Box-Behnken中心组合设计法优化达卡巴嗪脂质体制备工艺

第３２卷第４期　２０１１年Ｏ８月　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈ　长春工业大学学报（自然科学版）　Ｖｏ１．３２　ＮＯ

．４　

１　！！　！　！　ｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　Ａｕｇ．２０１　ｌ　

Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ中心组合设计法优化　达卡巴嗪脂质体制备工艺　

程桂茹，　王淑娟，　邹　岩，　张　龙　（长春工业大学化学工程学院，吉林长春　１３００１２）　

摘　要：优化达卡巴嗪脂质体的制备工艺并对其形态及体外释放进行研究。根据Ｂｏｘ—　Ｂｅｈｎｋｅｎ的中心组合实验设计原理设计实验，以包封率、外观形态、体外释放为指标优化脂质　体制备工艺。脂质体包封率为９４．２Ｏ　，比预测高０．０２％，脂质体粒径在２０～５Ｏ　ｍ。制得的　脂质体的体外释放具有突释和缓释特点。预测工艺条件与实际工艺条件之间具有较好的拟合　厦，Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ中心组合设计可以应用于达卡巴嗪脂质体工艺条件的筛选。　关键词：达卡巴嗪；脂质体；包封率；Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ中心组合设计　中图分类号：ＴＱ４６０．６　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７４—１３７４（２０１１）０４—０３４８—０６　

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ　ｌ　ｉｐｏｓｏｎｅｓ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎ　

ＣＨＥＮＧ　Ｇｕｉ—ｒｕ，　ＷＡＮＧ　Ｓｈｕ—ｊ　ｕａｎ，　ＺＯＵ　Ｙａｎ，　ＺＨＡＮＧ　Ｉ　ｏｎｇ　（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００１２，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ＤＴＩＣ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｓｈａｐｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　ｗｅ　ｈａｖｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，ｗｉｔｈ　ｉｎｄｅｘｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ａｐｐｅａｒａｎｃｅ，ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｒｅｌｅａｓｅ．Ｔｈｅ　Ｒｅｓｕｈｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｉｓ　９４．２０　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　０．０２　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｓｉｚｅ　ｉｓ　ｉｎ　２Ｏ～５０“ｍ．Ｗｅ　ｃｏｍｅ　ｔｏ　ａ　ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ａｒ　ｂｏｔｈ　ｔｈｅ　ｂｕｒｓｔ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｎｄ　ｓｕｓｔａｉｎｅｄ—ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅ．ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｉｓ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｔｏ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅａ１．Ｔｈｅ　Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎ　

ｃａｎ　ｂｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ＤＴＩＣ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ；ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ；ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ；ｔｈｅ　Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ　ｃｅｎｔｅｒ—ｕｎｉｔｅｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎ．　

０　引　达卡巴嗪（ＤＴＩＣ），化学名称为５－（３，３二甲　基一１一三氮烯基）一４一酰胺基咪唑枸橼酸盐，是一种　

新型抗肿瘤药物，临床用于恶性黑色素瘤的治疗，　对肺鳞癌和未分化癌、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤等亦　有一些治疗作用　，但由于达卡巴嗪遇光或热易　变化，在水中不稳定，限制了它的使用。如将　

收稿日期：２０１０—１２　０５　作者简介：程桂茹（１９６７一），女，汉族，吉林长春人，长春工业大学实验师，主要从事药物制备方向研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｇｇｕｉｒ　＠ｍ　ｌ　ｃｃｕｔ・ｅｄｕ－ｃｎ．＊联系人：张；／￣ｉ（１９６３一），男，汉族，吉林长春人，长春工业大学教授，博士，主要从事药物制备方向研究　Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｌｏｎｇｚｈｌ＠１６３．ｅｏｍ．　第４期　程桂茹，等：Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ中心组合设计法优化达卡巴嗪脂质体制备工艺　３４９　ＤＴＩＣ包封在脂质体中，不仅扩大了ＤＴＩＣ的使　用范围，而且提高了疗效。脂质体作为药物载　体，可以减小药物剂量，降低药物的毒性，减小副　作用，具有靶向性［４　］。文中采用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ　中心组合设计　，响应面分析法优化ＤＴＩＣ脂质　体制备工艺条件，为更好地应用ＤＴＩＣ提供了理　论依据。　１　材　料　１．１药品与试剂　ＤＴＩＣ，长春一心药业公司；　大豆卵磷脂，天津市光复精细化工研究所；　胆固醇，天津市光复精细化工研究所；　三氯甲烷，天津天泰精细化学品有限公司；　磷酸氢二钠，天津市福晨化学试剂厂；　磷酸二氢钠，北京化工厂。　１．２仪器　ＵＶ７５４Ｎ型紫外分光光度计，上海精密科学　仪器有限公司；　ＡＬｌ０４型电子天平，梅特勒一托利多仪器有限　公司；　２０３型旋转蒸发器，上海豫康科教仪器设备　有限公司；　ＫＱ３２００型超声波清洗器，昆山市超声仪器　有限公司；　ＪＸＡ８４０型透射电子显微镜，日本ＪＥＯＬ公　司；　ＴＨＺ一８２型汽浴恒温振荡器，江苏金坛市金　城国盛实验仪器厂。　２　方　法　２．１　ＤＴＩＣ含量的测定　２．１．１　紫外最大吸收波长测定　配制０．５　ｍｇ／ｍＬ的ＤＴＩＣ磷酸盐缓冲液　（ｐＨ值７．４，简称ＰＢＳ）的标准液，并稀释至　０．０２　ｍｇ／ｍＬ，在紫外光区（ＵＶ）与可见光区　（ＶＩＳ）作全波长扫描１９０￣５００　ｎｍ，确定最大吸收　的波长为３２０　ｎｍ。　２．１．２标准曲线　精密称取２５　ｍｇ　ＤＴＩＣ用ＰＢＳ溶解，并用　５Ｏ　ｍＬ容量瓶定容，配成０．５　ｍｇ／ｍＬ的标准液。　用取液器分别量取０．１，０．２，０．４，０．６，０．８，１．０和　１．２　ｍＬ于５０　ｍＬ容量瓶中，再用磷酸盐缓冲液　定容，其浓度分别为０．０００　５，０．００４，０．００８，　０．０１２，０．０１６，０．０２０　ｍｇ／ｍＩ　。以磷酸盐缓冲液　为空白，在最大吸收波长下测定吸收值，将药物浓　度与吸光度进行直线回归，得回归方程：　Ｙ一８８．１４Ｘ＋０．００５　０（ｒ一０．９９８　９）　２．２脂质体的制备　采用逆相蒸发法：将适量的磷脂与０．１２５　ｇ　胆固醇溶解在适量的氯仿中，再将０．０１　ｇ　ＤＴＩＣ　溶解在适量ＰＢＳ中，将上述溶液于旋干瓶中混　合，水浴超声，减压蒸发除去有机溶剂，达到胶态　后，滴加５　ｍＬ磷酸盐缓冲液，旋转帮助器壁上的　凝胶水化脱落，然后在减压下继续蒸发，制得水性　混悬液，通过透析除去未包封的药物，即得到　７　ｍＬ大单层脂质体。　２．３脂质体包封率的测定　分别取１　ｍＬ　ＤＴＩＣ脂质体及空白脂质体装　入透析袋内，置于盛有４０　ｍＬ　ＰＢＳ的烧杯内，磁　力搅拌，透析２　ｈ。取透析液按药物含量测定中　所述的采用紫外分光光度法测定，计算出游离药　物的含量ｌ７　］。　包封率一越｝　。％　

（１）　２．４响应面实验设计　在单因素实验的基础上，选择对包封率影响　较为显著的３个因素作为考察对象，即大豆卵磷　脂与胆固醇质量比（Ｘ　），水浴超声时间（Ｘ　），　ＰＢＳ体积（Ｘ。），根据单因素试验结果以及在最高　或最低水平时制备ＤＴＩＣ脂质体的可行性，综合　选择各因素的水平。　因素及水平的设计见表１。　

表１实验因素水平表　３５Ｏ　长春工业大学学报（自然科学版）　第３２卷　２．５形态学研究　取少量ＤＴＩＣ脂质体制剂加蒸馏水稀释，超　声波分散，再滴至专用铜网上，自然挥发，使粒子　在铜网上浓缩沉积，用透射电子显微镜观察并照　相。　２．６脂质体的释药性曲线　取１　ｍＬ　ＤＴＩＣ脂质体和空白脂质体装入透　析袋内，置于５０　ｍＩ　磷酸盐缓冲液中透析，同时　取１　ｍＩ　ＤＴＩＣ脂质体溶液（１６　ｍｇ／ｍＬ）于透析袋　中，在５０　ｍＩ　磷酸盐缓冲液中同时透析以做对　比，透析温度（３７－０．５）℃，于气浴振荡器中进　行，定时取样１Ｏ　ｍＬ，同时补加１Ｏ　ｍＬ磷酸盐缓　冲液，采用紫外分光光度计测定不同时间透析液　中药物的含量。　

３结果与讨论　３．１响应面分析　根据Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ中心组合设计原理，以　ｘ　，ｘ。，ｘ。这３个因素为自变量，以脂质体的包　封率为响应值，做３因素３水平的响应面分析设　计实验，所需实验次数为１２次。为了考察实验误　差的大小，将中心点的实验重复进行了３次，实验　设计与结果见表２。　利用Ｍｉｎｉｔａｂ软件对表２数据进行多元回归　拟合，得到ＤＴＩＣ脂质体的包封率对大豆卵磷脂　与胆固醇用量比、超声时间、ＰＢＳ用量的二次多　项回归模型为：　

表２　ＤＴＩＣ脂质体的试验设计与试验结果　试验号　Ｘｔ　Ｘｚ　脂质体包封率／　

ｙ一９．２０３　３＋０．４５５　０Ｘ１—０．００１　３Ｘ２—　０．０３３　８Ｘ３一ｉ．３６１　７Ｘ｝一０．７７４　２Ｘ；一　０．５６４　２Ｘ；＋０．３４２　５Ｘ１　Ｘ２—　０．１４７　５ＸｌＸ３—０．００５　０Ｘ２Ｘ３　（２）　对该模型进行显著性检验，回归模型方差分　析结果见表３。　

表３　ＤＴＩＣ脂质体包封率的回归模型方差分析　来源　自由度　Ｓｅｑ　ＳＳ　Ａｄｊ　ＳＳ　Ａｄｊ　ＭＳ　Ｆ　Ｐ　是否显著　回归　线性　平方　交　：作用　残差误差　失拟　纯误差　

ｌ１．３６４　７　１．６６５　３　９．１４３　０　０．５５６　３　Ｏ．Ｏ９６　２　Ｏ．Ｏ５７　０　０．０３９　３　１１．３６４　６９　１．６６５　３３　９．１４３　０２　Ｏ．５５６　３５　Ｏ．０９６　２４　Ｏ．Ｏ５６　９８　Ｏ．Ｏ３９　２７　１．２６２　７４　Ｏ．５５５　１１　３．Ｏ４７　６７　Ｏ．１８５　４５　Ｏ．０１９　２５　０．Ｏ１８　９９　Ｏ．Ｏ１９　６３　６５．６Ｏ　２８．８４　１５８．３３　９．６３　

Ｏ．９７　

Ｏ．ＯＯ１　０．００１　０．０００　Ｏ．Ｏ１６　

是　是　是　否　

０．５４５　否　合计　由表３可知，Ｐ一０．００１＜０．０１，表明回归模　型显著；Ｆ＝０．９７＞０．０５，Ｐ一０．５４５＞０．０５，不显　著；复相关系数尺为０．９９７　９５，说明该模型拟合　

程度良好，试验误差小，可以用此模型来分析和预　测ＤＴＩＣ脂质体的制备工艺结果。　回归模型系数显著性检验结果见表４。　

９　６　９　３　９　５　０　７　８　Ｏ　４　４　９　６　６　９　２　１　８　７　９　９　４　７　９　８　９　Ｏ　１　３　１　２　１　２　１　２　１　２　２　２　２　２　４　４　４　Ｏ　Ｏ　Ｏ　０　１　１　１　ｌ　１　１　ｌ　ｌ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　一　一　一　一　１　ｌ　ｌ　１　Ｏ　０　Ｏ　Ｏ　１　ｌ　１　ｌ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　一　一　一　一　１　１　１　１　１　１　１　１　Ｏ　０　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　一　一　一　一　２　３　４　５　６　７　８　９　¨　ｎ