当归根际微生物的培养和鉴定方法

当归根际微生物的培养和鉴定方法

一、 根际微生物：在植物根系直接影响的土壤范围内生长繁殖的微生物。

二、 试验流程，分为以下几个部分:

（一） 当归根际土壤微生物取样

在试验地找到当归，在试验地找到当归，用土壤刀从当归基部开始逐段逐层地小心挖去上层覆土，追踪根系的伸展方向，然后找到须根部分，小心将须根带土取出，保留距根表 4mm 左右的土壤，然后轻轻抖落当归根部大块不含根系的土壤，然后用灭菌镊子刮取附在根须上的一薄层土壤作为根际土壤，装入无菌塑料袋中。低温保存并带回实验室。将当归根际土壤样品放在 4℃的冰箱里保存。

（二） 样品的处理

在无菌条件下，取 10g 土样，放入到90mL 的无菌水中。在 28℃，150r/min

下振荡摇床 20min。

在超净工作台下，用无菌水稀释成10-2,10-3 ,10-4，10-5,10-6。

所需器材：90ml无菌水（内装玻璃珠15～20个）1瓶、9ml无菌水6支、1ml无菌吸管、天平、试管架、无菌称量纸、酒精灯、火柴、接种环、记号笔等。

（三） 培养基的配制

培养基根据功能可分为：选择培养基、基础培养基、加富培养基、鉴别培养基。根据实验目的的不同，对以上不同功能的培养基进行不同方式组合。常用几种培养基分别为：马铃薯天然培养基（简称 PDA）、牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基；鉴别培养基：糖发酵试验培养基、甲基红（MR）和 V-P 试验培养基、过氧化氢酶试验培养基、石蕊牛奶培养基、淀粉水解试验培养基、纤维素降解试验培养基、卵磷脂酶培养基、明胶液化试验培养基。（以上培养基的配法可见“赵斌，何绍江主编.微生物学实验.北京：科学出版社，2002”）

（四） 根际微生物的菌种的分离纯化培养及和保存方法

对于根际土壤微生物（细菌、真菌、放线菌）的分离，一般是根据该微生物对营养、PH、氧气等要求的不同，给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其他菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法。

菌种的分离培养纯化和保存方法： 在超净工作台下将处理好的根际土壤菌悬液，以 0.5mL 的接种量接种到不同的培养基下，在 28℃～30℃培养箱中培养至长出菌落为止(24～30h)，根据不同的培养基上确定不同的菌株，记录菌落形态，分离纯化，并将分离纯化的菌株保存于试管斜面，放入冰箱中备用。

将分离纯化好的菌株，分别接种到马铃薯天然液体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、高氏一号液体培养基中，30℃，180r/min 摇床培养 24h，在无菌环境下取 0.2mL 接种到 Eppendorf 管中，加入 0.2mL 无菌甘油，置于-70℃以下保藏。

细菌分离培养实验方法：

（1） 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（或马铃薯天然培养基）

（2） 器材：直径9cm的无菌平皿、酒精灯、1ml无菌吸管、火柴、接种环、玻璃刮铲、记号笔等。

（3） 将稀释度为10-3 、10-4、10-5三个用玻璃刮铲涂抹于培养基上（涂抹稀释平板法），各做3个重复，可用于所分离菌的计数（与混菌法相配合）。

（4） 用无菌接种环沾取10-1 稀释液1环于已凝固的平板上进行划线。

（5） 培养:将上述接种过根际土壤悬液的平板倒置，于28℃～36℃培养，至长出菌落为止（24～36h）

（6） 挑菌纯化：通过对平板上菌落形态特征观察，大体推断有几种菌并记录其菌落特征。并对推断这几种菌分别从平板中选择分离较好的有代表性的单个菌落接种斜面，同时制作涂片镜检（革兰氏染色），若纯，进行拍照，观察其单个菌体形态并作好记录。反之，应挑取此菌落作进一步划线分离，或制成菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。

(7) 菌种保存：挑取纯化后有代表性的几个菌株单个菌落接种接种于斜面培养基上，在28℃～36℃培养5～7d,置于4℃冰箱中保存。

如需计数，可用“稀释平板测数法”（混菌法和涂抹法）进行测数。

放线菌的分离培养实验方法

（1） 在对根际土壤微生物进行稀释，可在盛无菌水的三角瓶中加10滴

100g/L的石碳酸溶液和50μg/ml的制霉素以抑制细菌和霉菌的生长。稀释至10-5

（2） 培养基：高氏一号琼脂培养基

（3） 器材：无菌吸管、无菌平皿、无菌水、接种环、酒精灯

（4） 将稀释度为10-2 、10-3、10-4三个用玻璃刮铲涂抹于培养基上（涂抹稀释平板法），各做3个重复，可用于所分离菌的计数。

（5） 培养：将上述接种过根际土壤悬液的平板倒置于28℃～30℃培养4～5d。

（6） 挑菌纯化：通过对平板上放线菌落形态特征观察，大体推断有几种放线菌记录其菌落特征。并对推断这几种放线菌分别从平板中选择分离较好的放线菌菌落（应于细菌菌落区别开）转接斜面，并制作纯度检查，若不纯，应进一步将该菌作稀释平板分离或划线分离，直至获得纯培养物。

（7） 菌种保存：挑取几种典型放线菌菌落各自分别接种接种于高氏一号斜面培养基上，在28℃～36℃培养5～7d,置于4℃冰箱中保存。

真菌的分离培养实验方法

（1） 将根际土壤微生物进行稀释至10-4 ；

（2） 培养基：加有氯霉素（或庆大霉素）和孟加拉红的马丁氏琼脂培养基（在1000ml培养基中加入注射用氯霉素2ml,孟加拉红33.4mg,均于灭菌前加入），配法见科学出版社《微生物学实验》 ；

（3） 器材：无菌平皿、1ml无菌吸管、9ml无菌水、酒精灯、玻璃刮铲 ；

（4） 将稀释度为10-1、102、10-3三个用玻璃刮铲涂抹于培养基上（涂抹稀释平板法），各做3个重复，可用于所分离菌的计数。

（5） 培养：将上述接种过根际土壤悬液的平板倒置于28℃培养3～5d。

（6） 挑菌纯化：通过对平板上真菌菌落形态颜色特征观察，大体推断有几种真菌记录其菌落特征。并对推断这几种真菌分别从平板中选择分离较好的真菌菌落转街斜面，并制作纯度检查，若不纯，应进一步将该菌制成菌悬液作稀释平板分离或划线分离，直至获得纯培养物。

（7） 菌种保存：将分离得到的几种具有典型的真菌转接PDA斜面上培养，待长好后置于4℃冰箱中保存。

（五） 根际微生物生理生化鉴定

（1） 糖发酵试验

配制试验所需的液体培养基，分装试管，每支试管 5mL，灭菌。在无菌条件下，用接种环取少许纯培养菌（菌龄在 18~24h），接种于发酵液体培养基试管中，在 28℃培养箱中培养 24h，60h，观察培养基颜色的变化及杜氏小管中有无气泡。

（2） 甲基红试验和 V-P 试验

配制试验所需的液体培养基，分装试管，每支 7mL，灭菌。在无菌条件下，挑取新的菌株少许（菌龄在 18~24h），接种于试管中，在 28℃培养箱中培养。五天后，取 1mL 培养液，加入甲基红指示剂 1~2 滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性则为黄色。

五天后，取 3mL 培养液，加入等量的氢氧化钠（40%）混合均匀，加入 1~2滴肌酸溶液，30min 后观察颜色变化。

（3） 过氧化氢酶试验

取一干净的载玻片，在上面滴 1 滴 3%~10％的 H2O2，挑取 1

环培养 18~24h的菌苔，在 H2O2溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性

（4） 牛奶石蕊

细菌对牛奶的作用有以下几种：

接种待测菌株（菌龄在 18~24h）于石蕊牛奶试管中，在 28℃下培养 3d、5d、7d 或 14d，按上述特征观察和记录牛奶产酸、产碱、凝固或胨化等反应。

（5） 淀粉水解试验

以 18~24h 的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）上，于 28℃培养 24~48h。然后将路哥尔氏典液直接滴浸于培养表面，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环。阴性反应a) 产酸――微生物发酵乳糖产酸，使石蕊变红。

b) 产碱――微生物分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。

c) 胨化――微生物产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶变得比澄清。

d) 酸凝固――微生物发酵乳糖产酸，使石蕊变化，当酸度很高时，可使牛奶凝固。

e) 凝乳酶凝固――有些微生物能产生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此时石蕊常呈蓝色或不变色。

f) 还原――微生物生长旺盛，使培养基氧化还原电位降低，因此石蕊还原褪色。

则无透明环。

（6） 纤维素降解试验

将纤维素的基础培养基分装试管，在培养基中浸泡一张滤纸条，灭菌。在无菌条件下接种新的菌株培养物，在 30℃培养 7d，观察试管中滤纸条的分解情况。

（7） 卵磷脂酶试验

将测试菌（菌龄在 18~24h）点接在卵黄平板上，每个培养皿可分散点接 4株菌、恒温 28℃下培养 24~48h，观察平板，若平板中菌落周围形成乳白色混浊环，表示卵磷脂被分解，生成脂肪，说明该菌株有卵磷脂酶存在。

（8） 明胶液化试验

挑取 18~24h 待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约 2/3 深度。于25℃培养 7d，观察结果。如果明胶被液化，即为试验阳性。

对（五）分离纯化所得的菌种进行（六）生理生化实验鉴定，并将得到的进行记录。

（六）实验表格的制作

将实验结果用Excel 整理制成表格。

（七）实验结果讨论及分析