CTLA-4抗体抑制小鼠Lewis肺癌生长的实验研究
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一５３２一 文章编号：１００７—４２８７（２０１５）０４—０５３２—０５ Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，Ａｐｒｉｌ，２Ｏ１５，Ｖｏｌ １９，Ｎｏ．４
ＣＴＬＡ一４抗体抑制小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌生长的实验研究 崔 倪 ，王建霞 ，张海英 ，李神南 ，李明月 ，邢树刚 ，李 伟¨，李一雷¨ （１．吉林大学基础医学院病理学系，病理生物学教育部重点实验室，吉林长春１３００２１； ２．吉林大学白求恩医学部临床医学院２０１１级５年制，吉林长春１３００２１）
摘要：目的 研究抗ＣＴＬＡ一４（ｃｙｔｏｔ０ｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－４，ＣＴＬＡ一４）抗体（９Ｈ１０）对小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌的抑瘤 作用及其机制。方法选取健康适龄Ｃ５７小鼠，皮下接种小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞系，建立皮下移植瘤模型。１２只荷瘤 小鼠分为２组，分别为空白对照组和实验组，分别腹腔注射给予生理盐水和ＣＴＬＡ－４抗体（９Ｈ１０），通过肿瘤体积、重 量及肿瘤生长抑制率评估９Ｈ１０的抑瘤作用；免疫组织化学染色检测脾组织Ｔ细胞亚型（ＣＤ４及ＣＤ８阳性Ｔ细胞）及 肿瘤微血管密度（ＭＶＤ），通过组间对照分析抗ＣＴＬＡ一４对肿瘤微环境免疫细胞及血管生成的影响。结果 ＣＴＬＡ一４ 抗体可延缓荷瘤小鼠的肿瘤生长速度，延长其生存时间。免疫组织化学染色检测荷瘤小鼠脾脏中ＣＤ４及ＣＤ８阳性Ｔ 细胞。结果显示，实验组与对照组ＣＤ４阳性Ｔ细胞的数量分别为（４９．０５４－７．３１） 和（２３．４５±８．０６） ，与对照组比 较，应用抗ＣＴＬＡ－４处理后ＣＤ４表达阳性率明显增高，具有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１）。实验组和对照组中ＣＤ８表达的 阳性率分别为１７．２５士２．８６和１１．３２－－４－０．７１，与对照组比较，应用抗ＣＴＬＡ一４处理后ＣＤ８表达的阳性率明显增高，具 有统计学意义（Ｐ＜ｏ．０５）。用抗ＣＤ３４单克隆抗体标记肿瘤微血管内皮细胞，计数肿瘤间质ＭＶＤ。实验组和对照组 的ＭＶＤ值分别为３７．２Ｏ士２．８４和７５．７２±１４．４９，ＣＴＬＡ一４使肿瘤ＭＶＤ明显减少，具有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．００１）。结 论ＣＴＬＡ一４抗体对荷瘤小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌具有抑制作用，荷瘤小鼠脾组织中ＣＤ４及ＣＤ８表达均增高，肿瘤间质的 ＭＶＤ值显著降低。ＣＴＬＡ－４在提供机体抗肿瘤免疫及抑制肿瘤血管生成中均发挥重要作用。 关键词：Ｌｅｗｉｓ肺癌；细胞毒性Ｔ细胞抗原一４（ｃＴＬＡ一４）；ＣＤ４；ＣＤ８；肿瘤血管 中图分类号：Ｒ７３４．２ 文献标识码：Ａ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｔ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｌｅｗｉｓ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ＣＵ工Ｎｉ，ＷＡＮＧ Ｊｉａｎ—ｘｉａ，ｚＨＡＮＧ Ｈａｉ—ｙｉｎｇ，ｅｔ ａ１．（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００２１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ一４ ａｎｔｉｂｏｂｙ（９ Ｈ １ ０）ｏｎ ｍｉｃｅ Ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｔｏ Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ．Ｔｗｅｌｖｅ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ：Ｔｈｅ ９ Ｈ１０ ｔｈｅｒａｐｙ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａ１ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－４ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ０．９ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｐｌｅｅｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ｄｅｎｓｉｔｙ（ＭＶＤ）ｗａｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ＣＤ３ １ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｄｅｌａｙｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ ｗｅｒｅ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ．Ｔｈｅ ＣＤ４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ４９．０５±７．３１ ａｎｄ ２３．４５±８．Ｏ６ ｉｎ ９Ｈ１０ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｆｔｅｒ ＣＴＬＡ－４ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｐ＜Ｏ．０１）．Ｔｈｅ ＣＤ８ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ １７．２５±２．８６ ａｎｄ １１．３２±０．７１ ｉｎ ９Ｈ１０ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎ ｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ｄｅｎｓｉｔｙ（ＭＶＤ）ｗｅｒｅ ３７．２０±２．８４和７５．７２±１４．４９ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ＭＶＤ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ ＣＴＬＡ一４ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔ— ｍｅｎｔ（Ｐ＜Ｏ．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｗｅｒｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ａｆｔｅｒ ＣＴＬＡ－４ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ＭＶＤ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｌｏｗｅｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ ｏｆ Ｌｅｗｉｓ ｃａｎｃｅｒ ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ＣＴＬＡ－４ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＣＴＬＡ－４ ｍａｙ ｐｌａｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｂｏｔｈ ｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．
基金项目：吉林省科技厅自然科学基金资助课题（２０１３０１０２０８４ＪＣ）；吉林大学白求恩医学科研支持计划资助课题（２０１３１０１００５）；吉林大学“大学 生创新创业训练计划”国家级项目资助课题（２Ｏ１３Ａ７１２４９） ＊通讯作者 中国实验诊断学２０１５年４月第１９卷第４期 Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ；ＣＴＬＡ一４；ＣＤ４；ＣＤ８ Ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ
近年来，细胞毒性Ｔ细胞抗原（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ一４，ＣＴＬＡ一４）已经成为肿瘤免 疫治疗的关键生物靶点，对恶性黑色素瘤的治疗具 有显著疗效，但对其它肿瘤的疗效尚不确定口 ］，并 且ＣＴＬＡ一４抗体处理后对体内肿瘤血管新生情况 的影响尚未见报道。本项目拟制备小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌 皮下移植瘤模型，研究ＣＴＬＡ一４单克隆抗体对小鼠 肺癌生长的影响，观察肿瘤微环境内免疫状态及血 管新生情况。 ｌ材料与方法 １．１实验动物及肿瘤细胞系Ｃ５７ＢＬ／６雄性小鼠，６—８ 周龄，体重１８—２２ ｇ，购自吉林大学基础医学院实验动物 中心。小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞系来自吉林大学病理生物 学教育部重点实验室。细胞置于５ Ｃ０２，３７℃孵箱 中，用含ｌ０ 胎牛血清ＤＭＥＭ培养基培养。 １．２药物及主要试剂 小鼠抗ＣＴＬＡ ４单克隆抗 体９Ｈ１０（Ｂｉｏｘｃｅｌ公司，美国），胎牛血清，ＤＭＥＭ培 养基（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国），兔抗鼠ＣＤ４抗体、兔抗鼠 ＣＤ８抗体、兔抗鼠ＣＤ３４抗体、ＳＰ免疫组化试剂盒 及ＤＡＢ发色剂（福州迈新生物技术有限公司）。 １．３ 小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌皮下移植瘤的制备 小鼠 Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞用含１０ 胎牛血清的ＤＭＥＭ培养 基培养，传代２－３次后，取对数生长期细胞，用 ０．２５ 胰蛋白酶消化，１０００ ｒ／ｒａｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上 清，加０．９ 的生理盐水悬浮细胞，调整细胞浓度至 １．０×１０ ／ｍｌ，接种于小鼠右侧后背部皮下，每只注 射０．１ ｍｌ。 １．４实验动物分组及给药 将建立移植瘤的小鼠 随机分为实验组和对照组，每组６只。实验组在接 种肿瘤当天（ＤＯ）开始注射ＣＴＬＡ一４抗体９Ｈ１０，抗 体腹膜内注射，剂量１００ ｇ／只，每３天注射２个５０ ｇ，至第２１天。对照组注射相同剂量的生理盐水。 １．５移植瘤平均体积、重量及肿瘤抑制率检测 治 疗开始日为第１天，每３天测量肿瘤的最大直径（ａ） 和最大横径（ｂ）并计算体积，绘制肿瘤生长曲线。 共治疗２１天，治疗结束后第２天首先采用摘眼球取 血法取小鼠外周血，再采用颈椎脱臼法处死所有小 鼠，取出脾，肿瘤测量体积，计算肿瘤生长抑制率。 肿瘤体积（Ｖ）一ａ×ｂ ／２；肿瘤生长抑制率一（对照 组瘤重一实验组瘤重）／对照组瘤重×１００ 。 １．６标本处理与免疫组织化学染色 肿瘤组织及 脾置１０ 中性福尔马林缓冲液固定，经脱水、浸蜡 ５３３一 （Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，２Ｏ１５，１９：０５３２） 及包埋后，切３ ｍ厚切片。用柠檬酸抗原修复液 进行抗原热修复，加封闭液后，滴加一抗４℃过夜， 次日加生物素化羊抗兔ＩｇＧ，３７。Ｃ孵育３０ ｍｉｎ，ＡＢＣ 法显色，显微镜下观察到棕黄色即放入自来水中终 止显色。苏木精复染细胞核１－３分钟，固定后光镜 下观察并拍照。 １．７结果判定标准 Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜成像系统， ＤＰ７３照相机采图，镜下避开中间因血液供应不足 而造成的坏死明显部位及其边缘，在肿瘤周围生长 旺盛的部位采图，每张切片采集５个视野，双盲法进 行计数。ＣＤ４及ＣＤ８阳性颗粒主要定位于淋巴细 胞膜，以淋巴细胞膜中出现棕黄色为阳性标准，在显 微镜下随机选取５个视野，计算每个视野中阳性细 胞数占总细胞数的百分比。ＣＤ３４阳性内皮细胞被 染成棕黄色。在低倍镜下寻找血管密集的部位采 图，每张切片采集５个视野，双盲法进行计数，单个 阳性细胞、独立阳性小细胞团或者一个小管腔计为
