抗体膜片法检测乳腺癌患者血清C-erbB-2蛋白及其方法学评价

ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－４８４Ｘ．２０１０．１２．０１７　中国免疫学杂志２０１０年第２６卷　抗体膜片法检测乳腺癌患者血清Ｃ．ｅｒｂＢ．２蛋白及其方法学评价①　于秀艳　曾常茜②刘晓峰（吉林省肿瘤医院，长春１３００１２）　中国图书分类号Ｒ４４６．６１　文献标识码Ａ　文章编号１０００．４ｓ４ｘ（ｚｏｌｏ）１２－１１３０．０３　［摘要］　目的：建立血清Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白的抗体膜片检测方法，并进行方法学评价。方法：抗体膜片法检测血清Ｃ．ｅｒｂＢ．２　蛋白，免疫组化方法检测乳腺组织Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白。结果：３０例乳腺癌、２６例乳腺增生、３０例正常对照组血清中Ｃ．ｅｒｂＢ－２蛋白阳　性率分别为４０．０％、７．７％和６．７％，三组相比较有显著差异（Ｐ＜０．０５）；乳腺癌组织Ｃ—ｅｒｂＢ　２蛋白阳性和阴性者其血清Ｃ—ｅｒｂＢ－　２蛋白阳性率分别为９１．６７％和１１．１１％，血清与乳腺组织Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白表达具有相关性（Ｐ＜０．０１）；抗体膜片法检测血清Ｃ—　ｅｒｂＢ一２蛋白的灵敏度、特异度和准确度分别为４０．０％、９２．８％和７４．４％。结论：抗体膜片法检测血清Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白与乳腺癌病　理学诊断符合率高，且方法简便易行，临床具有实用价值。　［关键词］Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白；乳腺癌；乳腺增生；抗体膜片法　Ｍｅｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｓｅｒａｉ　Ｃ－ｅｒｂＢ－２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ＹＵ　ｎ，ＺＥＮＧ　Ｃｈａｎｇ－Ｑｉａｎ，删Ｘｉａｏ一　．Ｃａｎｃｅｒ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＪｉｌｉｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００１２，Ｃｈｉｎａ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｆｏｒ　ｓｅｒａｌ　Ｃ—ｅｒｂＢ一２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｔｌｅｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｂｏｄｙ／ｎｅｌｌｌｂｒａｎｅ　ｔｅｃｈ－　ｎｉｑｕｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｓｅｒａｌ　Ｃ—ｅｒｂＢ一２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ—ｅｒｂＢ一２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　Ｃ—ｅｒｂＢ一２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｓｅｒａ　ｏｆ　３０　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ，２６　ｂｒｅａｓｔ　ｐｒｏｌｉｆｅｒ－　ａｔｉｏｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｎｄ　３０　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｗｅｒｅ　４０．Ｏ％．７．７％ａｎｄ　６．７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅ　Ｗａｓ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｅｍｌ　Ｃ—ｅｒｂＢ－２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｓｅｍｌ　Ｃ—ｅｒｂＢ一２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｃ—ｅｒｂＢ一２　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｂｒｅａｓｔ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｃ—ｅｒｂＢ一２　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗｅｒｅ　９１．６７％ａｎｄ　１　１．１　１％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅ—　ｔｗｅｅｎ　ｓｅｒａｌ　Ｃ—ｅｒｂＢ一２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ—ｅｒｂＢ—ｐｒｏｔｅ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｔｉｓｓｕｅ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｃｙ　ｏｆ　ｓｅｒａｌ　Ｃ—　ｅｒｂＢ一２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｗｅｒｅ　４０．０％．９２．８％ａｎｄ　７４．４％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｓｅｒａｌ　Ｃ—ｅｒｂＢ－　２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｃｃｏｒｄｓ　ｗｉｔｈ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｉｎ　ｄｉｇｎｏｓｉｎｇ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｅａｓｙ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｃ—ｅｒｂＢ一２　ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ；Ｂｒｅａｓｔ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白是癌基因Ｃ：ｅｒｂＢ＇２编码的跨膜糖　蛋白受体，分子量为１８５　ｋＤ，因此又称ｐ１８５蛋白。　Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白具有酪氨酸激酶活性，被异常激活后　发生自身磷酸化，并磷酸化其他底物，引起下游的信　号转导，最终导致细胞的增殖乃至癌变。自从文献　报道Ｃ．ｅｒｂＢ一２扩增和／或过度表达与乳腺癌发生、发　展及预后的关系后，引起了人们对Ｃ—ｅｒｂＢ一２及其表　达产物研究的关注。伴随着Ｃ．ｅｒｂＢ．２蛋白功能的发　挥，受体的细胞外区域释放入血，血清Ｃ．ｅｒｂＢ．２蛋白　①本文为长春市科技发展计划项目（Ｎｏ．０３－２０５５４４）　②大连大学辽宁省生物有机重点实验室，大连１１６６２２　作者简介：于秀艳（１９６８年一），女，主任技师，主要从事肿瘤免疫学　研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｕｘｉｕｙａｎ１９６８＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ；　通讯作者及指导教师：曾常茜（１９６４年一），女，教授，研究生导师，主要　从事肿瘤免疫学研究，Ｅ．ｍａｉｌ：ｚｅｎｇｃｈａｎｇｑｉａｎ＠　１６３．ｃｏｒｎ　水平对于判断乳腺癌的发生、发展、预后及复发具有　重要意义［　。本实验采用抗体膜片检测血清Ｃ—　ｅｒｂＢ一２癌蛋白，旨在为乳腺癌的诊断提供特异、敏　感、实用的检测方法。　１材料与方法　１．１材料　１．１．１标本来源　乳腺癌患者术前血清及组织３Ｏ　例（经病理确诊），由吉林省肿瘤医院提供，患者均为　女性，年龄２４～７５岁，其中浸润性导管癌１７例，浸　润性小叶癌１０例，导管原位癌１例，小叶原位癌１　例，乳头状癌１例。乳腺增生患者术前血清及组织　２６例（经病理确诊），由北华大学医学院附属医院提　供，患者均为女性，年龄２３～５０岁。正常血清３０　份，由北华大学医学院附属医院提供，均为女性，年　龄２５～４６岁。

　于秀艳等抗体膜片法枪测乳腺痛患者血清Ｃ－ｅｒｂＢ．２蛋白及其方法学评价第１２期　１．１．２试剂Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白单克隆抗体（Ａ１８、Ａ２１）　均为中国科技大学生命学院刘兢教授惠赠；乳腺癌　细胞珠ＭＣＦ一７由吉林省肿瘤研究所提供；Ｃ．ｅｒｂＢ．２　蛋白阳性抗原为ＳＫＢＲ一３细胞裂解液，购自美国　Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ公司；ＮＣ膜为丹麦ＮＵＮＣ公司产品；辣根　过氧化物酶标记链亲合素（ＳＡ—ＨＲＰ）购自北京中山　生物技术有限公司；超敏ｓＰ试剂盒、Ｃ—ｅｒｂＢ一２单克　隆抗体、ＤＡＢ、ｃ—ｅｒｂＢ一２免疫组化阳性对照片、多聚一　Ｌ一赖氨酸均购自福州迈新生物技术开发公司。　１．２方法　１．２．１　Ｃ．ｅｒｂＢ一２单克隆抗体Ａ２１的生物素标记　（Ｂｉｏ—Ａ２１）及鉴定参照文献［５］方法进行。　１．２．２抗体膜片法检测血清Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白　用Ｃ—　ｅｒｂＢ一２单克隆抗体（Ａ１８）溶液（２０　ｔ￣ｇ／ｍ１）点样５　ｌ，　待膜干燥后，用ＰＢＳＴ洗膜５次。加１％ＢＳＡ溶液　３７℃封闭３０分钟，用ＰＢＳＴ洗膜５次。点加待测血　清５　ｐｄ，同时设ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白阳性和阴性对照，３７ｃＣ　孵育４０分钟，ＰＢＳＴ洗膜５次。点加生物素标记的　Ｃ－ｅｒｂＢ一２蛋白单克隆抗体（Ｂｉｏ—Ａ２１）（１：５００）５　ｌ，　３７￣Ｃ孵育３０分钟，ＰＢＳＴ洗膜５次。点加２　ｔ￣ｇ／ｍ／　ＳＡ—ＨＲＰ　５　ｌ，３７℃孵育３０分钟，ＰＢＳＴ洗膜５次。点　加ＤＡＢ溶液５　ｌ，３７℃反应１５分钟，斑点出现后取　出。用冰醋酸终止反应。　１．２．３免疫组化方法检测组织Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白表达　采用ｓＡ．生物素一ＨＲＰ复合物法（ＳＰ法）。按照　ｓＰ免疫组化试剂盒说明书操作，其中鼠抗人Ｃ—ｅｒｂＢ一　２单克隆抗体稀释度为１：２００，按美国食品和药品管　理局（ＦＤＡ）推荐的Ｈｅｒｌｅｐ　Ｔｅｓｔ评分标准判定结果。　１．２．４　ＥＬＩＳＡ方法检测血清ｃ—ｅｒｂＢ．２蛋白参考文　献［５］的方法。　１．３统计学分析采用　检验，以Ｐ＜０．Ｏ１为差　异有显著意义，以Ｐ＞０．０５为差异无显著意义。　１．４方法学评价　以病理诊断作为乳腺癌诊断的　金标准，对血清Ｃ．ｅｒｂＢ．２蛋白鉴别诊断乳腺癌作方　法学评价，计算敏感度、特异度、准确度。　２结果　２．１抗体膜片法和ＥＬＩＳＡ法检测血清Ｃ—ｅｒｂＢ．２蛋白　结果抗体膜片法检测血清Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白结果见图　１，３０例乳腺癌血清中，Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白１２例阳性，１８　例阴性，阳性率为４０．０％。２６例乳腺增生血清中，　Ｃ．ｅｒｂＢ一２蛋白２例阳性，２４例阴性，阳性率为７．７％。　３０例正常对照血清中，Ｃ．ｅｒｂＢ．２蛋白２例阳性，２８例　阴性，阳性率为６．７％。经Ｙ　检验，乳腺癌组血清　Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白与乳腺增生、正常对照组相比较有显　著差异（Ｐ＜０．Ｏ５）。　上述血清标本同时用ＥＬＩＳＡ法检测血清ｃ—　ｅｒｂＢ一２基因蛋白，结果３０例乳腺癌血清中，Ｃ．ｅｒｂＢ．２　蛋白１３例阳性，ｌ８例阴性，阳性率为４３．３％。２６例　乳腺增生血清中，Ｃ．ｅｒｂＢ一２蛋白３例阳性，２３例阴　性，阳性率为１１．５％。３Ｏ例正常对照血清中，Ｃ．　ｅｒｂＢ一２蛋白２例阳性，２８例阴性，阳性率为６．７％。　经　检验，乳腺癌组血清ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白与乳腺增　生、正常对照组相比较有显著差异（Ｐ＜０．０５）。　抗体膜片法与ＥＬＩＳＡ法检测血清Ｃ．ｅｒｂＢ．２基因　蛋白的结果经统计学处理，二者无显著性差异（Ｐ＞　０．０５）。　２．２乳腺组织ｃ．ｅｒｂＢ　２蛋白表达结果３０例乳腺　癌组织中，Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白１２例阳性，１８例阴性，阳性　率为４０％。２６例乳腺增生组织未发现Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋　白的表达。经　检验，乳腺癌组织ｃ．ｅｒｂＢ．２蛋白的　表达与乳腺增生组织相比较有显著差异（Ｐ＜　０．０５）。　２．３血清Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白与乳腺组织Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白　表达相关性结果　３０例乳腺癌组织中，１２例ｃ—　ｅｒｂＢ．２蛋白阳性中有１１例血清Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白升高，　１８例Ｃ—ｅｒｂＢ．２蛋白阴性中有２例血清Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白　升高。经　检验，血清ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白与乳腺组织　Ｃ—ｅｒｂＢ．２蛋白表达比较Ｐ＜０．Ｏ１，说明血清Ｃ—ｅｒｂＢ一２　蛋白与乳腺组织Ｃ—ｅｒｂＢ一２蛋白表达存在相关性。　２．４方法学评价结果　以病理诊断作为乳腺癌诊　断的金标准，对血清Ｃ．ｅｒｂＢ．２蛋白鉴别诊断乳腺癌　图１血清Ｃ．ｅｒｂＢ．２蛋白检测结果　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｓｅｒａｌ　Ｃ・ｅｒｂＢ－２　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｎｏｔｅ：１．Ｐａｔｉｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃ—ｅｒｂＢ一２　ｐｒｏｔｅｉｎ；２．Ｐａｔｉｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃ—　ｅｒｂＢ－２　ｐｒｏｔｅｉｎ；３．Ｐａｔｉｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃ—ｅｒｂＢ一２　ｐｒｏｔｅｉｎ；４．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｅｏｎｔｒｏｌ；５．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏ１．　表１血清Ｃ．ｅｒｂＢ．２蛋白诊断乳腺癌的方法学评价　Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｓｅｒａｌ　Ｃ－ｅｒｂＢ－２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔ