显微镜使用

普通光学显微镜的使用

一、目的要求

1.掌握普通光学显微镜的基本构造和工作原理

2.掌握普通光学显微镜油镜的原理

3.使用油镜观察几种细菌的基本形态

二、实验原理

（一）普通光学显微镜的构造

普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成。

显微镜的机械装置

显微镜的机械装置是显微镜的重要组成部分。其作用是固定与调节光学镜头，固定与移动标本等。主要有镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、与调焦装置组成。

镜座和镜臂：

1、镜座 作用是支撑整个显微镜，装有反光镜，有的还装有照明光源。

2、镜臂 作用是支撑镜筒和载物台。分固定、可倾斜两种。

载物台：

放置标本处，压片夹可固定被检标本，标本移动器可以使标本前后和左右移动。

物镜转换器 ：

物镜转换器固定在镜筒下端，有4个物镜螺旋口，物镜应按放大倍数高低顺序排列。旋转物镜转换器时，应用手指捏住旋转碟旋转，不要用手指推动物镜，因时间长容易使光轴歪斜，使成像质量边坏。

镜筒：

连接目镜和物镜的金属，长度一般固定为160mm。

调节器：

由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜和标本间的距离。粗调螺旋旋动一圈镜筒升降约10mm，细调螺旋旋动一圈镜筒升降约0.1mm。

显微镜光学系统

光学系统包括目镜、物镜、聚光器和反光镜等。

物镜 ：

物镜位于被观察物体附近，是实现第一级放大的镜头。在物镜转换器上同时装着几个不同放大倍率的物镜，转动转换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路，物镜的放大倍率通常为5～100倍。物镜是显微镜中对成象质量优劣起决定性作用的光学元件。常用的有能对两种颜色的光线校正色差的消色差物镜；质量更高的还有能对三种色光校正色差的复消色差物镜；能保证物镜的整个像面为平面，以提高视场边缘成像质量的平像场物镜。高倍物镜中多采用浸液物镜，即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体，它能显著的提高显微观察的分辨率。

目镜 ：

目镜是位于人眼附近实现第二级放大的镜头，镜放大倍率通常为5～20倍。按照所能看到的视场大小，目镜可分为视场较小的普通目镜，和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类。载物台和物镜两者必须能沿物镜光轴方向作相对运动以实现调焦，获得清晰的图像。用高倍物镜工作时，容许的调焦范围往往小于微米，所以显微镜必须具备极为精密的微动调焦机构。

聚光器：

将平行的光线聚焦于标本上以增强照明度。聚光器安装在镜台下，可上下移动。使用低倍物镜时应降低聚光器，使用油镜时则应升高聚光器。聚光器上附有虹彩光阑（光圈）。通过调整光阑孔径的大小可以调节进入物镜光线的强弱。观察透明样本时光圈应调得相对小一些，以降低分辨率并增强反差。

反光器：

普通光学显微镜的取光设备，其功能是采集光线，并将光线射向聚光器。反光器安装在聚光器下方的基座上，可在水平和垂直两个方向上任意旋转。反光镜一面是凹面镜，另一面是凸面镜。一般情况下选用平面镜，光量不足时换用凹面镜。

三、实验材料

菌种：培养12~18h的枯草杆菌（Bacillus subtilis）斜面培养物3~4支。

标本片：细菌三种基本形态的染色标本、特殊形态细菌染色标本（钾细菌、葡萄球菌、伤寒杆菌、四联球菌和炭疽芽孢杆菌装片）

仪器及相关用品：显微镜、镜头油、乙醇乙醚混合液、擦镜纸。

四、实验步骤

（一）操作步骤

1、 显微镜放置位置 显微镜应放在身体的正前方，镜臂向身体一方，镜身向前，镜与桌边相距10cm左右。 2、 选择物镜 转动物镜转换器，将低倍镜（10×）转动到和光路对准的位置。

3、 调节光源 打开光源，通过底座上的光强度滑动开关来调节光的强度。

4、放置标本 降低载物台，将标本片放在镜台上，用玻片夹夹牢，然后提升载物台，使其物镜下端接近标本片。

5、调焦 双眼移向目镜，提升粗调节螺旋，当发现模糊的物像时，可以调节细螺旋（微调），使物像清晰为止。

6、低倍镜观察后，转动物镜转换器，换用高倍镜观察，这时只用轻轻调节微调就可观察到清晰的物像。进行观察和绘图。

7、转换油镜观察时，首先加一滴香柏油于细菌染色片上，下降镜筒，将油镜浸入油中（操作时应从侧面仔细观察，避免镜头撞击载片），其调焦与观察同上。

8、 用毕后的处理 下降载物台，取下标本；用擦镜纸擦目镜和物镜，并用柔软的绸布擦拭机械部分；油镜使用完毕后，先用擦镜纸揩去香柏油，再用另一张蘸有少许酒精的擦镜纸去除残留的油之后，再用干净的擦镜纸揩干；最后将物镜转成“八”字形。

（二）细菌形态观察

1. 结合显微镜使用，观察三个细菌染色片并绘图。

2. 看示范镜，观察细菌、葡萄球菌、伤寒杆菌、四联球菌和炭疽芽孢杆菌装片。

（三）细菌运动性观察

有些细菌具有鞭毛可在水中自由运动。细菌运动常用水浸片法和悬滴法观察。

1. 水浸片法：用接种环取培养12h~18h的枯草杆菌菌液一环，置于干净的载玻片中央，盖上盖玻片，用低倍境找出目标后，再换用中倍至高倍镜观察。

2. 悬滴法：取一洁净的盖玻片，用牙签挑取少量凡士林，涂于盖玻片四角；再按无菌操作要求，用接种环从下面底部取培养12~18h的枯草杆菌菌液一环，置盖玻片中央（菌液呈水珠状）；接着取凹玻片一块，将凹窝向下覆盖在带有菌液的盖玻片上；翻转凹玻片，使液滴悬于盖玻片表面。悬滴片制成后，先用低倍境找到水滴，再换用高倍镜观察。

五、思考题

杆菌（放大100*10）

葡萄球菌（100*10）

球菌（放大100*10）

炭疽芽孢杆菌（100*10）

螺旋菌（放大100*10）

钾细菌（100*10）

四联球菌（100*10）

伤寒杆菌（100*10） 1、使用显微镜的油镜时,为什么必须使用镜头油?

当使用普通高倍或低倍物镜时，透镜的孔径较大，所以射入物镜的光线因为折射而损失的比率不高，对观察影响不大。但油镜由于需要放大更高的倍数，其镜孔径很小，射入的光线很少，视野不明亮，物象模糊不清。加油的目的就是让油镜与载物玻片之间加一层与玻璃折光率相近的香柏油介质，使通过的光线不产生或少产生折射，增加进入透镜的光线，使视野亮度增加，能更清楚的观察物象。

2、简述芽孢、鞭毛、荚膜的染色原理。

芽孢：利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和性不同，采用复合染色法可以区分细菌的芽孢和菌体 由于芽孢壁厚通透性低，着色和脱色均较困难，因此如果在加热条件下，先用一种弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件下染色，使染料进入菌体和芽孢，菌体中的染料可经水洗洗脱，而进入芽孢的染料则难以透出，再用复染液处理，从而使菌体和芽孢呈现不同的颜色，便于区别。

荚膜：是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质。由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以通常用衬托染色法(负染色法)染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，从而在菌体周围形成一透明圈。

3. 镜检标本时，为什么先用低倍境观察，而不直接用高倍镜或油镜观察？

用低倍境观察，视野较广，焦深较大，便于搜寻目标，因此适宜从低倍境开始观察。