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各种酶活力测定方法及注意事项

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碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。

其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。

以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法以下是方法碱性蛋白酶的测定方法参考GB/T 23527-2009 附录B中福林酚法进行，即1个酶活力单位（U/mL）定义为1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5条件下反应1 min水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。

2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表2-6配制。

表2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（μg/mL）取100 μg/mL酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各1.00 mL，各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL，福林试剂使用液1.00 mL，置于40 ℃± 0.2 ℃水浴锅中显色20 min，用分光光度计于波长680 nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸浓度C为横坐标，绘制L-酪氨酸标准曲线。

图2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或用回归方程计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数K 值。

其K值应在95-100范围内。

上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。

2.2.6.2 测定方法（1）计算方法X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1）式中，X —样品的酶活力，μ/g；A —样品平行实验的平均吸光度；K —吸光常数；4 —反应试剂的总体积，mL；10—反应时间10 min，以1 min计；n —稀释倍数。

（2）测定方法①先将干酪素溶液放入40 ℃± 0.2 ℃恒温水浴中，预热5 min。

②按下列程序操作，进行测定。

于680 nm波长，用10 mm比色皿测其吸光度。

角蛋白酶活力的测定1、角蛋白酶活力测定方法试剂和溶液：a. 硼酸缓冲溶液（pH 10.5）：称取硼酸钠9.54 g ，氢氧化钠1.6 g ，加水至900 mL ，搅拌均匀。

用1 mol/L 盐酸溶液或0.5 mol/L 氢氧化钠溶液调整pH=10.5±0.05，试管A （空白） 试管B （样品）酶液1.00 mL 预热2 min酶液1.00 mL 预热2 min三氯乙酸2.00mL 混匀 保温10 min干酪素1.00 mL混匀 保温10 min干酪素1.00 mL混匀 三氯乙酸2.00 mL混匀10000 r/min 离心2 min10000 r/min 离心2 min滤液1.00 mL 加碳酸钠溶液5.00mL 滤液1.00 mL 加碳酸钠溶液5.00 mL加福林试剂1.00 mL显色20 min加福林试剂1.00 mL显色20 min定容至1000 mL。

b.硼酸缓冲溶液（pH 9.5、11.5）：称取硼酸钠9.54 g，加水至800 mL，用氢氧化钠溶液调整pH=9.5±0.05或pH=11.5±0.05，定容至1000 mL。

c.10%三氯乙酸：10 g三氯乙酸，加水至100 mL。

d.0.5%羊毛角蛋白溶液：取0.5g羊毛角蛋白加入100ml硼酸缓冲液溶解测定方法：取1 mL酶液（0.1 g酶粉用对应pH缓冲液溶解离心，取上清液适当稀释），取4支具塞试管中，空白加1mL酶液、2 mL 0.5%羊毛角蛋白溶液（pH10.5、硼酸缓冲液溶解）、2 mL 10 %三氯乙酸，对照加入1ml酶液和2ml角蛋白溶液，在40℃恒温水浴锅中反应1 h后对照加2 mL 10 %三氯乙酸终止反应，在10000 r/min离心10 min，取上清液，过滤，在280 nm处测吸光度。

（使用石英比色皿）酶活定义：1 ml/1 g酶在该反应体系下对照相对于空白样A280nm吸光每升高0.01为1 unit（U）。

X=(A280-A0)×100×NN为稀释倍数胶原蛋白酶活力的测定标曲的绘制取11支试管分别标号，向每支试管中分别加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL 的0.75umol/ml 的标准甘氨酸溶液，并用水补足至0.5 mL，各加入0.5 ml乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）充分混合，最后加入0.5m L 茚三酮显色液，充分混合。

用试管盖盖住，在100℃下水浴加热10 min，冷却放置10min，加入4.5 mL乙醇（60%，v/v）进行稀释，在570nm 下比色。

吸光值与甘氨酸浓度标准曲线y=1.2122x+0.0135酶活X=55.7359×N×(OD-0.0135)酶活力测定发酵粗酶液12000rpm/min离心10分钟取上清（固体酶粉酶活测量时，取酶粉取0.1 g，加入适当硼酸缓冲液（pH 10.5）溶解并在旋涡混匀器混匀3 min直至无明显固体团,并用硼酸缓冲液（pH 10.5）适当稀释一定倍数，分别取0.5 mL 稀释后的酶液于4支试管中，将所需I 型胶原和酶液于37℃下保温五分钟，然后向空白样中加入0.5 mL的Ι型胶原（5 mg/mL，底物溶于水中）和0.5 ml的TCA，对照样中加入0.5 ml I型胶原，混匀，37 ℃，40 min，之后对照中加入0.5 mL 0.4 M的三氯乙酸终止反应。

取1 ml反应后的液体于12000rpm/min离心2min，取上清0.5 mL，加入0.5ml乙酸-乙酸钠缓冲液（2 mol/L，pH 5.4），最后加入0.5 ml 1%的茚三酮显色液，将试管封塞混匀，于100 ℃下水浴加热10 min，冷却10min，加入4.5 ml60%乙醇稀释于570nm以空白为零测定吸收值。

根据甘氨酸标准曲线计算出酶活力大小。

酶活力定义：37 ℃，pH 7.5条件下，每分钟每毫升发酵液水解胶原产生1 μg 甘氨酸为一个酶活力单位。

（1）三氯乙酸溶液（0.4 mol/L）：准确称取三氯乙酸65.4 g，用水溶解并定容至1000 mL。

（3）氢氧化钠溶液（0.5 mol/L）：称取20 g NaOH，用水溶解并定容至1000 mL。

（4）60%乙醇：量取无水乙醇60 mL 加水定容到100 mL，待用。

（5）Ι型胶原溶液：取500 mg I型胶原溶于100 mL磷酸缓冲液（pH 7.5）中，4 ℃避光保存。

（6）0.75 μmol/mL甘氨酸标准液：称取0.2252 g甘氨酸溶解后定容到100 mL 得到30 umol/ml的甘氨酸溶液，之后取0.5ml加4.5 ml水混匀稀释10倍，再从混匀后的溶液中取3 ml加入9 ml水混匀稀释4倍，得到0.75 umol/ml的甘氨酸标准溶液。

（7）茚三酮显色液：称取0.85 g茚三酮二水与0.15 g还原茚三酮二水溶于90ml乙二醇单甲醚，定容100ml。

（8）2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.4）：82.7 mL 2 mol/L乙酸钠与17.3 mL 2 mol/L乙酸混匀。

（9）2 mol/L乙酸钠溶液：称取82 g无水乙酸钠溶于500 mL水中。

（10）2 mol/L乙酸：量取12.01 g冰乙酸加水定容至100 mL。

弹性蛋白酶活力的测定采用Sacher3方法并参照中国现行药用弹性蛋白酶测定方法进行。

称取10 mg刚果红-弹性蛋白于试管中，加2 mL pH值7.4、0.2 mol/L硼酸缓冲液，取1 mL适当稀释酶液(固体酶粉酶活测量时，取酶粉取0.5 g，加入10 ml硼酸缓冲液溶解震荡溶解2 min，12000rpm/min 离心2 min，用硼酸酸缓冲液（pH 7.4）适当稀释一定倍数)于37 ℃下振荡反应20 min，加入pH值6.0、0.2 mol/L 磷酸钠缓冲液2 mL终止反应，离心过滤后取上清液测495 nm光密度，以不加酶液和底物的反应系统为空白。

在此反应条件下溶解1 mg刚果红-弹性蛋白底物所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活性单位（U）。

参照Sacher方法绘制弹性蛋白酶标准曲线.y=0.2109x（mg/ml）X=1.1854xODxN（1）0.2M硼酸缓冲液(pH 7.4)：取19.07 g硼砂（Na2B4O7·10H2O, MW 381.37）溶于水定容1 L，配置成A液，取12.37 g硼酸（H3BO3 ,MW 61.83）溶于水定容1 L，配置成B液，取两种液体以A:B=1:9的比例混合并适当调节pH至7.4。

（2）0.2 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH 6.0）: 0.2M磷酸缓冲液（pH 7.5）：取71.63 g十二水磷酸氢二钠溶于水并定容1L水中，配置成A液，取7.8 g二水磷酸二氢钠溶于水并定容于250 ml水中，配置成B液，A液与B液以比例混合，并用适当的A液和B液适当微调pH至pH 6.0以下说说我在碱性蛋白酶活力测定过程中出现的问题和解决方法首先我在多次测定碱性蛋白酶酶活力的过程中发现样品酶活力差异较大，甚至同一个样品酶活力也有20%-240%的大小差异，这使得我陷入思考，为什么会这样，我经过多次测定酶粉时的碱性蛋白酶活力发现同一个样品在不同稀释倍数下有不同的OD值，理论上讲同一个样品不管怎么稀释，只要OD在0.2-0.8范围内时应该根据酶活力计算公式X=4*A*N*K/10计算的结果应该无显著差异的，但是结果与预料中的不一致，以下是我选取一个碱性蛋白酶样品的酶粉，稀释不同的倍数，呈现不同的OD值，最后计算的酶活力，根据计算，发现其中的规律。

首先是同一个样品在不同的稀释倍数下的OD变化2000400060000.00.20.40.60.8ANXA 代表的OD680的对照对于空白的吸光值，X 代表了碱性蛋白酶的酶活力，理论上随着稀释倍数增大，酶活力应该不会变化太大，结果却显示发现随着稀释倍数增大酶活力先增大后趋于稳定。

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淀粉酶活力的测定方法

淀粉酶活力的测定方法

淀粉酶活力的测定方法淀粉酶是一种能够降解淀粉的酶类。

测定淀粉酶活力的方法主要有光密度法、滴定法、浊度法、电极法等。

下面将详细介绍这几种方法。

一、光密度法光密度法是利用淀粉酶在一定温度和pH值条件下降解淀粉产生的葡萄糖，与p-二硫化苯胺生成的被称为多脱氧萘酚蓝的有色物质在特定波长下的吸光度变化来测定淀粉酶活力。

测定步骤：1. 准备试剂：液体缓冲液、淀粉溶液、pH 7.0缓冲液、2%～4%淀粉溶液、0.1% p-二硫化苯胺、1%酶液。

2. 在试管中加入2 mL pH 7.0缓冲液、2 mL 2%～4%淀粉溶液和1 mL 酶液，置于37恒温槽中培养10分钟。

3. 取出试管后，立即加入5 mL p-二硫化苯胺试剂和1 mL液体缓冲液，混匀后，放置15分钟使产生的多脱氧萘酚蓝发色充分。

4. 测定吸光度：使用特定波长的光源（通常为540 nm）对反应液进行吸光度测定。

5. 用纯水代替酶液重复上述步骤，结果作为对照组。

6. 计算淀粉酶活力：对照组的吸光度减去实验组的吸光度，乘以吸光度系数K （由标准淀粉酶活力校准得出），即可得出淀粉酶的活力。

二、滴定法滴定法是通过滴定试剂滴定淀粉酶产生的葡萄糖来测定淀粉酶活力的方法。

测定步骤：1. 准备试剂：碘滴定剂（0.02 mol/L碘酸钾，0.2 mol/L硫酸），0.1 mol/L氢氧化钠溶液，0.1%淀粉溶液。

2. 取一定量的淀粉酶加入试管中。

3. 预热培养：将试管放置于37水浴中预热，约5分钟。

4. 添加滴定剂：将试管中的淀粉加入10 mL淀粉溶液中，迅速搅拌。

5. 滴定：在反应时加入少量滴定剂，然后滴定到反应性红色消失的那一点为止。

6. 计算淀粉酶活力：滴定所使用的硫酸溶液的体积与滴定所使用的碘滴定剂的体积之间的比值即为滴定效价，根据滴定效价计算淀粉酶的活力。

三、浊度法浊度法是通过测定淀粉酶降解淀粉导致溶液浑浊度变化来测定淀粉酶活力的方法。

测定步骤：1. 准备试剂：0.1 mol/L淀粉溶液，0.1 mol/L缓冲液，1%淀粉酶溶液。

酶分离纯化过程中需要注意什么问题？为什么进行酶活力、酶比活力的测定-精品文档

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3.碱性溶液提取： 有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用碱 溶液提取，操作时注意pH不能过高，以免影响酶活，同时加 碱液时要一边搅拌一边缓慢加进，避免局部过碱而引起酶变 性失活。
4.有机溶剂提取： 有些酶与脂类物质结合牢固或含有较多非极性基团，可采 用与水可以混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂提取。
酶活力的测定方法
1.终点法： 测定完成一定量反应所需的时间，如α -淀粉酶的活力测定。 因为碘对淀粉呈现蓝色反应，当淀粉溶液中加入淀粉酶后，碘 的蓝色反应消失而呈现红棕色；碘对淀粉颜色反应消失的时间 可表示淀粉酶活力的大小。 2.动力学方法： 测定一定时间内所起的化学反应量。 ①比色法 如果酶反应的产物可与特定的化学试剂反应而生成 稳定的有色溶液，且生成颜色的深浅与产物的浓度在一定的范 围内有线性关系可用此法。 ②量气法 主要用于有气体产生的酶促反应。如氨基酸脱羧酶、 脲酶的活力测定。产生的二氧化碳量可用特制的仪器如瓦氏呼 吸仪测定之。根据气体变化和时间的关系，即可求得酶反应的 速度。
1.盐溶液提取： 大多数酶在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加， 即盐溶，但盐浓度不能太高，否则溶解度反而降低，即盐析。 故：一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度控制在0.020.5mol/L。如淀粉酶、蛋白酶等胞外酶0.14mol/l氯化钠溶液提 取。
2.酸溶液提取： 有些酶在酸性条件下溶解度比较大，且稳定性好，宜用 酸溶液提取。提取时需注意溶液的pH不能太低，以免酶变性失活。 如胰蛋白酶可用0.12mol/l硫酸溶液提取。
酶活回收率与酶比活力提高比
为防止酶在分离纯化过程中丧失活性。进行酶活回收率和酶比活 力提高比的测定。 1.酶活性回收率:反应提纯过程中酶活力的损失情况 总活力水收率=纯化后总活力/纯化前总活力*100% 由于酶是具有生物活性的催化物质，对反应的条件要求高，所 以反应后会由于环境的变化失活。 2.酶比活力提高比：指的是反应前后的酶比活力的比值。 酶比活力提高比=纯化后比活/纯化前比活
酶活性的测定方法

酶活性的测定方法

酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。

以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。

常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。

2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。

例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。

3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。

荧光法的灵敏度高，操作简便。

例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。

4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。

例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。

5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。

常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。

例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。

值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。

各种酶活性测定方法

各种酶活性测定方法

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。

此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。

因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。

2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。

反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。

每个处理设3 个重复。

（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。

用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。

取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。