冠心病不同阶段血清的差异蛋白质组学研究

中两医结合心脑血管病杂志２０１１年１２月第９卷第１２期．１４０９．

岛心血管病临床观察∥研究ｅ

冠心病不同阶段血清的差异蛋白质组学研究＂周倩倩．李治国，黄力擅耍：目的通过比较冠心病４个不同阶段的血清蛋白质表达的差异．寻找与冠心痛的发生发展相关的特异蛋白质。方法采

用蛋白质组学双向凝胶电泳联合质谱的技术方法对正常健康人、冠心痛中高危人群、冠心病急性期患者及冠心痛稳定期患者蛋白质组学比较研究。结果通过鉴定得到了７种差异蛋白质：视黄醇结合蛋白４（ＲＢＰ４）、栽脂蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）、栽脂蛋白Ａ１（ＡｐｏＡｌ），

ＣＤ５抗原样蛋白（ＣＤ５Ｌ）、结合珠蛋白（Ｈｐ）、血清白蛋白（ＡＬＢ）、簇连蛋白（ＣＬＵ）。结论这些与冠心病相关的差异蛋白质主要通过参与脂质代谢、炎箍反应以及氧化损伤等过程而导致动脉粥样硬化的发生。关键词：冠心病；血清蛋白质组学；视黄醇结合蛋白４中图分类号：Ｒ５４１．４Ｒ２５６．２文献标识码：Ｂ文章编号：１６７２—１３４９（２０１１）１２一１４０９一０３

Ｔ１ｌｅＤｌ邝ｅｒｅｎｔｉａ¨ｙＥｘｐｒｅｓｓｅｄ

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蛋白质组学最主要的应用之一就是生物标志物的发现，蛋白质在丰度或是形态上的改变往往与某一个特殊的生物学过程或疾病相关，这就为我们寻求冠心病的蛋白质组学生物标记物、寻找药物治疗靶点以及反映治疗效果提供了重要依据。本研究采用双向凝胶电泳联合质谱的技术方法，分别对正常人、冠心病中高危人群（但尚未发生冠心病）、冠心病急性期患者及冠心病稳定期患者四个不同阶段的血清进行了差异蛋白质组学的研究，以期寻找到与冠心病发生发展相关的蛋白质，从而为进一步阐明冠心病发病机制、寻找临床诊断和治疗的预警蛋白提供有价值的依据。１资料与方法１．１临床资料冠心病中高危人群、急性期和稳定期患者均为２００９年２月一２０１０年１１月中日友好医院中西医结合心内科门诊及住院患者，其中冠心病中、高危人群组８例，男３例。女５例，年龄（５３．Ｏ±１０．１）岁；冠心病急性期患者组８例，男５例，女３例，年龄（６７．７士８．１）岁；冠心病稳定期患者组８例，男４例，女４例，年龄（６９．５±９．８）岁。正常健康者８名，均来自北京中医药大学体检正常的健康志愿者。男３名，女５名。１．２诊断标准及纳入标准诊断符合ｗＨ０／ＩＳＥＣ于１９７９年制定的《缺血性心脏病的命名和诊断标准》。具体分组标准如下。１．２．１正常健康人群组（①组）不具备心血管病的危险因素，无糖尿病、高血压、高脂血症、肾脏疾病及外周血管病变。１．２．２心脑血管疾病中、高危人群组（②组）中危人群：１个～２１）为国家自然科学基金项目（Ｎｏ．２０７７５０９４）个危险因素，收缩压和舒张压水平＜２级高血压；高危人群：≥３个危险因素或靶器官损害或糖尿病或无其他危险因素仅３级高血压。１．２．３急性期冠心病患者组（③组）

即急性冠脉综合征

（ａｃｕｔｅｃｏｒｏｎａｒｙｓｙｎｄｍｍｅｓ，ＡＣＳ）患者，包括不稳定型心绞痛

（ＵＡ）、急性心肌梗死（ＡＭｌ）；ＡＭＩ又包括ＳＴ段抬高性心肌梗死和非ＳＴ段抬高性心肌梗死。１．２．４稳定期冠心病患者（④组）即已发生心肌缺血而目前处于稳定期的患者。包括陈旧心肌梗死．或以前曾行冠脉介入术（ＰＣＩ）或冠状动脉搭桥术后的患者。１．３实验试剂固相ｐＨ梯度干胶条（ｐＨ３—１０ＮＬ，２４ｃｍ）。ＩＰＧｂｕｆｆｅｒ均购自ＧＥ

Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司ｆ二硫苏糖醇（ＤＴＴ），

ＳＤＳ，Ｔ“ｓ等购自ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司；碘乙酰胺，考马斯里亮蓝Ｇ一２５０等购自Ａｍｒｅｓｃｏ公司。１．４实验仪器及软件ｌＰＧｐｈｏｒＴＭ等电聚焦仪（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ公司），ＥｔｔａｎＤａｌｔＴｗｅｌｖｅ垂直电泳系统（美国Ｐａｒａｆｉｌｍ公司），ＩｍａｇｅＳｃａｎｎｅｒⅢ透射扫描仪、Ｌａｂｓｃａｎ扫描控制和分析前处理软件（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ公司）。ＰＤ—Ｑｕｅｓｔ图像分析软件（Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司），ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ质谱仪（ＵｌｔｒａＦｌｅｘⅢＴＯＦ＆ＴｏＦ／ＴＯＦ，ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ公司）等。１．５实验方法１．５．１血清样本的采集及处理清晨采集各组人群外周静脉

血３ｍＩ。，３ｏｏｏｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，分离血清，一８０℃冰箱备用。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定各血清样本的蛋白浓度。

万方数据・１４１Ｏ・ＣＨｌＮＥＳＥＪ０ｕＲＮＡＩ，ＯＦＩＮＴＥＧＲＡＴｌｖＥＭＥＤｌＣＩＮＥ【）ＮｃＡＲＤＩｏ一／ＣＥＲＥＢＲ（）ＶＡｓ（１儿，ＡＲＤｌｓＥＡｓＥＤｅｆｅｍｂｅｒ２０１１Ｖ０１．９Ｎ６．１２１．５．２双向凝胶电泳第一向固相ｐＨ梯度等点聚焦（ＩＥＦ）：按ｌＰＧ—ｐｈｏｒ等电聚焦系统指南操作。将含１ｍｇ蛋白的血清样本中加入１％ＩＰＧｂｕ“ｅｒ，水合液稀释至４５０肛Ｉ，混匀上样，水化合等点聚焦在２０℃自动进行，总电压为９０ｏｏＯＶｈ。第二向垂直ｓＤｓ—ＰＡＧＥ电泳：平衡后的ＩＰ（；胶条移至１２％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ胶上端，加入ｓＤｓ电泳缓冲液，电泳条件为２５℃，２ｗ／ｇｅｌ电泳３０ｍｉｎ，然后按每块胶１７ｗ的恒功率电泳，直到溴酚蓝指示线到达凝胶底边为止。１．５．３染色电泳所得的双向凝胶电泳技术（２一ＤＥ）凝胶固定后以考马斯亮蓝Ｇ一２５０染色。１．５．４扫描及分析凝胶脱色后经ＬａｂＳｃａｎ和ＩｍａｇｅＳｃａｎｎｅｒ透射扫描，运用Ｉｍａｇｅｍａｓｔｅｒ和ＰＤ—Ｑｕｅｓｔ软件对各组凝胶图谱进行蛋白点的检测、标准化，匹配，统计学处理，找到差异表达的蛋白质点。１．５．５质谱鉴定及数据库查询质谱采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行分析，获得肽质量指纹谱（由军事医学科学院生物医学分析中心完成）．运用Ｍａｓｃｏｔ软件搜索Ｓｗｉｓ—ｓｐｒｏｔ和ＮｃＲＩｎｒ数据库。得到筹异蛋白质的相荚信息。２结果２．１各组双向凝胶电泳结果４组血清分两次进行了电泳分离。第１次３例／组，第２次５例／组，图像分析时，均以正常人群组的凝胶为参考凝胶．其他３组均分别与参考胶进行旺配，４组凝胶上的蛋白质点个数分别为１５３．６０土２７．５７、１４８．８０±２３．１５、１２０．８０士６．５７、１４６．６０±１９．９９。２．２图像分析及质谱鉴定结果经匹配分析，两次实验共获得１４个差异蛋白质点，经数据库在询共有１３个点得到阳性鉴定，整合重复鉴定的蛋白点，共得到７个有意义的蛋白质点：视黄醇结合蛋白４（ＲＢＰ４）、载脂蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）、载脂蛋白Ａ１（ＡｐｏＡｌ）、ＣＤ５抗原样蛋白（ＣＤ５Ｉ，）、结合珠蛋白（Ｈｐ）、血清白

蛋白（ＡＩ，Ｂ）、簇连蛋白（（：Ｉ，ｕ）。详见表１。表１７个差异蛋白质点

２．３各差异点在４组中表达的差异由于两次实验所用的分析软件不同，所得蛋白质点的差异表示也不同。从两次实验结果来看，所得７个蛋白质点在各组中的差异表达表现为：ＲＢＰ４和Ｈｐ在③组、④组的表达明显高于①组、②组；ＣＩ。Ｕ在②组、③组的表达高于其他两组；ＡＰ（）Ａ１在①组表达高于其他３组，ＡＬＵ在④组的表达最高；而ＣＤ５Ｌ和ＡＰＯＥ在两次实验结果中的表达存在不一致的情况。详见表２、表３。表２第１次实验所得差异点在各组表达的差异注：表达量依照增强程度分别用＋来表示．编号为蛋ｎ质点在图｝ｉ等巾的编号。注：编号为蛋白质点存罔｛普中的编号。３讨论近年来蛋白质组学技术已经有了很大的发展和进步，但是双向凝胶电泳技术仍然足蛋白质组学的基础和核心。而血清因其采集较为简便安全．因此是蛋白质组学的一个最理想的样本来源。在本实验中，发现了７种差异蛋白质。目前对ＲＢＰ４的大多数研究集中在其与肥胖Ｈ］、代谢综合征Ｌ２］、胰岛素抵抗ｆ３。及２型糖尿病＾的关系方面，也有研究发现其与心脑血管疾病相关¨“：，血清ＲＢＰ４的升高可能是动脉粥样硬化发生发展的标志ｆ７Ｊｊ，运用ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ和Ｅｌｉｓａ的方法进行血清检测发现ＲＢＰ４在心血管病人（排除２型糖尿病）血清中的表达明显高于正常人一］，另外。发现血清ＲＢＰ４在单纯冠心病患者中的表达高于非冠心病患者。而合并有２型糖尿病的冠心病患者血清ＲＢＰ４的水平又明显高于单纯冠心病患者”］。ＡｐｏＥ可与脂质及其受体结合。参与载脂蛋白的清除过程，因此．ＡｐｏＥ缺乏会导致血浆中脂质清除障碍。脂质长期在血液循环中堆积导致动脉粥样硬化发生ｎ“。在颈动脉损伤２周～５周的大鼠血液中观察到ＡｐｏＥ显著减少ｒＩ“，凶此ＡｐｏＥ可以作为预测和诊断血管损伤的潜在生物标志。ＡｐｏＡｌ是高密度脂蛋白胆同醇（ＨＤＬ—Ｃ）的主要结构蛋白，具有促进胆同醇的清除、抗炎症反应、抗氧化反应等作用。”。“，是防止动脉粥样硬化的保护性因子，与心血管疾病成负相关性。本实验发现，ＡｐｏＥ和ＡｐｏＡｌ的表选随着疾病的进展呈现出①组＞②组＞③组＞④组逐渐降低的趋势，说明脂质代谢在冠心病的发生发展过程中具有重要的作用，动态监测其变化・有可能为预测冠心病的发