白术与苍术及其混伪品DNA条形码鉴定研究

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白术与苍术及其混伪品DNA条形码鉴定研究

作者：余亚东 石林春 马晓冲 孙伟 叶萌 向丽

来源：《中国中药杂志》2014年第12期

[摘要]药材白术与苍术为苍术属植物，为常用健脾之要药，但二者功效不完全相同，古代对二者未进行区分，现代用药也容易将其混用，为了确保用药安全，该文采用ITS2序列对药材白术与苍术及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究。白术与苍术的3个基原物种（苍术、关苍术和朝鲜苍术）ITS2序列均为229 bp。13条白术的序列仅在98 bp处有C-G变异，平均GC含量为69.42%；4条苍术序列无变异位点；关苍术与朝鲜苍术的种内最大K2P距离均为0.013。白术、苍术、关苍术和朝鲜苍术种内最大K2P距离均小于与混伪品的种间最小K2P距离。邻接（NJ）法构建的系统聚类树，白术、朝鲜苍术序列能各自聚为一支，关苍术与苍术聚为一支，但都能与混伪品明显分开。ITS2序列在药材白术与苍术及其混伪品的鉴定方面具有很好的鉴别效果。

[关键词]白术；苍术；混伪品；DNA条形码

白术与苍术均为常用大宗类药材，均能健脾、燥湿，治疗脾失健运、湿浊中阻[1]。但白术偏重于补气健脾，宜于脾虚湿阻者；苍术苦温燥湿力强，宜于寒湿阻滞中焦而脾虚不明显者。由于二者同为菊科苍术属Atractylodes DC.植物，功效及在名称上的相似，造成苍白二术容易混用。《中国药典》2010年版规定白术来源为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎；苍术的来源为菊科植物茅苍术A. lancea （Thunb.） DC.或北苍术A. chinensis

（DC.） Koidz.。北苍术作为一个混杂的商品概念包括了关苍术A. japonica Koidz. ex Kitam.和朝鲜苍术A. coreana （Nakai） Kitam.[2]。

目前市场上二者常见的混伪品包括菊三七Gynura japonica （Thunb.） Juel.、土木香Inula

helenium L.、云木香Saussurea costus （Falc.） Lipech.以及毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora

Pall.的根茎[3-4]。由于药材形态特征有限，难以从外观上进行快速准确的鉴定，容易造成混用，影响用药安全。

DNA条形码鉴定技术因其通用、快捷等优势一经提出便得到了广泛的关注[5-8]，尤其对于缺失遗传背景信息的中药材样品具有较好的鉴定能力[9]。Chen等对753个属4 800种植物超过6 600条ITS2序列进行分析，发现ITS2序列在种级水平上具有较高的分辨率[10-11]，在蔷薇科、卷柏科的药用植物鉴定中得到了很好的验证[12-13]。国家药典委员会也讨论通过了在《中国药典》增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[14]。DNA条形码鉴定技术已经在药材冬虫夏草、枸杞、羌活、党参等[15-20]药材及其混伪品的鉴定中取得了良好的效果，在植物的龙源期刊网

检验检疫、药材市场监督以及法医鉴定等诸多方面也得到了很好的应用[21-22]。本研究对白术与苍术及其主要混伪品进行DNA条形码的鉴定研究，确保白术与苍术的用药安全。

1 材料

本文收集了白术、苍术、关苍术、朝鲜苍术及5种混伪品的基原植物及药材共51份样本（表1）。所有样本均经过中国医学科学院药用植物研究所林余霖教授鉴定。因其根茎不发达而不作药用的同属植物鄂西苍术A. carlinoides （Hand.-Mazz.） Kitam.的3条ITS2序列来源于Genbank。

2 方法

取药材样本约50 mg，去除表皮取其中间部分，用高通量组织球磨仪50 Hz频率研磨2

min后，核分离液洗涤3次（800 μL/次），去上清液，留沉淀，再采用植物组织DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取药材总DNA。

PCR扩增：ITS2正向引物ITS2F（5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′），反向引物ITS3R（5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′），反应体系25 μL，包括2×Taq PCR

MasterMix 12.5 μL，正反向引物各1 μL，DNA模板2～3 μL，其余体积以ddH2O补充。反应条件为94 ℃变性5 min；再进行40个循环的94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45

s；最后72 ℃延伸10 min[23]。

PCR产物取4 μL，以0.5×TBE为电泳缓冲液进行凝胶电泳，成功扩增的产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行双向测序。

测序峰图使用CodonCode AlignerV 3.7.1进行质量校对与拼接，将所得序列基于隐马尔科夫模型的HMMer注释方法在ITS2 database网站（http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）进行注释。

将所有获得的ITS2序列用MEGA5.0进行序列分析比对，再基于K2P模型对种内及种间遗传距离进行分析，用邻接（NJ）法构建系统聚类树，各个分支的支持率使用bootstrap重复1

000次进行检验。

3 结果与分析

3.1 DNA提取及PCR扩增效率 本实验采用核分离液洗涤后，能除去细胞核中大部分的多糖、多酚，提高DNA纯度，51份样本均能成功提取DNA。通用引物ITS2F/3R对本实验涉及的9种药材及原植物均有较高的扩增效率，PCR扩增效率为100%，PCR产物电泳呈清晰明亮龙源期刊网

的单一条带。双向测序峰图质量较好，测序成功率为100%，经拼接、剪切后能得到高质量的ITS2序列。

3.2 种内、种间变异分析 13条白术的序列中，ITS2序列长度为229 bp，仅在98 bp处有C-G变异，平均GC含量在9个物种中最高，为69.42%，种内最大K2P距离为0。药材苍术的3个基原物种中，苍术、关苍术和朝鲜苍术ITS2序列长度均为229 bp，平均GC含量在68.27%～69.00%，除低于白术外，均高于其余5个物种。白术和苍术3个基原物种的ITS2序列均无碱基插入。4条苍术序列在本试验中未发现变异，种内最大K2P距离为0。3条关苍术序列存在4个变异位点；8条朝鲜苍术序列存在的3个变异位点均为信息位点。关苍术与朝鲜苍术的种内最大K2P距离均为0.013，鄂西苍术、云木香、土木香、菊三七和芍药种内最大K2P距离分别为0.013，0.013，0.004，0.009，0.004。

9个物种的序列长度在223～229 bp，比对后序列长度为234 bp。白术与其混伪品间种间K2P距离在0.020～0.423，白术与朝鲜苍术之间种内K2P距离最小，为0.020。白术的最大种内距离小于与混伪品之间的最小种间距离，表明白术能与混伪品进行明显的区分。苍术、关苍术和朝鲜苍术与其余物种种间K2P距离分别在0.010～0.389，0.010～0.399，0.020～0.399，除关苍术外，苍术与朝鲜苍术的最大种内距离小于与其余物种之间的最小种间距离（表2）。

3.3 种间ITS2序列聚类分析 基于得到的54条ITS2序列，以邻接（NJ）法构建系统聚类树（图1）。13条白术序列单独聚为一支，bootstrap支持率为96%，与其余物种间能明显分开。药材苍术的3个基原植物，除关苍术外也都能各自聚为单独的一支。关苍术因其种内变异较大，未能聚为单独的一支。

4 讨论

白术与苍术为我国传统常用大宗药材，具有悠久的应用历史。梁代陶弘景以前，“术”未分白术与苍术[24]，药用记载最早见于战国时期《五十二病方》[25]，《神农本草经》将“术”列为上品[26]。宋、明以后的本草著作和医药学家认为“术即白术”[27]，白术与苍术均有健脾燥湿的功效，但白术补脾，以健脾益气为主；苍术运脾，以苦温燥湿为主，二者在功效上有所差异[28]。张建逵等[24]通过对本草文献的查阅与考证后认为：苍术、白术之分，明确于唐代蔺道人，阐明于宋代寇宗奭。白术与苍术及其混伪品间混用，会严重影响白术与苍术的用药安全，例如，伪品之中菊三七具有毒性，近年来有用药错误致人死亡的报道，因此，运用分子鉴定手段将白术与苍术及其混伪品鉴定分开十分必要。

《中国药典》2010年版规定苍术的来源有2个，一为茅苍术A. lancea，一为北苍术A.

chinensis，从其拉丁名看，茅苍术就是指苍术这个物种，北苍术的拉丁名现在已无法在植物志上检索到这个物种。日本分类学家认为北苍术为苍术的一个变种，也得到了我国学者的认同[29]。根据目前《中国植物志》中描述，北苍术实为一个混杂的商品总称，它不仅包括苍术本种，而且也包括北方产的苍术属的其他种类，如关苍术，生长于辽宁、山东等地的朝鲜苍术也龙源期刊网

包括在内。在《Flora of China》中，已将关苍术与苍术合并，本文中关苍术与苍术的最小种间K2P距离为0.10，

小于关苍术最大种内K2P距离0.013，在NJ树中能共同聚为一支，该结果与Flora of

China中的分类一致。《中国药典》2010年版仍沿用较早文献对苍术的分类，对苍术来源的规定已经造成了重叠与混淆，需要进一步的更新与规范。但是，通过建立的NJ树图可以看出，苍术的3个基原物种（苍术、朝鲜苍术、关苍术）依然可以和白术、鄂西苍术明显分开，表明ITS2序列对药材苍术有较好的鉴定效果。

目前对于白术、苍术的鉴定使用的主要是性状、粉末显微特征以及薄层色谱的方法[30]。本文采用的ITS2序列较短，药材白术和苍术均为223～229 bp，而且DNA的提取、PCR扩增较为容易，即使是对于放置时间较长，DNA在一定程度上降解的样本仍能有很好的提取及扩增效率。本实验取得的13条白术序列中，不同时间不同批次送测的白术序列，所有峰图在98 bp处均为C-G套峰状况，故据此推断，在此处为白术ITS2序列中的一个SNP位点，除此之外在13条序列中尚未发现变异位点。NJ树中，白术和苍术及其混伪品都能很好的各自聚为一支，与其混伪品能明显分开，除关苍术因较大的种内变异未能聚在一起外，其余植物均能以较高的bootstrap支持率各自聚为一支。因此，ITS2序列对药材白术、苍术及其混伪品均具有较好的鉴定效果，DNA条形码分子鉴定技术的应用，将有效的避免用药安全问题。

[参考文献]

[1]中国药典. 一部[S]. 2010：95.

[2]中国科学院中国植物志编委会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1987.

[3]朱海涛，肖琴，陶平德，等.白术及其混伪品的鉴别检索[J].时珍国医国药，2007，18（12）：3084.