蛋白质含量测定

实验十六 蛋白质含量的测定

衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。 一、目的与要求： 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。包括样品的消 化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。 二、原理： 凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。 ( 1 ) 2NH2(CH2)2COOH+13H2S04 (NH4)2S04+6C02+12S02+ 16H2 (2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4 (3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O (4) (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2 三、试剂与仪器： 1、硫酸钾 2、硫酸铜 3、硫酸 4、2％硼酸溶液 5、40％氢氧化钠溶液 6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成． 7、0.01mol/LHCL标准溶液或0．01mol/L硫酸标准溶液． 8、KDN-08A(04A)定氮仪 10、三角瓶250ml 3只。

11、量筒50ml、l0ml、l00ml。 12、吸量管10ml只。 13、酸式滴定管1支。 14、容量瓶100毫升1只。 15、小漏斗1只。

四、实验步骤 1.样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20毫升硫酸，将消化管分别放入消化架各个孔呢，然后置于消化炉上，然后开启抽气三通上自来水龙头，使抽气三通处于吸气状态，接通电源，在加热初始阶段防止样品飞溅（选用电压型控温的消化炉起先控制在150伏左右，15min左右后可满电压工作）。待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵同一方法做试剂空白试验。 2.蒸馏：(KDN-08A为例)蒸馏器中，碱液及蒸馏水采用电磁泵加入，NaOH ，H2O注入接口用橡胶管套入后分别置入自备的容器中，加液时按面板上相应开关，液体由泵吸入消化管内，注入毫升数视标尺所注位置而定（一般碱液加量是消化时硫酸用量5倍以上，加蒸馏水量15ml左右） 向接收瓶内加入50ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液于定氮瓶中，加入10ml 40%氢氧化钠溶液，开始蒸馏，在接收瓶内接收液达150ml左右时移下接收瓶，用蒸馏水冲洗滴管口，继续蒸馏半分钟，然后取下接收瓶，待滴定用。 3.滴定：取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。

同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。

计算：

X：样品中蛋白质的含量，g； （V1-V2）*N*0.014

X =------------------------------ +F*100 m*（10/100）

V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml； N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度； 0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数； m：样品的质量（体积），g（ml）； F：氮换算为蛋白质的系数。 注： （1）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。 （2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。 （3）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。 （4）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。 （5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。 （6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。 （7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。 （8）氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。 （9）吸收叶也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。 （10）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。 （11）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]++ 附：0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液及标定（自己查资料，写出操作步骤） 附定氮仪说明书 ‘

KDN-08A(04A)定氮仪

说明书 一．工作原理 定氮仪检测原理为（凯氏原理）： 取样 消化 蒸馏 滴定 计算 它由消化炉（可选本公司各个型号）与定氮仪蒸馏器组成。消化炉使用井式加热炉进一步打到完美，使试样置入消化管插入井式加热炉内加热取得最佳的热效应，在消化前置入催化剂进一步加速消化煮解，大大缩短消化时间。消化管内溢出的SO2等有害气体，通过消化管上的排污管经抽气三通由水带入下水道（也可用真空泵加回收瓶回收），有效的抑制有害气体的外逸，又省略了实验室中安装通风橱，试样经40分钟左右消化煮解，即可完全消化尽。 二．技术参数 1. 测定品种:粮食，饲料，食品，乳制品，饮料，土壤，水，药物，沉淀物和化学品等。 2. 测定样品量：固体＜5g/个，液体＜15ml/个。 3. 测定范围：0.1mgn-200mgn(含氮量0.02%-95%) 4. 工作电压:220V 50HZ 5. 电耗：蒸馏器800W，消化炉（四孔1200W）（八孔2400W） 三．操作方法 1. 试剂准备 a. 硫酸（比重1.84） b. NaOH溶液：400g NaOH溶于1000ml水中 c. 2%H3BO3 d. 0.1NHCL e. 催化剂：硒+无水硫酸钠（1:1000）或硫酸铜等 f. 指示剂：0.1%甲基红+0.5%溴甲酚绿（1：1） 2. 样品消化 称取经粉碎通过40-60目/寸样0.5-1克（视含氮量而定）无损地置入已洗涤烘干的消化管中加催化剂5g左右和10ml左右硫酸。 将消化管分别放入消化架各个孔呢，然后置于消化炉上，然后开启抽气三通上自来水龙头，使抽气三通处于吸气状态，接通电源，在加热初始阶段防止样品飞溅（选用电压型控温的消化炉起先控制在150伏左右，15min左右后可满电压工作）. 3. 蒸馏 (KDN-08A为例)蒸馏器中，碱液及蒸馏水采用电磁泵加入，NaOH ，H2O注入接口用橡胶管套入后分别置入自卑的容器中，加液时按面板上相应开关，液体由泵吸入消化管内，注入毫升数视标尺所注位置而定（一般碱液加量是消化时硫酸用量5倍以上，加蒸馏水量15ml左右） 1. 打开电源，打开自来水龙头，接冷却水自来水龙头不必开过大，出水口有谁流出即可，用排水管子上夹子夹紧排水管子。 2. 开面板上右边蒸汽开关手柄往上推为开蒸汽，同时把左边进水开关手柄往上推为开，待电流表指针指在2A-3A时（如果水进入侧面蒸发炉慢，电流表长时间没反应，请用吸合球往正面的细长管内吹几下以排除馆内空气，看示意图指示）马上关把坐标进水开关手柄往下压，压到底压不下为关（尽量不要关太慢，防止电流过大二烧坏15A保险丝），待蒸汽管喷出气后又上推打开左进水开关供水，1分钟左右后电流稳定在3.5-6A左右后，关闭右蒸汽开关手柄往下压到底，压不下为关。因为红色进水开关是控制机器内部产生蒸汽的水源开关，从测名的有机玻璃窗口内可以看到蒸发炉水位的高低，防止水位过高，因为一开始水没有沸腾，水不断进入，容易使电流过大而烧坏保险丝。蒸汽开关是起通断蒸汽作用，也是水源进入蒸汽炉和排除蒸发炉水（实验结束时）的排水器件。（如果蒸汽出来后电流不大请开关一下，红色蒸汽开关会正常）。（上推为开，下压为关） 2.在250ml三角接收瓶中加入50ml 2%H3BO3和2-3滴混合指示剂，并使接收瓶托架盘往上移，使滴管浸在液体中。 3．向上扳动侧面红球手柄把消化管固定在左边托架上，然后按面板上开关分别加入，水和NaOH液体，然后上推蒸汽开关，向试管内注入蒸汽，进行蒸馏样品，在接收瓶内接收液达150ml左右时移下接收瓶，用蒸馏水冲洗滴管口，继续蒸馏半分钟，然后取下接收瓶，待滴定用。 4.滴定 用0.1NHCL滴定接收瓶内的溶液，滴定溶液由绿色变成淡紫色时为止，记下消耗HCL的毫升数，按下列式子计算蛋白质含量：

蛋白质含量(%)=(V-V0)N 0.014A 100/W 式中 V 消耗HCL的毫升数 V0 空白实验时消耗HCl的毫升数 N HCl的当量浓度 0.014 1mlHCl的克当量数 A 固定系数（6.25,5.7,5.3等） W 试样重量g （空白测定：用0.1g糖代替样品或不加样品做空白测定） 四．注意事项 1. 消化时如气体外溢，加大自来水压力。消化密封圈每次实验结束清晰一遍延长使用寿命。 2. 如果操作不当，碱泵每天工作完把NaOH溶液外接皮管移入蒸馏水瓶内，前面套好消化管抽洗几次，防止碱浓度过高，残留在碱泵内而影响寿命，也可以防止单项阀阀芯粘连。待下次使用时，在蒸馏时须排出100ml NaOH，以防第一个样品NaOH浓度不够。过一段时间用稀酸清洗一下蒸发炉并用清水过洗几次，保养电极。 3. 如果操作不当，15A保险丝烧断后，请拔去电源插头，换上新的后，关水龙头，打开排水夹子排尽蒸发炉水，按照开机调试步骤重新开机操作。 4. 用户在遵守本仪器的运输，保管，安装和使用规程的条件下，如仪器因制造问题而不能正常工作时，从收货之日起一年内，或开箱时发现包装不良和损坏，附件与装箱单不符，少零件等情况，请与公司质监部门联系。