单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。 单克隆抗体技术 （monoclonal antibody technique）:—种免疫学技术，将产生抗体的单个 B淋巴细胞 同骨髓肿瘤细胞杂交， 获 得既能产生抗体， 又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应 于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1单克隆抗体的优点与局限性 ：

1.1单克隆抗体的优点：（1）杂交瘤可以在体外"永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就 可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。 （2）可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。 ⑶由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如 IRMA和ELISA 等。（4）由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产 等。 1.2单克隆抗体的局限性：（1）单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克 隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 （2）单克隆抗体的反应强度不如多 克隆抗体。（3）制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2单克隆抗体的制备：

单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使 骨髓瘤细胞 与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性， 它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性， 也有骨髓瘤细胞能 在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群， 可制备抗一种抗原决定簇的特异单 克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程： 抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的 克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 2.1抗原准备

抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合， 发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二 是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进 行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠 /大鼠每 次注射10~50ug重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 2.2动物的选择与免疫

2.2.1动物的选择 纯'-BALB/c小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的 实验室均能饲养成活：目』•开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种 BALA/c小鼠。 2.2.2免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的 McAb至关重要。一般在融 合前两丨月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全 佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原1〜50 ^g加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射 （一般0.8〜1ml ,0.2ml/ 点），3周后第二次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或 ip （腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml ）, 3 周后第三次免疫，剂量同一，不加佐剂，ip （5〜7天后采血测其效价），2〜3周加强免疫，剂量50〜500宜， ip或iv （静脉内注射），3天后 取脾融合。 （2）颗粒抗原免疫性强， 不加佐剂就可获得很好的免疫效果。 以细胞性抗原为例， 免疫时要求抗原量为1〜 2X 107个细胞。初次免疫 1X 107/0.5ml ip , 2〜3周后，第二次免疫 1X 107/0.5ml ip , 3周后加强免疫（融合 前三天）1 x 10 7/0.5ml ip 或iv，取脾融合。 2.3细胞融合 2.3.1细胞融合前准备

（1） 骨髓瘤细胞系的选择： 骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系， 三样杂交融合率高，也便于接种杂交 瘤在同一品系小鼠腹腔内产生 ■量McAb骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如 DMEM培养基。小牛血清的浓 度一般在10%〜20%细胞浓度以104〜5x 105/ml为宜，最大浓度不得超过 106/ml。当细胞处于对 □生长的中期 时，可按1: 3〜1 : 10的比例传代。每3〜5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定 期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对 HAT呈均一的敏感性。 （2） 饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些 细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备 McAb的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在 杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细 胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。饲养细胞的量为一般为 2X 104或105细胞/孔。 2.3.2 细胞融合的步骤

① 将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1 : 10或1 : 5的比例混合在一起，在 50ml离心管中用无血清不完全培养液洗 1 次，离心，1200rpm, 8min ;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（ PEG浓度。轻轻弹击离心管底， 使细胞沉淀略松动。 ② 90s内加入37C预温的1ml 45%PEG （分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37C水浴作用 90s。 ③ 加37。C预温的不完全培养液以终止 PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。 ④ 离心，800rpm, 6min。 ⑤ 充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。 ⑥ 将上述细胞，加到已有饲养细胞层的 96孔板内，每孔加100卩l。一般一个免疫脾脏可接种 4块96孔板。 ⑦ 将培养板置37C、5%CO培养箱中培养。 2.4选择杂交瘤细胞及抗体检测

2.4.1 HAT选择杂交瘤细胞 脾细胞和骨髓瘤细胞经 PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨 髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。 在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌 呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在 HAT选择培养液可以生长繁殖。 在用HAT选择培养1〜2天内，将有大量瘤细胞死亡， 3〜4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落， HAT选 择培养液维持7〜10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞 布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体， 筛选出所需要的杂交瘤细胞系。 在选择培养期间，一般每2〜 3天换一半培养液。 2.4.2抗体的检测 检测抗体的方法应根据抗原的性质、 抗体的类型不同，选择不同的筛选方法， 一般以快 速、简便、特异、敏感的方法为原则。 常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA） 可用于可溶性抗原、细胞和病毒等 McAb的检测。（3 ）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的 McAb的检测。（4 ）其 它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。 2.5 杂交瘤克隆化

杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。 因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有 一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的 抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原 则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化， 否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制， 因为 抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快， 二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。 即使克隆 化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆， 以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失， 从而丧失产生抗体的能力。 克 隆化的方法很多，最常用的是 有限稀释法 和软琼脂平板法 。 2.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏

2.6.1 杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。 因为 在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候， 细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、 分泌抗体能力的丧 失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。 细胞冻存液： 50%小牛血清； 40%不完全培养液； 10%DMS（O 二甲基亚砜） 。 冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至 0C后放入-70C超低温冰箱，次日转入 液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中 细胞可保存数年或更长时间。 262 细胞复苏方法 将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放 37C水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将 细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置 37C、5%CO孵箱中培养，当 细胞形成集落时，检测抗体活性。 2.7 单克隆抗体的大量制备 大量生产单克隆抗体的方法主要有两种： 一种是杂交瘤细胞体外培养，在培养液中分离单克隆抗体 。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基， 以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。如果大量生产，费用较高。 另一种方法是最普遍采用小鼠腹腔接种法 。选用 BALB/c 小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔 注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集 5〜 10ml的腹水，有时甚至超过 40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外， 腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。 2.8 单克隆抗体的鉴定

对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定： 2.8.1 抗体特异性的鉴定 除用免疫原 （抗原） 进行抗体的检测外， 还应该用与其抗原成分相关的其它抗原 进行交叉试验，方法可用 ELISA、IFA法。例如：①制备抗黑色素瘤细胞的 McAb除用黑色素瘤细胞反应外，还