清开灵注射液细菌内毒素检查法的研究概况

基层中药杂志　２００２年　第１６卷第３期　Ｐｒｉｍａｒｖ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍａｔｅｒｉａ　Ｍｅｄｉｃａ　

・综述杂谈・　

清开灵注射液细菌内毒素检查法的研究概况　汪稳福，颜可智，伍利锋，沈小卓　（ｙ－州市医药中专学校，广东广州５１０４３０）　关键词：鲎试验；清开灵注射液；细茵内毒素检查法；干扰试验　中图分类号：Ｒ２８３．６１１　文献标识码：Ａ　应用细菌内毒索检查法检测药品内毒索，具灵敏度高，　方法简便，正日益受到人们的重视。我国在１９９１年也将该法　收入卫生部部颁标准，中国药典１　９９５版正式收载该法，２０００　版又作了修订，并制定了细菌内毒索检查指导原则。但中药　注射剂的细菌内毒索检查仍未收载，而目前国内有不少学者　对此进行了研究探讨。为了了解国内检测清开灵注射液细菌　内毒索的试验情况，笔者查阅了在全国公开刊物上发表的论　文，对清开灵注射液细菌内毒索试验研究情况进行综述并作　简要分析，为今后应用提供依据。现将结果综述如下。　清开灵注射液是安宫牛黄丸的改型制剂。主要成分为牛　黄、金银花、桅子、水牛角、珍珠母、板蓝根等，具有清热解毒、　化痰通络、醒神开窍的功能。在临床上用于治疗热病神昏、中　风偏瘫、神志不清，也可用于急慢性肝炎、乙型肝炎、上呼吸　道感染、肺炎、高热以及脑血栓形成、脑出血见上述证候者，　应用较广泛。该品种部颁规定的检查项是热原检查。首先对　此进行研究的见周海燕等＿１］的工作，它证实了样品原液（北　京中医药大学药厂生产，规格１０　ｍｌ／支）具有抑制作用，经　稀释１　６倍后．用０．１　２５　ＥＵ・ｍｌ　的鲎试剂（福州东方鲎试　剂厂）．可检出细菌内毒索，并提出可作为工厂内控方法。但　其确定的Ｌ值是以兔法计算所得，Ｌ值为１　ＥＵ・ｍｌ＿。。而王　晓蕾等＿２］实验结果是根据清开灵注射液人的最大剂量为０．８　ｍ１．ｋｇ～．计算出清开灵注射液的内毒索限值为６．２５　ＥＵ・　ｍｌ＿　．并据此进行试验。证明样品（市售）对检查结果有干扰，　经稀释（１—２５倍）后，用０．２５　ＥＵ・ｍｌ　的鲎试剂（厦门鲎试　剂厂产品），可检出细菌内毒索，确定其内毒索限量定为６．２５　ＥＵ・ｍｌ＿。。综观两者的Ｌ值相差较大，主要是计算方法不同　所致。　彭晓青等＿３　对清开灵注射液细菌内毒索检查法进行了　研究。首先确定内毒索限值（Ｌ），根据Ｌ＝Ｋ／Ｍ一５．０／５＝１．０　ＥＵ・ｍｌ＿　。计算样品的稀释倍数（ＭＶＤ），ＭＶＤ＝Ｌ／Ｘ。当　＝０．５、０．２５、０．１　２５、０．０６、０．０３　ＥＵ・ｍｌ　时，相应地ＭＶＤ　＝２、ＭＶＤ０　２５＝４、ＭＶＤ０　ｌ　２　５—８、ＭＶＤ０　０６—１　６、ＭＶＤ０　０　一３２　倍。通过预试验和干扰试验确定样品（北京中医药大学药厂）　的２、４、８、１６倍稀释均有抑制作用，而有效稀释浓度是３２　倍，相应的鲎试剂灵敏度为０．０３　ＥＵ・ｍｌ～。经用同一批号　鲎试剂对同一厂家的３个批号的产品进行相同浓度的重复　实验，结果均与上述结果一致　因此细菌内毒索检查法适用　于样品细菌内毒索的检测。研究结果表明：清开灵注射液经　文章编号：１００４—２１９９（２００２）０３—００４３－０２　３２倍稀释，可用灵敏度为０．０３　ＥＵ・ｍｌ　的鲎试剂（湛江安　度斯生物有限公司）进行细菌内毒索检查。　陈吉生等人［４　３在研究以清开灵等５种常用中草药注射　剂（双黄连粉针剂、茵栀黄、复方丹参、参麦注射液）的细菌内　毒索检查方法时则以成人每公斤体重每小时给药的最大剂　量来计算出５种常用中草药注射剂的细菌内毒索限值（Ｌ　值）和ＭＶＤ。其中样品注射液Ｌ值是１１．２５　ＥＵ・ｍｌ～，　ＭＶＤ是２Ｏ倍。首先通过干扰预试验证实：清开灵注射液干　扰性质为增强作用，无法通过稀释消除干扰。然后通过加入　葡聚糖的干扰试验证明：样品注射液（广州明兴制药厂），使　用灵敏度最高的ＴＡＬ（　＝０．０３　ＥＵ・ｍｌ～，湛江安度斯生物　有限公司）按ＭＶＤ　进行稀释，进行干扰试验，结果均为阳　性。故确认样品对ＴＡＬ与内毒索干扰性质为增强作用，且　不能通过常用的稀释方法消除干扰。要通过加入葡聚糖溶液　（用葡聚糖溶液代替ＢＥＴ用水直接复溶ＴＡＬ）才可消除对　ＢＥＴ的干扰。对３个批号的样品分别使用２个厂家的ＴＡＬ，　依法进行ＢＥＴ法检查，结果均符合要求。因此确认这５种中　草药注射剂可以用ＢＥＴ法取代热原检查法。　薄艳春等＿５］参照《中国药典￣２０００年版二部进行了样品　的干扰试验：计算出注射剂的细菌内毒索限值（Ｌ值）是１．０　ＥＵ・ｍｌ＿。；ＭＶＤ是１６倍。干扰试验结果证明：二个厂家（石　家庄神威药业股份有限公司２批；山西太行制药厂１批）的　三批样品，稀释１　６倍后对二个厂家（厦门鲎试剂厂；湛江安　度斯生物有限公司）的鲎试剂（　一０．０６　ＥＵ・ｍｌ　）能消除干　扰作用，试验符合药典规定　证明将样品积稀释１　６倍后，用　＝０．０６　ＥＵ・ｍｌ　的鲎试剂可检查样品中的细菌内毒索。　延庆华等［６　采用《中国药典￣２０００年版附录细菌内毒索　检查法对清开灵注射液（广东某药业有限公司产品）进行细　菌内毒索检查研究，结果是清开灵注射液在稀释至１２Ｏ倍　时，使用　一０．０６　ＥＵ・ｍｌ　的鲎试剂（福州新北生化有限公　司；湛江安度斯生物有限公司）检测可完全排除干扰因素的　影响。认为使用细菌内毒索检查法检查清开灵注射液中内毒　索是可行的。笔者也对样品做过研究，根据中国人的平均体　重６Ｏ　ｋｇ计算，根据公式，计算出细菌内毒索理论限值（Ｌ）为　７．５　ＥＵ・ｍｌ＿。。对３批样品（广州明兴制药厂产品），用两个　厂家的鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司、厦门鲎试剂厂），　稀释３Ｏ倍作干扰试验，结果无干扰作用。最后对６批清开灵　注射液样品用ＢＥＴ水作３Ｏ、６Ｏ倍稀释，分别使用　一０．２５　

维普资讯 http://www.cqvip.com ＥＵ・ｍｌ　和０．１２５　ＥＵ・ｍｌ－１的鲎试剂，依法进行检查。结　果６批样品作３Ｏ倍稀释检查的，有５批ＰＰＣ结果里阴性与　结果不相符。但６０倍稀释，使用　一０．１２５　ＥＵ・ｍｌ　的鲎试　剂作检查，结果全部星阳性与检查结果相符。说明某些批号　的样品在３Ｏ倍稀释后，仍对鲎试剂检查有轻微的抑制干扰，　应提高稀释倍数后（如６Ｏ倍）及选用更高灵敏度（如０．１２５　ＥＵ・ｍｌ－１）的ＴＡＬ作检查，则可以有效地消除样品对检查　的干扰，得到与检查完全一致的真实性结果。　综合以上学者和本人的研究，可以得出：清开灵注射液　采用细菌内毒索检查法检查样品是否含有内毒索方法是可　行的。２０００年版《中国药典》制定的细菌内毒索检查指导原　则．规范了计算原则，计算Ｌ值应以人的最大注射剂量／次和　中国人平均６Ｏ　ｋｇ体重进行计算Ｌ值较为准确。样品对鲎试　验有干扰作用（这已确证），但可通过对样品进行稀释来消除　干扰。稀释的倍数因产品不同、批号不同而有所不同，这提示　各厂家在进行细菌内毒索检查法检查时一定要做好干扰试　验．以二个厂家的鲎试剂经干扰试验确证后才可用于检品的　试验。当前当务之急是希望有关上级药检部门与有关厂家一　基层中药杂志　２００２年　第１６卷第３期　Ｐｒｉｍａｒｖ　ｌｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍａｔｅｒｉａ　Ｍｅｄｉｃａ　起做好论证与复试工作，然后由有关部门做好协调与组织分　工．相对集中人力物力等条件加快研究步伐。相信随着细菌　内毒索试验研究的不断深入和广大药学工作者的积极探索．　应用细菌内毒素检查法检测中药制剂品种的细菌内毒索将　会被中国药典收载。　参考文献　［１］周海燕．薄少英．鲎试验法检测清开灵注射液中的细菌内毒素　［Ｊ］．首都医药．１９９９．６（２）：２１．　［２］　王晓蕾．吕晓川．清开灵注射液细菌内毒素检查的研究口］．药　物分析杂志．１９９９（增刊）：５０．　［３］彭晓青．周家明．清开灵注射液细菌内毒素检查法研究［Ｊ］．时　珍国医国药．２００１．１２（１）：３９．　［４３　陈吉生．杨泽民．５种中草药注射剂细菌内毒素检查方法的研　究［Ｊ］．中国药房２００１．１　２（５）：３ｌ１．　［５］薄艳春．韩吉吉生，徐永欣．清开灵注射液细菌内毒素检查法可行　性研究［Ｊ］．中医药信息．２００１．１８（４）：４６．　［６］延庆华．孙淑莲，叶　志．等．清开灵注射液细菌内毒素检查研　究［Ｊ］　天津药学２００１，１３（５）：５１　（收稿日期：２００２—０３—２１）　

高效液相色谱在中药研究中的应用进展　王　芳　（山东中医药大学，山东济南２５００１４）　关键词：高效液相色谱；中药研究；应用进展　中图分类号：Ｒ２８４　１　文献标识码：Ａ　液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术，是色谱法　中最古老的一种，但通过改进填料的粒度及柱压，在经典的　液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论，在技术上　采用了高压输液泵，高效固定相和高灵敏度的检测器，实现　了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种色谱技术被　称为高效液相色谱法（Ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ＨＰＬＣ）。它是七十年代发展起来的一项新　技术，特别适合高沸点、大分子和热稳定性差的化合物的分　离分析测试。中药的成分非常复杂，以往常用的薄层色谱等　方法因其精密度、准确度、灵敏度、重现性差而不能满足现代　中药的需要。高效液相色谱正是以其稳定、可靠、高效的特点　成为中药研究的最重要的分析方法。经常被用作常规中药质　量的控制，天然药物的成分分析，以及监测新药合成过程等，　为中药开发和评价提供了很好的条件和可靠的依据。目前高　效液相色谱已经广泛应用于生物碱、皂苷、黄酮、蒽醌、香豆　索等各种中药有效成分的测定。　近年来对高效液相色谱监测中药的研究非常多，由于高　效液相色谱集经典液相色谱和气相色谱的优势于一身，无论　柱效、选择性还是分析程度都达到或超过了它们，近年来对　高效液相色谱的不足之处进行了改进，使这项技术日臻完　善。　文章编号：１００４—２１　９９（２００２）０３—００４４　０３　１高效液相色谱发展近况　高效液相色谱在药物分析中的应用，主要考虑试样的预　处理和分析柱、检测器的选择。在试样的预处理上，日前兴起　的固相（微）萃取使得许多含量低的成分得到精制提纯，从而　适于高效液相色谱ｌ＿】　］的测定，而孙新国Ｈ］采用逆流萃取测　定ＪＩｆ芎嗪含量取得了很好的效果。　中药中有些紫外吸收弱，或无特征紫外吸收的成分，直　接用高效液相色谱测定，其灵敏度和分离度都不尽人意，利　用柱前或柱后衍生化法＿５　］可使这些成分较精确地测定出　来。对于极性大、脂溶性差物质，在ＹｗＧＣ，　柱上不易保留，　用十二烷基磺酸钠作为离子对试剂，降低其极性，延长柱上　的保留时间，取得较好的分离较果　］。将液相色谱和质谱这　两个强有力的分析技术在线连接在一起，经过三十年的发展　已成为一项较为成熟的分析手段，但是它从形成伊始就存在　着问题：从液相色谱流进质谱时，流动相的变化、溶剂的组　成、高温高压离子化的问题制约着这种联用技术发展，大气　压离子化接口具有去除溶剂和离子化的双重功效，它的引　入，使得该技术在各个领域得到了广泛的应用　。电喷雾离　子源是一种软电离技术，一般只生成（Ｍ＋Ｈ）＋和（Ｍ—Ｈ）一　两种分子离子峰，选择性监测（ｍ／ｚ）１　９Ｏ的负分子离子峰，具　有较高的灵敏度、准确度、专一性，满足了低浓度药物研究的