H6N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立

禽流感病毒的免疫研究进展禽流感是由禽流感病毒（avian influenza virus）引起的家禽呼吸系统疾病，主要感染家禽，如鸡、鸭、鹅等，但极少数情况下也可以传染给人类。

自从2003年中国发生了SARS疫情以来，禽流感疫情就被公众所关注。

禽流感的爆发不仅对家禽养殖业产生了巨大的经济影响，更是对人类健康造成了巨大的威胁。

因此，对禽流感的病毒学特性和免疫学研究已经成为了当前研究的热点之一。

禽流感病毒的病理学特性禽流感病毒是一种RNA病毒，属于正反式病毒科（Orthomyxoviridae），分为A、B、C、D四种型号。

其中只有A型和B型病毒会引起流感病毒，而D型病毒则主要感染牲畜。

A型病毒具有高变异率和广泛感染性，可以感染多种动物和人类。

据统计，自2003年开始，全球已经发生了多次禽流感大规模暴发，间歇性地在全球不同地区爆发。

1.清洁蛋白材料。

禽流感病毒外表皮有两种糖蛋白质：血凝素和神经氨酸酯化酶。

其中血凝素是禽流感病毒的主要清洁标记物，其血凝素亚型不同决定了其毒性和致病性的差异。

2.覆盖膜。

每个病毒都包含了一层薄膜，这是由病毒在宿主细胞内复制过程中夺取细胞膜形成的。

病毒的薄膜的主要成分是磷脂类物质和覆盖蛋白质。

3.病毒复制能力。

禽流感病毒具有强大的复制能力和变异能力，可以在任何宿主内复制。

病毒的感染和复制也受到宿主细胞的限制，禽流感病毒能感染和复制于多种宿主细胞中，然而只在特定环境下才会产生足够的病毒产生细胞，从而继续传播病毒。

禽流感病毒的病原学特性决定了其研究的重要性，研究其免疫学特性则是控制禽流感疫情的重要途径之一。

禽流感病毒的免疫学特性主要涉及以下几个方面。

1.病毒抗原结构分析。

研究禽流感病毒血凝素、内质膜蛋白、核蛋白、非结构蛋白等多种蛋白结构，寻找高度保守的免疫原性表位，为开发新型疫苗提供理论依据。

2.疫苗研发。

目前，研究禽流感病毒免疫学特性主要集中在疫苗的研制上。

禽流感病毒的血凝素亚型具有多样性，不同亚型的血凝素互相之间没有交叉保护能力。

利用反向遗传技术对H_3N_2亚型流感病毒NA基因突变的研究韩冰孝;董长颖【摘要】In order to save the reorganization of a new virus of the H3N2 influenza virus,H3N2 wild type and three mutationtype(E119D+I222L,E119D and I222L) viruses were generated by reverse genetics;The reverse genetics viruses were stable after five passages in MDCK cells.Successfully generated H3N2 wild type and mutation type viruses;The wild type had a similar virus titer with the mutation typeE119D;The virus titer of E119D+I222L and I222L type were lower than the wild type.These results indicated that double mutation(E119D+I222L) type H3N2 could induce a high level of oseltamivir resistance.NA and the first 222 amino acids compared to 119 amino acids seem to be more important.%为了拯救出H3N2亚型流感病毒的重组新病毒,利用反向遗传学手段,8个质粒共同转染293T细胞,包装带有双点突变（第119位氨基酸由E突变为V,第222位氨基酸由I突变成L）、单点突变和野生型的流感病毒H3N2;在MDCK细胞中传代包装成的H3N2病毒。

禽传染性支气管炎病毒H52反向遗传株的构建许记刚;王红宁;杨鑫;李然;姬高升【摘要】IBV H52基因组全长27.6kb,分13个1.3～2.9kb的片段扩增H52全长cDNA,额外扩增N-3'片段,并克隆到载体PMD19-T上.利用No see'm技术在每个片段中引入Bsa Ⅰ或BsmB Ⅰ酶切位点,D1片段中引入沉默突变位点,在5'UTR端和N-3'引入T7启动子,3 'UTR端引入Poly(A)尾.将克隆好的13个片段酶切,纯化,体外无缝连接为全长cDNA.将全长cDNA及N-3'体外转录获得它们的转录体,将转录体共转染BHK-21细胞,48h后收获细胞液,将细胞液接种10日龄SPF鸡胚获得反向遗传株H52-R.在鸡胚中盲传5代后,通过RT-PCR对无义突变位点进行扩增及序列分析,在反向株H52-R中发现引入的无义突变位点.对反向株H52-R的一些生物学特性如HA、EID50等测定发现,H52-R的这些生物学特性与亲本株H52相似.【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(053)003【总页数】7页(P664-670)【关键词】IBV;H52;反向遗传;H52-R【作者】许记刚;王红宁;杨鑫;李然;姬高升【作者单位】四川大学生命科学学院,动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室,生物资源与生态环境教育部重点实验室,“985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台,成都 610064;四川大学生命科学学院,动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室,生物资源与生态环境教育部重点实验室,“985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台,成都 610064;四川大学生命科学学院,动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室,生物资源与生态环境教育部重点实验室,“985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台,成都 610064;四川大学生命科学学院,动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室,生物资源与生态环境教育部重点实验室,“985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台,成都 610064;四川大学生命科学学院,动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室,生物资源与生态环境教育部重点实验室,“985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台,成都 610064【正文语种】中文【中图分类】Q789禽传染性支气管炎(avian infectious bronchitis, IB)是危害养禽业的重大传染病之一，它是由禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus, IBV)引起的一种高度接触性传染病[1]，以呼吸道症状、产蛋鸡产蛋量下降、蛋品质下降、肾脏病变及胃肠道病变为主要特征[2].IBV属于冠状病毒科冠状病毒属[3].IBV在全球流行，并且由于不同IBV毒株在致病性和组织嗜性上差异大，血清型极其复杂，不同的血清型之间缺乏有效的交叉保护，新的变异株不断出现，导致IBV的防控非常困难[4].IBV的基因组为单股正链RNA，基因组全长约为27.6kb,其5′端和3′端各有一个非编码区(Untranslated region, UTR)，为IBV 基因组复制所必须，3′-UTR后具有PolyA尾.对RNA病毒来说，反向遗传学技术主要指全长cDNA感染性克隆技术，包括病毒基因组全长cDNA的克隆拼接技术和全长cDNA转录获得感染性转录体制备技术[5].目前，有关IBV反向遗传研究主要集中在Beaudette毒株上.Casais等2001年使用痘苗病毒载体首次对Vero细胞适应性株Beaudette进行反向遗传操作并成功获得其反向拯救株BeauR[6]，在所构建Beaudette毒株的基础，使用M41毒株S基因胞外域将Beaudette毒株S基因相对应区域进行替换，所获得拯救毒株BeauR-M41(S)不能够在Vero、BHK21细胞中进行复制证明了IBV S蛋白决定了病毒组织嗜性而与病毒的毒力无关[7].Yount等首次使用体外连接方法对Beaudette毒株进行反向操作，并使用EGFP蛋白对5a进行替换发现5a基因为病毒复制非必须基因[8].Hodgson等使用所构建Beaudette反向毒株的基础上证明了3a，3b为病毒复制非必须基因[9].Fang等对Beaudette毒株进行反向操作发现非结构蛋白nsp13点突变为病毒致死性突变[10]. IBVBeaudette细胞适应株作为IBV机理研究的经典毒株，在细胞中的培养技术已经成熟.但Beaudette株的免疫原性较弱，不能作为疫苗株来使用[11].因此构建其他毒株尤其是疫苗株的反向遗传系统不仅为操作IBV基因组提供新的平台，也为研制新型IBV疫苗提供新的途径.目前我国对IB的防制主要以疫苗免疫为主，其中又以弱毒疫苗(H52和H120)的使用最为普遍，H株疫苗能对许多变异型IBV提供有效的交叉免疫保护[12].2012年本实验室首次成功构建了非细胞适应IBV弱毒活疫苗株H120的反向遗传系统[13].IBV H52株与H120株同为弱毒活疫苗株，两者同源率为96.8%，S基因同源率为98.7%，S1基因同源率为99.1%，S2基因同源率为98.4%，在遗传进化树上分化为两支.并且两者在毒力方面不同，H52株比H120株的毒力略强.构建IBV H52株的反向遗传系统可以为操作病毒、研究IBV毒株的毒力基因提供支持.在本文中，我们采用改进的No See’m连接技术和多片段同时连接的方法，成功体外连接出IBV H52株的全长cDNA，并获得了IBV H52株的反向遗传拯救株IBVH52-R，研究了拯救株H52-R的生物学特性.IBV H52株，传代细胞BHK-21，大肠杆菌DH5α株、兔源A型魏氏梭菌由四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室保存.载体pMD19-T购自TaKaRa公司.SPF鸡胚购自北京梅里亚实验动物中心.其它试剂如:TrizolMS(Invitrogen)；Superscript Ⅲ First-Strand Synthesis System(Invitrogen)；KOD-plus-高保真酶(TOYOBO)；DNA Ligation Kit Ver 2.0(TaKaRa)；T4 lingase(TaKaRa)；CIAP(TaKaRa)限制性内切酶(NEB)；mMESSAGE mMACHINE Ultra T7 Kit(Ambion)；DNA凝胶回收试剂盒(OMEGA)；DNA Marker(TaKaRa)分别购自相应的公司.在KOD-plus-高保真酶体系中，使用13个片段对应的引物、N-3′引物和cDNA模板进行PCR扩增，反应条件为94℃ 5min，94℃ 30s,55℃ 30s(退火温度根据各对引物的Tm值而定)，72℃ 2～4 min(延伸时间依对应片段的大小而定)(30个循环)，最后72℃延伸10min.获得14个PCR产物用琼脂糖凝胶纯化，然后TA克隆到pMD19-T载体上，为了获得与IBV H52株各片段的序列完全一致的重组质粒，各片段分别选取3～5个单克隆送生工测序.将测序正确的重组质粒保存.用T4连接酶将13个片段连接为A、B、C、D 4个片段，连接策略为：A1+A2+A3,B1+B2+B3,C1+C2+C3,D1+D2+D3+D4.ABCD 4个连接产物用0.7%的琼脂糖凝胶回收纯化，并用核酸蛋白仪测定核酸浓度.反应体系37℃温育2h后，加入1μL TURBO DNase，温育15min.-80℃保存.同时，将BHK细胞培养至单层时，用0.25%胰酶消化，加入8mL DMEM完全培养基，悬浮细胞，4℃ 400g离心3min，弃上清，加入10mL不含FBS、青链霉素的DMEM重悬细胞，4℃ 400g离心3min，重悬细胞于不含FBS、青链霉素的DMEM，使细胞浓度约为1×107/mL，将细胞置冰浴中10min，取0.8mL转入0.4mL电击杯中，将1μg转录体与细胞小心混匀.进行电穿孔，使用Gene Pulser Xcell系统，电击参数为：电压400v、脉冲时长25ms、脉冲次数3、脉冲间隔0.5s.电击结束后，将电击杯置冰浴中5min，将细胞稀释后转入培养瓶中，用含10%的 FBS的DMEM培养基37℃培养48h.将收获的细胞液接种至10日龄的SPF鸡胚，盲传5代后，收获鸡胚尿囊液.分13个片段对IBV H52全基因组进行RT-PCR扩增，分别获得了长度约1.6kb,2.7kb,2.8kb,2.2kb,2.3kb,2.3kb,2.0kb,1.9kb,2.7kb,2.7kb,1.3kb,1.3kb,1.2 kb的片段，与预期大小一致.如图1，对N-3′片段进行扩增，获得1.7kb左右的片段.如图2.4个1/4片段的连接结果如图3.分别回收7.2kb、6.9kb、6.7kb、6.7kb左右的目的片段并定量，浓度为50ng/μL.每个片段的制备量为400μL左右.琼脂糖凝胶电泳结果显示，纯化后的4个片段条带单一.将4个1/4片段等摩尔连接后，进行琼脂糖凝胶电泳，连接产物可见大小约为27.6kb的条带. 将全长cDNA产物进行浓缩，取1μL进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得了高浓度的IBV H52全长cDNA如图4.IBV H52株基因组全长cDNA转录物及N-3′转录物共转染BHK-21细胞后48h 时，部分细胞贴壁不牢但不完全脱落，在倒置显微镜下均匀出现大量变亮的细胞，如图5.在本研究中，我们建立了非细胞适应株IBV H52株的反向遗传体系.就目前的数据来看，IBV H52-R的生物学特性以及免疫特性包括EID50，HA，免疫保护等都与亲本株H52相似.这种情况与其他冠状病毒的类似，如IBV Beaudette株，MHV，TGEV，IBV H120[14-16].本研究将IBV H52全长cDNA分为13个1.6～2.9kb的连续的亚克隆，这样的分段策略更容易获得与原序列一致的亚克隆，并且重组质粒在Ecoli中也更稳定.Fang和Youn等建立的IBV反向遗传体系将IBV全长cDNA分为6～8个连续的亚克隆，每个亚克隆大小约为3～7kb，这样虽然减少了亚克隆的数量，但是要获得与原序列一致的亚克隆相对困难，而且包含长片段的重组质粒很难转入细菌，导致某些重组质粒在E.coli不能稳定复制.本研究采用与IBV H120相似的分段策略，成功获得了反向遗传拯救株H52-R，再次证实了这种分段策略的可行性.IBV H52并不能在传代细胞BHK-21上生长，只能适应原代细胞.在本研究中，通过电穿孔的方式将IBV H52的感染性RNA转染入BHK-21细胞中，发现BHK-21细胞出现了明显的病变，并获得了反向遗传拯救株H52-R.这表明我们利用BHK-21细胞来拯救IBV H52病毒是可行的.因此，对于那些不能适应常用的传代细胞的IBV毒株，可以通过反向遗传的方法来实现病毒拯救.Armesto等构建了重组病毒BeauR-4/91(S)，并表达IBV 4/91(UK)的S蛋白，发现该重组病毒能够对野毒4/91(UK)产生很好的免疫保护作用[17].Casais、Yount 等分别缺失5a和使用EGFP对5a进行替换证明5a基因为病毒复制非必须基因.Hodgson等2006年使用所构建Beaudette反向毒株的基础上证明了3a，3b 为病毒复制非必须基因.Bentley等2013年使用报告基因hRluc替换3ab，5ab 后所拯救毒株能够对其稳定表达[18]，这些研究表明IBV作为载体疫苗是可行的.IBV H52比Beaudette株拥有更强的免疫原性，因此更适合作为疫苗载体来表达其他抗原基因，并且IBV H52的基因组全长27.6kb，具有更大的空间来容纳更大的外源抗原基因.因此，利用我们构建的反向遗传系统可以将其他禽RNA病毒的抗原基因替换IBV的复制非必须基因来制作新型二联或多联疫苗.本研究表明，IBV H52拯救株H52-R与亲本株H52具有相似的生物学特性以及免疫特性，通过反向遗传技术修饰或重组现有的疫苗株IBV H52，研发新型基因工程疫苗具有广阔的前景.。