醇是人类未来 2 0 年间最有效的抗癌药物之一。 早在1856 年Lucas 就从浆果红豆杉的叶中提取到过粉状紫杉碱(taxus) ,但当时未引起人们的注意。100 年后的1958 年美国国家癌症研究会(NCI) 耗资250 亿美元,历时20多年(1958 —1980 年) ,对3 500 余种植物中的11 万多个化合物的抗癌活性进行了筛选。1971 年从短叶红豆杉Taxus brevi folia Nutt1 的树皮中首次分离得到紫杉醇,并证实了其抗癌活性。1975 —1976 年通过药理实验证明紫杉醇对B216黑素瘤及人体肿瘤裸鼠异种移植瘤(乳腺癌、肺癌及结肠癌) 有活性。到20 世纪70 年代末,证明其活性机制为在细胞增殖期的G2 期,抑制纺锤体和纺锤丝的形成,从而抑制有丝分裂,阻止癌细胞的增殖。紫杉醇的这种独特的药理作用加快了其临床研究的步伐,1982 年Ⅰ期临床试验开始,1989 年完成Ⅱ期临床试验,1990 年进入Ⅲ期临床试验,并证实了对卵巢癌和乳腺癌的疗效。1992 年12 月29 日美国食品药品监督管理局( FDA) 和加拿大政府正式批准紫杉醇用于治疗卵巢癌,1993 年12 月批准用于治疗乳腺癌。1993 年11 月该产品被法国政府批准上市。随后,陆续在瑞典、奥地利、丹麦、德国、卢森堡、
MCF-7 就是一种很好养的人乳腺癌细胞,培养基用DMEM或RPMI1640均可, 10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基,加入0、25％的胰酶1ml,轻轻晃动培养瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶(25ml培养瓶)静置消化2－5min,待细胞缩起变圆,将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗,而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用,感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快,一般不放到培养箱中消化,以免消化太过。需要注意的就是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起,一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231就是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体与WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代;每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基:DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件:37℃ 5% CO2 消化条件:0、25% (w/v) Trypsin-0、53mM EDTA溶液,消化5-10min 传代的比例:1:2~1:4 换液时间:2~3天换液一次 冻存液比例:85%培养基,10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度:1-2 ×10 6/管,液氮保存 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法:取出冻存管后,投入37 ℃水浴中,震荡解冻2 min,酒精消毒管壁外侧后,将其转入超净台中,将管内细胞转移至离心管中,加入5 ml 37 ℃预热的培养基,并清洗冻存管一次,将离心管离心(1000 rpm,5 min),弃去上清液,再加入2 ml培养基,转入培养瓶中培养。 产品名称:人正常乳腺细胞 Hs 578Bst 规格:70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点:细胞代数为4-5代左右 包装:内层无菌自封袋;专用防压泡沫盒;外层防压保温气泡袋;说明书 细胞来源:ATCC、sciencell、ICLC
水溶性紫杉醇衍Sinenxan A(SI-A,3)[3]是由南方红豆杉愈创组织培养得到的含量较高(干重可达2%)的新型紫杉烷化合物,具有紫杉醇母核类似骨架和14β-含氧基团,而无相应的1,7,9,13位含氧 基团,为寻找新的抗癌药提供了可以不依赖自然资源的原料。因此,我们围绕SI-A母核进行了 系统的结构修饰,合成了一系列14β-侧链紫杉醇衍生物[4]。本文报道我们工作的一部分。 经计算机分子计算,化合物4和5分子表面静电势与紫杉醇相似[5],有可能具有较强的抗 肿瘤活性,因此这两个化合物成为我们要合成的目标分子。 化合物4的合成路线见图2。从SI-A出发经11步反应可以得到起始中间体6[6]。6用氢 氧化钾选择性水解10位酯基高收率地得到7,7随后经TPAP[tetrapropylammonium perruthenate(Ⅶ)]氧化生成8。我们参考Nicolaou在全合成紫杉醇所用的方法[7],在叔丁醇钾 和苯硒酸酐[(PhSeO)2O]作用下,化合物8的羰基α-氢被氧化为羟基生成9,化合物9的9位 羟基构型经NOE差谱证实处于α位。在对9进行硅胶柱分离纯化时,发现9在硅胶中易转变 成10。紫杉烷类化合物的10位羰基/9位羟基在硅胶中转变为10位羟基/9位羰基,未见文献 报道。与Nicolacu的方法[7]相比,利用该方法将化合物9转变为10,条件温和,副产物少,容易 操作。Nicolaou在全合成紫杉醇时将10位羰基/9位羟基转变为10位羟基/9位羰基,采用的 方法是先用叔丁醇钾在-78℃进行烯醇化生成烯二醇,然后用醋酸酸化实现转变。但我们在实 验中发现Nicolaou的方法不适合我们这类化合物,产物很复杂,生成很多极性大的产物,可能 是由于这类化合物的四员氧环对酸更敏感,醋酸的酸性已导致四员氧环的开环。 图2 制备目标化合物4的合成路线 Fig.2 Synthesis route for target compound 4 在4-二甲胺基吡啶(DMAP)作用下,将9进行乙酰化得到11。用四丁基氟化胺(tetrabutylammonium fluoride,TBAF)脱去11的TES保护基时,生成的产物主要为双键转移 化合物12,预期的产物13很少。改用0.5%稀盐酸去除TES能得到高收率的13。在二环己基 碳二亚胺(DCC)和DMAP作用下,13与用ee保护的侧链酸14偶联生成15,随后用0.5%稀 盐酸脱去ee保护基得到目标化合物4。 化合物5的合成见图3。与合成4的方法相同,先将10进行乙酰化、脱去TES保护基得到 17,17与用ee保护的侧链酸14偶联后,用稀盐酸去除ee保护基顺利得到目标化合物5。 所有化合物的结构都经IR、1HNMR、13C NMR、FAB-MS证实。目标化合物4和5的结构 还经高分辨质谱验证。 图3 制备目标化合物5的合成路线 Fig.3 Synthesis route for target compound 5 将4和5进行了体外肿瘤细胞抑制试验(MTT法)和微管聚合试验(浊度测定法)[6]。药理 结果表明,这两个化合物对人口腔癌细胞(KB)的IC50>10μg/ml-1,在浓度为10μM时对微 管无聚合作用。而紫杉醇对KB细胞的IC50为2.59×10-3μg/ml-1,在10μM时对微管有聚合 作用。从药理结果可以看出,目标化合物的细胞毒活性比紫杉醇差3个数量级以上,说明分子 表面静电势不是影响活性的关键因素。 紫杉醇的构效关系研究表明,分子北部基团(7,9,10位含氧基团)对活性影响不大[8],这 与我们的初步研究结果相同(9,10位含氧基团互换对活性无明显影响)。从分子结构对比看, 目标分子的侧链处于14β-位而不是13α- 位,并且缺乏紫杉醇相应的1位羟基,这可能是导致化