生物工程专业毕业论文

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脂质体介导的CHO细胞转染

——脂质体介导的基因真核细胞转染

专业：生物工程专业

1 摘要

CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。

外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。

脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。根据膜的融合及内吞作用，可用作外源物质进入细胞的载体。

在对生物大分子的传递过程中，脂质体是十分有效的载体，无论对微生物还是对植物细胞或对哺乳动物细胞导入外源DNA，脂质体的包裹都能对抗核酸酶的消化。

脂质体的制备主要有超声波法、磷脂酰丝氨酸Ca2+离子融合法和逆相蒸发等，用超声波法可制备的单层或多层脂质小体能向细胞内引入的物质量少，故常用后两种方法制备大的脂质体。脂质体介导转染法的改进方法包括促进转染的脂类、增加转染效率的添加剂、DNA与脂质体最佳比率的确定。

本实验将携带绵羊P基因的绿色荧光蛋白真核表达载体转入中国仓鼠卵巢细胞，得到稳定表达绵羊PrP基因的CHO细胞系。得出外源导入CHO的绵羊PrP可以在CHO中稳定表达的结论。

关键词：CHO细胞、脂质体、转染

2 Abstract

CHO cells of Chinese hamster ovary cells, biological engineering is

currently widely used cell lines. Eukaryotic cells in CHO cells is

currently restructuring glycosyl protein of choice for the production

system.

Exogenous genes into cells mainly has four kinds of methods: electric

shock method, calcium phosphate and mediated by liposome and virus

mediated method.

Liposome is a phospholipid dispersed in water is formed when the lipid

bilayer, also known as the artificial biological membrane. According to

the membrane fusion and endocytosis, can be used as exogenous substances

into the cell carrier.

On biological macromolecules in the transfer process, liposomes are

very effective carrier, regardless of the microorganism or plant cell or

mammalian cells for introducing exogenous DNA, liposome encapsulated can

against nuclease digestion.

Preparation of liposomes are ultrasonic method, phosphatidylserine

Ca2+ ion fusion method and reverse phase evaporation, using ultrasonic

method to prepare monolayer or multilayer lipid globules to intracellular

introduced mass is less, so commonly used two methods for preparation of

large liposomes. Liposome mediated transfection method improvement

methods include promoting transfection lipids, increase in transfection

efficiency additives, DNA and liposome best rate determine.

This experiment will carry sheep P gene green fluorescent protein

eukaryotic expression vector was transfected into Chinese hamster ovary

cells, stable expression of PrP gene in sheep in the CHO cell line. Draw

foreign import CHO sheep PrP can CHO stable expression of the conclusion.

Key words: CHO cells, liposomes, transfection

3 引言

Lipofectamine™ 2000转染试剂是一种阳离子脂质体,在体外可以转染许多种哺乳动物细胞，对各类细胞系都可提供最高的转染效率，具有高效性和操作步骤简单的优点。其转染效率以及细胞活性取决于许多实验因素,如细胞密度、脂质体和DNA的浓度、脂质体2DNA复合物的作用时间以及是否有其它介质成分如抗生素和血清。

使用Lipofectamine™ 2000试剂，可以获得：在多种细胞系中具有极高地转染效率和较高水平地重组蛋白表达；传输siRNA的优异性能；在有血清存在的情况下可保证转染效力——转染后无需更换培养基；保证可以用于高通量应用的试剂；用于建立稳定细胞系的可靠试剂Lipofectamine™ 2000试剂为大多数细胞提供了最高的转染效率和活性。当存在血清或用于进行蛋白表达的细胞系(如COS-7，CHO和293)时，Lipofectamine™ 2000尤为有效，效率可超过90%。

本实验将构建了CHO细胞培养基及CHO细胞的培养，并利用脂质体转染试剂转染CHO细胞中，观察全长的重组绵羊EGFP-PrP是否表达，能否得到稳定表达绵羊PrP基因的CHO细胞系。

4 1 实验综述

1.1 细胞转基因的研究进展

数百万年来原核生物如大肠杆菌经常相互分享它们的遗传物质，人们受到自然的启发出现了将DNA导入培养细胞的技术。随着这种技术的不断进步，人们可以在培养细胞中进步各种外源基因的表达，生产制备大量经过真核细胞翻译后加工的特有的活性蛋白，研究基质的功能，表达蛋白的结构、生化特性和基因表达的调控机理等。

1.2 细胞的转染方法

转染就是让外源核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要阶段。如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。核酸转染技术在21世纪60年代末和70年代初期已经建立，最早使用的方法是磷酸钙法和用DEAE一dextran

乙胺乙基葡聚糖)作为载体使DNA吸附于细胞表面的方法。至今己经有多种方法可以用于转染。

常用的转染方法有:磷酸钙法、DEAE一葡聚糖法、电穿孔法(电击基因导人法)、脂质体转染法，另外还有细胞核的直接微注射法、Pol沙rene介导的转染法、基因枪法。转染技术的广泛使用促进了该领域及相关领域的发展。从磷酸钙到脂质体，到多胺，可用转染的细胞种类己越来越多。转染己不再仅限于将DNA转入细胞中，RNA、siRNA、蛋白质等生物大分子也进入了转染的行列。在细胞中表达外源基因有两个关键的因素:一个是选择构建合适的表达载体和表达细胞株，另一个就是选择合适的方法将克隆的基因导入培养细胞中进行

5 表达。针对不同的细胞株和不同的实验目的，需要选择合适的表达细胞株及转染方法。

（1） DEAE一葡聚糖法

是在1965年出现的古老的转染方法之一，到现在只有少数人坚持采用带正电的DEAE一葡聚糖或Pol沙rene多聚体可以结合带负电的DNA分子，形成的DNA复物结合在带负电的细胞表面，通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克或细胞内吞作用，使DNA复合体进入细胞。DEAE一葡聚糖仅限于瞬时转染，重复性好，转染时需要去除血清。

（2）磷酸钙共沉淀法

该方法最早是在1973年开始采用，氯化钙十DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混合，形的极微小的磷酸钙一DNA复合物沉淀粘附到细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗的大小和质量对于转染的成功至关重要，pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响，所以重复性不佳。在己经很少有人采用这种方法。此法比DEAE法更容易得到稳定转染，但是转染原代细胞较困难。

（3）电穿孔法

通过短暂的高场强电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜暂时穿孔，穿过孔扩散到细胞内。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，是这种方法需

6 要昂贵的设备，而且由于细胞死亡率高，每次转染需要更多的细胞和DNA，这种细胞电转的条件都需要进行多次优化。新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因双筛选标记的人胰岛素乳腺特异表达载体转入体外的牛胎儿成纤维细胞，获得了用于转基因克隆牛的核供体转基因细胞，为高效率、低成制作转基因克隆牛奠定了基础。

（4）脂质体法

中性脂质体(liPid)是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正阳离子脂质体(Catin正cliposomes)则不同，在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，以形成微小的(平均大小约loo400nm)单层脂质体，这些脂质体带正电，可以靠静电作用合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与利用中性脂质体转染的原理不同，使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成阳离子脂质体/DNA复合物。阳离子脂质体/DNA复合物进入细胞是阳离子脂质体移基因的第一步，以前通常认为脂质体与细胞膜间的融合是脂质体转移DNA进入细胞的机制，而现有证据表明复合物的整体缓慢内嗜作用才是主要的机制，这种作用通过多糖相互作用调控。阳离子脂质体心NA复合物进入细胞虽然比较慢，但效率较高。不过，不是所有进入的基因都会发生作用。

（5）非脂质体的脂质法

这是新一代的转染技术，代表着脂质体技术的未来发展方向。革新配方成分形成结构而非简单的双层膜结构，令核酸传递更有效率而