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试验十五脂质体的制备

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实验十五 脂质体的制备
一、目的要求
1．掌握薄膜分散法和逆相蒸发法制备脂质体的工艺。
2．掌握用阳离子交换树脂法测定小檗碱脂质体包封率的方法。
3．熟悉脂质体形成的原理及其作用特点。

二、实验提要
1.含义
脂质体是指药物包封于类脂双分子层形成的薄膜中所制成的超微型球状的药物载体。根
据类脂双分子层的层数的不同，脂质体可分为单室脂质体（含大、小单室）和多室脂质体。

2.制备要点
脂质体的制法有多种，应根据药物的性质或需要进行选择。经典的薄膜分散法可形成多
室脂质体，再经超声处理可得到小单室脂质体。此法操作简便，但包封率较低。注入法有乙
醚注入法和乙醇注入法两种，乙醚注入法是将磷脂、胆固醇和脂溶性药物及抗氧剂等溶于适
量的乙醚中，在搅拌下慢慢滴于55℃~65℃水性介质中，蒸去乙醚，继续搅拌1小时～2小时，
即可形成脂质体。此法适于实验室小量制备脂质体。乙醇注入法制备脂质体，脂质体混悬液
一般可保留10%～20%乙醇。此法适用于不耐热的药物。反相蒸发法是制备多层脂质体或大
单室脂质体的方法，此法包封率高。冷冻干燥法适用于水中不稳定药物脂质体的制备。熔融
法制备的脂质体为多相脂质体，其性质稳定，可加热灭菌。

3.质量评价指标
有粒径、粒径分布和包封率等。包封率是评价脂质体内在质量的一个重要指标，常见
的包封率测定方法有分子筛法、超速离心法、超滤膜法和阳离子交换树脂法等。阳离子交换
树脂法是利用离子交换作用，将带正电荷的未包进脂质体中的药物（即游离药物），如本实
验中的游离小檗碱，吸附除去。而包封于脂质体中的药物，由于脂质体带负电荷，不被阳离
子交换树脂吸附，从而达到分离的目的，用以测定包封率。

4.其他
制备脂质体的材料主要有磷脂和胆固醇。磷脂有天然磷脂（豆磷脂、卵磷脂等）和合成
磷脂（二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱等）。胆固醇为两亲性物质，是常用的附
加剂，与磷脂混合使用，可制备稳定的脂质体。其作用是调节双分子层的流动性，减低脂质
体膜的通透性。其他附加剂如十八胺、磷脂酸等，具有改变脂质体表面电荷的性质。
制备脂质体可分为三类：小单室（层）脂质体，粒径在20～50nm，凡经超声波处理的脂
质体混悬液，绝大部分为小单室脂质体，多室（层）脂质体，粒径约为400～3500nm；大单
室脂质体，粒径约为200～1000nm，用乙醚注入法制备的脂质体多属这一类。

-----脂质体混悬液中总的药物浓度
-----未包入脂质体中的药物浓
影响脂质体包封率的因素有多种，如磷脂质的种类，组成比例，制备方法及介质的离子
强度等。

包封率的测定方法有凝胶过滤法，常用凝胶为Sephadex G50、G100或者说Sephrouse 4B、
6B。超速离心法、透析法、超滤膜过滤法等，根据条件加以选择。

三、实验内容

盐酸小檗碱脂质体的制备
【处方】 豆磷脂 0.75g 乙醚 35mL
胆固醇 0.25g 盐酸小檗碱溶液
（1mg•mL-1）25mL

共制成脂质体
25mL

【制法】
1．磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）3.7g 与磷酸
二氢钠（NaH2PO4•12H2O）20g，加蒸馏水适量，加热溶解，稀释成1000mL，即得0.067mol•L
-1

的磷酸盐缓冲液（pH约为5.7）。

2．盐酸小檗碱溶液的配制 称取盐酸小檗碱适量，用0.067mol•mL-1磷酸盐缓冲液配
成1mg•mL-1和3 mg•mL-1的两种浓度药液。

3．盐酸小檗碱脂质体的制备 称取处方量豆磷脂、胆固醇置150mL小烧杯中，加入
35mL乙醚，在磁力搅拌器上搅拌溶解，加入盐酸小檗碱溶液（1mg•mL-1）25mL，继续搅
拌，乳化，直到乙醚挥尽成为黄色的乳状液，即为小檗碱脂质体。
本品在显微镜下观察，为多层囊状或多层圆球，
【作用与用途】抗菌药，制成多种剂型，用于癌症的治疗。
【质量检查】
1.性状 为多层囊状或多层圆球，大部分粒径在0.7μm~1.2μm之间。
2.包封率的测定
(1)阳离子交换树脂分离柱的制备：
称取已处理好的阳离子交换树脂约1.5g，装于底部已垫有少量玻璃棉的5mL注射器筒
中，加入PBS水化阳离子交换树脂，自然滴尽PBS，即得。

(2)柱分离度的考察：
①空白脂质体制备 称取豆磷脂0.9g、胆固醇0.3g于小烧杯中，加乙醚10mL，搅拌使
溶解，旋转该小烧杯使乙醚在杯壁成膜，用洗耳球吹风，将乙醚挥去。另取磷酸盐缓冲液30mL
于小烧杯中，置磁力搅拌器上，加热至55℃~65℃保温10分钟，再在同样温度下，搅拌30~60
分钟（溶液体积少，补加PBS），即得。

②盐酸小檗碱与空白脂质体混合液的制备 精密量取3mg•mL-1的盐酸盐酸小檗碱溶
液0.1mL，置小试管中，加入0.2mL空白脂质体，混匀，即得。

③对照品溶液的制备 取②中混合液0.1mL置10mL量瓶中，加入60%乙醇6mL，振摇
使之溶解，再加PBS至刻度，摇匀，得对照品溶液。

④样品溶液的制备 取②中混合液0.1mL加至分离柱顶部，待顶部的液体消失后，放
置5分钟，仔细加入PBS（注意不能将柱顶部离子交换树脂冲散），进行洗脱（约需1.5 mL～
2mL PBS），同时收集洗脱液于10mL量瓶中，加入95%乙醇6mL振摇使之溶解，再加PBS
至刻度，摇匀、过滤，弃去初滤液，取续滤液为样品溶液。

⑤空白溶剂的配制 取95%乙醇30mL，置50mL量瓶中，加PBS至刻度，摇匀，即得。
⑥吸收度的测定：以空白溶剂为对照，在345nm波长处分别测定样品溶液与对照品溶
液的吸收度。计算柱分离度。分离度要求大于0.95。
式中，A样——样品溶液的吸收度；
A
对———
对照品溶液的吸收度；

2.5——对照品溶液的稀释倍数。

（3）包封率的测定：精密称取盐酸小檗碱脂质体0.1mL两份，一份置10mL量瓶中，
按“柱分离度考察”项下②进行操作；另一份置于分离柱顶部，按“柱分离度考察”项下③
进行操作，所得溶液于345nm波长处分别测定吸收度，按下式计算包封率。

式中，AL：通过分离柱后收离脂质体中盐酸小檗碱的吸收度
Ar：盐酸小檗碱脂质体中总的药物吸收度。
【制剂评注】
（1）制备用磷脂和胆固醇溶液应澄清，若有杂质应滤过除去。
（2）如果室温较低，可用吸耳球轻吹乙醚液面，加速乙醚的挥发，实验过程中禁止用火。
（3）如果制得的脂质体体积少于5ml，加蒸馏水调整至5ml。
四．思考题
1.脂质体作为抗癌药物载体的机理和特点有哪些？
2.影响脂质体形成的因素有哪些？
3.抗癌药物制成脂质体制剂有何意义？
4．注入法制备脂质体成败的关键是什么？
5．制备脂质体时加入胆固醇的目的是什么？

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脂质体制备试验

脂质体制备试验

实验十脂质体的制备及包封率的测定一、实验目的1．掌握薄膜分散法制备脂质体的工艺。

2．掌握用阳离子交换树脂法测定脂质体包封率的方法。

3．熟悉脂质体形成原理，作用特点。

4．了解“主动载药”与“被动载药”的概念。

二、实验指导脂质体是由磷脂与（或不）与附加剂为骨架膜材制成的具有双分子层结构的封闭囊状体。

常见的磷脂分子结构中有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团，将适量的磷脂加至水或缓冲溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此相对缔和为双分子层，构成脂质体。

用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂、卵磷脂等；合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。

常用的附加剂为胆固醇。

胆固醇也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制得稳定的脂质体，其作用是调节双分子层的流动性，减低脂质体膜的通透性。

其他附加剂有十八胺、磷脂酸等，这两种附加剂能改变脂质体表面的电荷性质，从而改变脂质体的包封率、体内外其他参数。

脂质体可分为三类：小单室（层）脂质体，粒径为20~50nm，经超声波处理的脂质体，绝大部分为小单室脂质体；多室（层）脂质体，粒径约为400~3500nm，显微镜下可观察到尤如洋葱断面或人手指纹的多层结构；大单室脂质体，粒径约为200~1000nm，用乙醚注入法制备的脂质体多为这一类。

脂质体的制法有多种，根据药物的性质或需要进行选择。

（1）薄膜分散法：这是一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声处理后得到小单室脂质体。

此法优点是操作简便，脂质体结构典型，但包封率较低。

（2）注入法：有乙醚注入法和乙醇注入法等。

“乙醚注入法”是将磷脂等膜材料溶于乙醚中，在搅拌下慢慢滴于55~65℃含药或不含药的水性介质中，蒸去乙醚，继续搅拌1~2h，即可形成脂质体。

（3）逆相蒸发法：系将磷脂等脂溶性成分溶于有机溶剂，如氯仿中，再按一定比例与含药的缓冲液混合、乳化，然后减压蒸去有机溶剂即可形成脂质体。

该法适合于水溶性药物、大分子活性物质，如胰岛素等的脂质体制备，可提高包封率。

西药师考试综合辅导：脂质体的常用制备方法

西药师考试综合辅导：脂质体的常用制备方法

1.注入法：将磷脂与胆固醇等类脂质及脂溶性药物共溶于有机溶剂（多采用乙醚）中，然后在磁力搅拌条件下将此药液用注射器缓缓注入加热至50℃的磷酸盐缓冲液中，加完后不断搅拌至乙醚除尽，即制得大多孔脂质体。

2.薄膜分散法：将磷脂、胆固醇等类脂质及脂溶性药物溶于氯仿或其它有机溶剂中，然后将氯仿溶液在一玻璃瓶中旋转蒸发，使在烧瓶内壁上形成一薄膜，然后将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液中，加入烧瓶中不断搅拌即得脂质体。

3.超声波分散法：先将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液，加入磷脂、胆固醇与脂溶性药物共溶于有机溶剂，搅拌蒸发除去有机溶剂，残液经超声波处理，然后分离出脂质体，再混悬于磷酸盐缓冲液中，制成脂质体混悬型注射剂。

4.高压乳匀法：系将各成分加入溶媒中通过高压乳匀机均匀分散成脂质体。

脂质体的制备方法

脂质体的制备方法

vesicles, SUV)，
• 0.1~1μm为大单室脂质体(large unilamellar vesicles, LUV) ，
• 水溶性药物的溶液只被一层类脂质双分子层所包封，脂 溶性药物则分散于双分子层中。
• 凡经超声波分散的脂质体悬液，绝大部分为单室脂质体。
第32页，共102页，编辑于2022年，星期六
第25页，共102页，编辑于2022年，星期六
脂质体与其包封的药物
第26页，共102页，编辑于2022年，星期六
脂质体半球剖面图
第27页，共102页，编辑于2022年，星期六
结构特点
• 脂质体结构与由表面活性剂构成的胶团不同，后者是 由单分子层组成，脂质体由双分子层组成。
micelle
liposomes bilayer
第11页，共102页，编辑于2022年，星期六
Transmission electron photomicrograms of insulin liposomes
a－conventional liposomes, b－WGA modified liposomes
第12页，共102页，编辑于2022年，星期六
• 球径约0.13±0.06μm，单层状， • 比单室质体可多包封10倍的药物。
第34页，共102页，编辑于2022年，星期六
脂质体分类
按结构
第35页，共102页，编辑于2022年，星期六
单室和多室脂质体示意图
第36页，共102页，编辑于2022年，星期六
脂质体电镜照片
第37页，共102页，编辑于2022年，星期六
第18页，共102页，编辑于2022年，星期六
• 天然磷脂：
• 胆碱+磷脂酸→磷脂酰胆碱(PC)， 即卵磷脂 • 乙醇胺+磷脂酸→磷脂酰乙醇胺 (PE)，即脑磷脂 • 丝氨酸+磷脂酸→磷脂酰丝氨酸 (PS)
脂质体制备方法

脂质体制备方法

微脂體(又称脂质体)及其制备方法一二微脂體(又称脂质体)微脂體起源於1960 年代中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上加入含鹽分的水溶液後，再加以搖晃，會使脂質形成具有通透性的小球；196 8年，Sessa 和Weissmann 等人正式將此小球狀的物體命名為微脂體（liposo me）並做出明確的定義: 指出微脂體是由一到數層脂質雙層膜(lipid bilayer)所組成的微小的囊泡，有自行密合（self-closing）的特性。

微脂體由脂雙層膜包裹水溶液形成，由於構造的特性，可同時作為厭水性（hydrophobic）及親水性（hydrophilic）藥品的載體，厭水性藥品可以嵌入脂雙層中，而親水性藥品則可包覆在微脂體內的水溶液層中。

如同細胞膜，微脂體的脂質膜為脂雙層構造，由同時具有親水性端及厭水性端的脂質所構成，脂雙層由厭水性端相對向內而親水性端面向水溶液構成，組成中的兩性物質以磷酸脂質最為常見。

微脂體的形成是兩性物質在水溶液中，依照熱力學原理，趨向最穩定的排列方式而自動形成。

微脂體的性質深受組成脂質影響，脂質在水溶液的電性，決定微脂體是中性或帶有負電荷、正電荷。

此外，磷酸脂碳鏈部分的長短，不飽和鍵數目，會決定微脂體的臨界溫度(transition temperature, Tc)，影響膜的緊密度。

一般來說，碳鏈長度越長臨界溫度越高，雙鍵數越多則臨界溫度越低，常見的DPPC(dipalmitoylp hosphatidylcholine)与DSPC(distearoylphosphatidylcholine)的臨界溫度分別是42℃與56℃，而Egg PC(egg phosphatidylcholine)與POPC(palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine)的Tc 則低於0℃。

臨界溫度影響微脂體包裹及結合藥物的緊密度，當外界溫度高於Tc時，對膜有通透性的藥物，較容易通過膜；此外，當外界溫度處於臨界溫度時，微脂體脂質雙層膜中的脂質，會因為流動性不一致而使微脂體表面產生裂縫，造成內部藥物的釋出。