20020118植物基因工程中化学诱导表达系统研究近况

基因工程综述

第一篇：基因工程综述

植物基因工程技术及其应用进展

摘 要:近几年来植物基因工程的研究进展十分迅速。在植物抗病、抗虫、抗除草剂和改变植物的某些成份方面都巳得到不少转基因植株,有的巳经建成了品系。为提高作物的产量、抗逆能力、改进它们的品质,进行快速、优质、稳产的良种选育提供了一条全新的诱人的途径，将给人类社会带来一场深刻的变革，我们有必要了解植物基因工程的概念、原理、技术程序，以及在农业、工业等方面的应用和进展情况。

关键词:植物基因工程 原理 技术程序 应用进展

正文

（一）植物基因工程是近几年发展起来的分子生物技术。基因工程是按照人们的意愿,把一种生物的有用基因提取或合成出来,在生物体外对DNA分子进行剪切、拼接、修饰和重新组合,然后转移到受体细胞内进行组织培养和无性繁殖,在受体细胞内复制并得到表达,产生受体细胞新的遗传性状,产出人类所需的基因产物。利用植物基因工程技术,改良作物蛋白质成分,提高作物中必需的氨基酸含量,培育抗病毒、抗虫害、抗除草剂、抗盐、抗旱等抗逆境植株,有的已建立了品系,为快速培育优质、高产的良种开辟一条全新途径,并展示了植物基因工程在未来农业生产中的诱人前景。

1、目的基因的获取

开展植物基因工程的工作,首先必须取得目的基因。获取目的基因的途径有直接分离和人工合成法。

1.1目的基因的分离

直接分离是用在核苷酸序列中具有特定切点的DNA限制性内切酶将供体细胞中含目的基因的DNA片段切取分离出来。

1.2人工合成基因

目前人工合成基因的方法主要有:一是以目的基因转录成的mRNA为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的催化下合成双链DNA,而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列,推测出相应mRNA序列,然后按照碱基互补配对的原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列,再通过化学方法以四种脱氧核苷酸(dNTA)为原料合成目的基因。三是通过DNA序列自动测序仪对提出的目的基因进行核苷酸序列分析,采用聚合酶链式反(PCR)技术,快速、简便地扩增目的基因的DNA片段。其基本方法是:先提取植物的染色体DNA或RNA,对于RNA,需经过逆转录酶合成第一链cDNA,然后以染色体DNA或第一链cDNA为模板,以人工合成的一对寡聚核苷酸为引物,在dNTP存在下,通过DNA模板的变性、模板与引物的退火及引物的延伸3个阶段的多次循环,来扩增目的基因。

干旱胁迫诱导下植物基因的表达与调控X杜金友 陈晓阳XX 李伟 高琼(北京林业大学林木花卉遗传育种与基因工程实验室,北京 100083)摘 要: 干旱胁迫能够诱导植物表达大量的基因,研究这些基因的表达与调控,为植物抗旱的定向育种创造条件。本文系统介绍了在干旱胁迫条件下,植物体内渗透调节物质和可溶性糖合成有关的基因、离子和水分通道及Lea蛋白基因的表达,以及与这些基因表达相关的调控元件和因子,干旱胁迫信号转导等方面的最新研究进展。关键词: 植物 干旱胁迫 基因表达调控 信号传导ExpressionandRegulationofGenesInducedbyDroughtStressinPlantDuJinyou ChenXiaoyangXX LiWei GaoQiong(KayLaboratoryforGeneticimprovementinTreesandOrnamentalplants,MOE,BeijingForestryUniversity,Beijing100083)Abstract: UnderstandingexpressionandRegulationofnumerousgenesinducedbydroughtstresswillbehelptobroadenthepossibilitiesforgeneticallyengineeringplants.Herewetrytogiveanoverviewofthegeneexpressionpro2grammesthataretriggeredbydroughtstressordehydration,withparticularreferencetotheregulationoftheirexpressionandsingletransductionofdroughtordehydration.Keywords: Plant Droughtstress Geneexpressionandregulation Singletransduction 干旱是影响植物生长和发育的主要环境因子之一。在西部地区,干旱胁迫严重地影响了地表植被的生长,导致了当地严重的生态问题。如:草地退化、土壤荒漠化等。培育适应当地立地条件的优良抗旱牧草和树木(特别是可以作为饲料的灌木),是解决这个问题的重要措施之一。利用植物基因工程技术,克隆并转化抗旱基因,使其在其它植物中表达,可以加快抗旱新品种的选育。然而这需要对抗旱基因的表达与调控机制有一个深入的了解。在干旱胁迫条件下,植物会特异地表达一些基因,通过研究这些被干旱胁迫所诱导的基因,可能找到植物对干旱胁迫的适应及抵御机理,并为植物抗旱基因工程提供理论支持和目的基因。近年来,国内外很多科学家在干旱胁迫诱导基因表达、基因调控以及信号转导等方面做了大量的工作,本文综述这方面研究的最新进展,以供相关研究者借鉴。1 与植物抗旱相关的物质干旱胁迫能够诱导植物表达的大量基因,这些基因的表达与调控使植物能够抵御干旱胁迫对植物造成的伤害,在不同植物中,这些基因有很大差异。Seki等[1]使用大约1300个全长拟南芥(Arabidopsisthaliana)cDNA微阵列,来确定干旱诱导基因及DREB1APCBF3)一个控制胁迫诱导基因表达的转录因子,共发现44个干旱诱导基因,其中30个新基因没有报道,这些基因的功能需要进一步的确定。这充分说明了干旱胁迫可以诱导表达的基因数量之多,也反映出研究干旱胁迫诱导基因表达这项工作的复杂性。在干旱胁迫诱导所表达的基因当中,所涉及的范围很广,有起到胁迫生理调节的关键酶的基因,也有Lea蛋白基因和调控因子基因等等。1.1 渗透调节物质,可溶性糖在干旱胁迫环境中,植物为了减缓由胁迫造成X国家高技术研究发展计划(863计划)/豆科饲料型灌木抗逆新品种选育0(2002AA241111)资助作者简介:杜金友,1970年生,男,北京林业大学在读博士XX 陈晓阳,通讯联系人,北京林业大学林木遗传育种学教授,博士生导师生物技术通报#综述与专论# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2004年第2期的生理代谢不平衡,细胞大量积累一些小分子有机化合物,如脯氨酸、甜菜碱等,以通过渗透调节来降低水势,维持高的细胞质渗透压,保证细胞的正常生理功能。这些小分子有机物的大量积累,不会破坏生物大分子的结构和功能,同时表现出良好的亲和性,也具有较强的渗透调节作用。因此,它们是理想的渗透物质。脯氨酸在植物体中生物合成有2条途径,即谷氨酸途径和鸟氨酸途径。这2条途径在不同的生理状态下表现不同。在干旱胁迫诱导时,谷氨酸途径是合成脯氨酸的主要途径;而在正常情况下,植物主要通过鸟氨酸途径合成脯氨酸。在谷氨酸途径中vc2二氢吡咯252羧酸合成酶(P5CS)是一个双功能酶,催化谷氨酸磷酸化及谷氨酸2C2半醛还原,而且是合成反应的关键酶。目前,P5CS的编码基因已被克隆并研究。St2rizhov等[2]研究发现,在拟南芥中P5CS是由两个不同调节基因编码的。定位于2号染色体78.5位置上的AtP5CS1基因可以在大多数植物器官中表达,但在分裂细胞中沉默;定位于3号染色体101.3位置上的AtP5cs2基因转录产物,占植物组织中P5csmRNA总量的20%~40%,并在分裂细胞中负责合成P5csmRNA。Igarashi等[3]也从水稻(OryzasativaL.)品种Akibare的cDNA文库中分离并鉴定了一个P5cs的cDNA(cOsP5cs),由其推测的P5CS氨基酸序列与拟南芥的P5CS具有74.2%的同源性。Northern印迹分析表明P5CS基因是被干旱胁迫所诱导,同时P5CS基因也可以被高盐、脱水、ABA和低温诱导。干旱胁迫也可以诱导甜菜碱的积累,甜菜碱的生物合成是从胆碱开始经2步氧化生成的。干旱胁迫下,甜菜碱的累积与胆碱加单氧酶(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(BADH)活性的增加密切相关。Meng等[4]从苋(Amaranthustricolor.)中,克隆了CMO基因全长cDNA(1643bp),为一个编码442个氨基酸的多肽,通过DNA印迹分析该基因在基因组中为单拷贝,受干旱胁迫诱导。Ishitani等[5]从大麦(Hor2deumvulgare)中克隆到了BADH基因的cDNA,通过分析发现其与大肠杆菌(Escherichiacoli)中的BADH基因有高度的同源性,并发现该基因受干旱胁迫诱导。BADH基因可以提高植物的抗旱性已经被转基因工程所证实,梁峥等[6]将菠菜中的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因转入到烟草(Nicotianatabacum)中,结果发现获得转基因植株中甜菜碱积累量显著增加,植株的抗旱性均获得提高。干旱胁迫除了诱导一些小分子溶质外,还可诱导可溶性糖的变化,这些糖类有海藻糖、蔗糖等。这些可溶性糖类在植物体内也起到了渗透调节作用,目前已证实蔗糖的积累能够提高植物的抗旱性。当然,这些可溶性糖类除了起到渗透调节的作用外,糖类化合物也可能在维持植物蛋白质稳定方面起到重要作用。干旱胁迫可以诱导辛酮糖(一种8碳糖)转变为蔗糖,目前已经确认这种变化和蔗糖合成酶基因(Sus)和蔗糖磷酸合成酶基因(Sps)的表达量的增加有关,而这两种酶是蔗糖合成中的关键酶。在干旱胁迫条件下,蔗糖合成酶基因(Sus)对蔗糖的合成起到一种正向调节作用。Geigenberger等[7]将蔗糖磷酸合成酶(SPS)的反义基因转入马铃薯(Solanumtuberosum),结果抑制了在干旱协迫条件下的蔗糖合成和积累,结果显示蔗糖磷酸合成酶基因(Sps)在蔗糖合成过程中同样起到正向调节作用。因此,蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶对于植物适应干旱环境也起到了关键作用。果聚糖广泛存在于植物和微生物的细胞液泡中,而某些植物还能以果聚糖的形式储存光合作用固定的能量,小麦、燕麦等农作物的茎、叶中也能合成果聚糖,果聚糖在细胞内是可溶的,在植物遭遇到干旱胁迫时,能够降低细胞的水势,参与细胞的渗透调节。对枯草杆菌(Bacillussubtilis)中的果聚糖蔗糖转移酶基因(SacB)研究的较多。Pilon2Smits等[8]克隆到了枯草杆菌中SacB基因,并将枯草杆菌中SacB与液泡定位信号序列连接,启动子为组成型的CaMV35S,然后转入烟草。外源基因得到表达,转基因植株的非机构性糖类明显高于对照,在转基因甜菜植株中表达SacB,在干旱胁迫条件下,能够积累果聚糖,增强抗旱性。SacB基因对植物的抗盐性的提高也有帮助,张慧等[9]将枯草杆菌(Ba2cillussubtilis)果聚糖蔗糖转移酶基因(SacB),与克隆自酵母(Sacharomycescerevisiae)的羧肽酶A的液112004年第2期 杜金友等:干旱胁迫诱导下植物基因的表达与调控泡引导信号序列连接得到嵌合基因构建双元表达载体pBin438,经农杆菌介导转化烟草。获得的抗性芽能在含1%NaCl的MS培养基上正常生根,转基因小苗浇灌含1%NaCl的hoaland.s营养液转基因烟草植株生长良好,而未转化苗出现明显萎蔫,结果显示SacB基因的植物基因工程可提高烟草植株的耐盐性。海藻糖是一种还原性双糖,一般存在于低等生物(如酵母、细菌等)中,其化学结构和在维管植物中普遍存在的蔗糖的化学结构很相似,在胁迫环境下,海藻糖能够阻止细胞磷脂双分子膜由液晶态向固态转变,能够稳定蛋白质等高分子物质,从而增加细胞对干旱的抵抗力。因此,海藻糖对于这些生物,度过干旱的环境至关重要。一些极端耐旱的复苏植物含有大量海藻糖,使其枯死后得以复活。在酵母中,海藻糖的合成由海藻糖262磷酸合酶(TPS1)和海藻糖262磷酸磷酸酶(TPS2)共同完成。通过转基因,使植物产生和积累海藻糖,提高植物抗旱性的工作已有报道。赵恢武等[10]的结果证实TPS1基因能够提高烟草抗旱性,但发现烟草的正常生长受到影响。1.2 离子和水分通道蛋白在正常无胁迫的条件下,植物能够保持体内的水分平衡,导管和保卫细胞是水分在体内运输以及和外界交换的主要承载体。水分进出细胞会受到水分通道的调节。水通道蛋白(Aquaporin)是指作为跨膜通道的主嵌入蛋白(MIP,majorintrinsicproteins)家族中具有运输水分功能的一类蛋白质,这类蛋白质在植物水分运输中起到了非常重要的作用。一般根据其序列特征可划分为3个亚类,即分布于液泡膜上的液泡膜嵌入蛋白(TIPtonoplastintrinsicpro2teins),分布于细胞质膜上的胞质膜嵌入蛋白(PIP,plasmamembraneintrinsicproteins)和根瘤细胞中的NOD26。水通道蛋白在干旱胁迫下能够调节膜的传导率并加强水分渗透性,而且水通道蛋白的表达与活性受到干旱的调节。干旱能诱导水通道蛋白基因表达。通过干旱诱导,在豌豆(Pisumsativum)中克隆到了编码水通道蛋白的7a(Guerrero等[11])。这些基因表达产生的水通道蛋白能够改变膜的水分通透性,使水分更易于透过胞质膜或液泡膜进入细胞,有利于实现渗透调节。Mariaux等[12]对水通道蛋白进行了更为详尽的研究,从复苏植物Craterostigmaplantagineum中分离了PIPsandTIPscDNA克隆,按照序列的同源性将克隆到的cDNA确定为Cp2PIPa、Cp2PIPb、Cp2PIPc和Cp2TIP,其中Cp2PIPa、Cp2PIPc和Cp2TIP的cDNA在脱水和ABA的胁迫下积累。认为,Cp2PIPa在整个植物体内,在干旱胁迫的响应中起到了信号传导的作用。并发现水通道蛋白的诱导表达也可分为ABA依赖型和非ABA依赖型。通过这项研究,看来水通道蛋白在干旱胁迫下,除了能够调节膜的传导率并加强水分渗透性,更为重要的可能,还在于水通道蛋白在干旱胁迫信号传导中起到重要作用。1.3 Lea蛋白Lea蛋白(late2embryogenesis2abundantprotein)是指胚胎发生后期种子中大量积累的一系列蛋白质而广泛存在于高等植物中。在植物个体发育的其它阶段,Lea蛋白也能因ABA或干旱脱水诱导而在其他组织中高水平表达。Lea蛋白具有高度亲水性,植物在干旱胁迫时,面临的最主要的问题是细胞组成成分的晶体化,这将破坏细胞的有序结构,而Lea蛋白的亲水性,能把足够的水分捕获到细胞内,从而保护细胞免受干旱胁迫的伤害。因此,Lea蛋白与植物抗干旱胁迫有着密切的联系。Lea蛋白多种多样,但是,不同来源的Lea蛋白具有高度保守的氨基酸序列是其的一个重要特征。根据蛋白序列结构将LEA蛋白分成3类,第1类是Em(胚胎中的成熟蛋白)基因的产物(如小麦Em),第2类是RAB(responsivetoABA)和脱水素(de2hydrin)基因的产物,第3类包括其它Lea基因产物。植物在受到干旱胁迫时,Lea基因的高水平表达和Lea蛋白的大量积累也表明Lea蛋白基因具有干旱保护功能。如:大麦(Hordeumvulgare)Lea蛋白B19基因家族(由4个成员组成,即B19.1,B19.6,B19.3,B19.4),具有高度亲水性及随机螺旋结构,在细胞受到干旱胁迫时,可以防止水分流失。其编码基因被克隆到的蛋白有很多,如:小麦(Triticumaestivum)的Pma2005(Morris等[13])、大麦的HVA1基因(Shen等[14]),HVA22(Shen等[15])等12 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2004年第2期

表皮生长因子的植物基因工程研究进展

白杰英;曾林;林忠平;谢欣梅

【期刊名称】《河南大学学报（医学版）》

【年(卷),期】2007(026)002

【摘 要】利用基因工程手段获得大量目的蛋白（特别是稀有药用蛋白）是目前国内外开发新产品的一种重要手段和今后发展的必然趋势。随着外源基因导人技术的逐渐成熟，不同的表达系统也相应地建立起来。目前用细菌培养的方法大量生产廉价真核蛋白是可行的，但是却难以解决诸如转录后调控、二硫键形成、包涵体的产生等困难，这些因素无形中增加了后续工作的难度和纯化的费用。

【总页数】4页(P6-8,23)

【作 者】白杰英;曾林;林忠平;谢欣梅

【作者单位】军事医学科学院,实验动物中心,北京,100071;军事医学科学院,实验动物中心,北京,100071;北京大学,蛋白质工程与植物基因工程国家重点实验室,北京,100871;河南大学,药学院,河南,开封,475001

【正文语种】中 文

【中图分类】Q943.2

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基因工程在植物育种中的应用

官玲(GUAN Ling)

(莆田学院 环境与生命科学系 福建 莆田 351100)

摘要：在现代生物技术中，基因工程作为一个重要的部分，已经在生产和生活等多方面起着重要的作用。不断成熟的基因工程技术它解决了传统育种不能突破的问题，与传统育种方法相比, 基因工程技术具有独特优势可以定向修饰植物的某些目标性状并保留其它原有性状通过引入外来基因扩大基因库。本文主要综述了基因工程在药用植物和花卉植物育种中的研究状况及对以后的发展现状进行的展望。

关键词：基因工程;植物育种;基因芯片技术;前景展望

基因工程是指运用分子生物学技术, 将目的基因或DNA片段通过载体或直接导入受体细胞, 使受体细胞遗传物质重新组合, 经细胞复制增殖, 新的基因在受体细胞中表达, 最后从转化细胞中筛选有价值的新类型, 继而它再生为工程植株, 从而创造新品种的一种定向育种技术。与传统育种相比, 植物基因工程具有以下特点植物基因工程是在基因水平上来改造植物的遗传物质, 更具有科学性和精确性,同时育种速度也大大加快能定向改造植物的遗传性状, 提高了育种的目的性与可操作性植物基因工程大大地扩展了育种的范围, 打破了物种之间的生殖隔离障碍, 实现了基因在生物界的共用性, 丰富了基因资源及植物品种。

1.基因工程技术在药用植物育种中的应用

由于医药事业的快速发展, 野生药材资源已远远不能满足需要, 尤其是许多原料性药用植物资源已面临资源枯竭的威胁, 加之人工驯化和栽培的药用植物物种退化和濒危的问题极为突出。 根据这些中药资源的活性成分、生长规律、生产特性, 运用生物工程技术对其进行保存性研究, 从而保护濒危紧缺的药用植物资源.。

通过遗传转化, 将目的基因（如抗逆、抗病毒、抗虫、抗除草剂等相关基因）导入药用植物以改变传统遗传性状, 培育优良品种, 增强药用植物抗病毒、抗虫害、抗除草剂的能力,

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