微生物分类鉴定

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4.栖热嗜油菌属 ( 栖热嗜狮菌
AA. 不能在 60 o C 以上生长 图 14-4 双歧法检索表例样
应用 BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位， 近年来也时有应用。在 BIOLOG-GN 仪上有 96 个小孔，其中 95 孔内分装有 95 种不同
便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。
分离菌株 16S rRNA 基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞
,加
入 100μL 无菌重蒸 H 2 O 中 , 旋涡混匀后 , 沸水浴 2min, 12 000r min -1 离心 5min, 上
清液中即含 16S rRNA 基因，可直接用于 PCR 扩增。分离菌株 16S rRNA 基因的 PCR 扩
和稳定； 而且促进对细菌类群的全面考查和观察， 为细菌的分类鉴定积累大量资料。 但在使
用数值分类法对细菌菌株分群归类定种或定属时，还应做有关菌株的
DNA 碱基的 G +
Cmol% 和 DNA 杂交，以进一步加以确证。
（ 三）、化学分类法
微生物分类中，根据微生物细胞的特征性化学组分对微生物进行分类的方法称化学分 类法 (chemotaxonomy) 。在近二十多年中，采用化学和物理技术采研究细菌细胞的化学组 成，已获得很有价值的分类和鉴定资料，各种化学组分在原核微生物分类中的意义见表 14-4 。
就需做核酸杂交试验。
2 、 DNA-DNA 杂交
DNA 杂交法的基本原理是用 DNA 解链的可逆性和碱基配对的专一性， 将不同来源的
DNA 在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链
DNA ，然
后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链
DNA 的碱基顺序全部相同，
则它们能生成完整的双链，即杂合率为
BIOLOG-GN 分析和 16S rDNA
序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。
表 14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据
经
个体：细胞形态、大小、排列方式，染色反应，有无运动，各种特殊构造特征等
形态特征：菌落形态，在固体、半固体或液体培养基中的生长状态等
典
营养要求：碳源、氮源、矿质元素、生长因子等
碳源的缓冲液， 1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养
物，定温培养，每日定时读取 BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时
1 周，
BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。
（二）、数值分类法
又称阿德逊氏分类法 () 。它的特点是根据较多的特征进行分类， 一般为 50 ～ 60 个，
进行 29 个循环， PCR 反应在 PTC-200 型热循环仪上进行。 取 5 m L 反应液在 10g L -1 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 PCR 产物测序可由专门技术公司完成。
测序得到 分离菌株 16S rDNA 部分序列，此序列一般以 *. 形式保存，可以用写字板 或 Editsequence 软件打开，将所得序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数据进行比对 分析 ( ) ，具体步骤如下：点击网站中 Nucleotide BLAST 下 Nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] 选项，将测序所得序列粘贴在 “ search网页”空白处，或输入测序结果所在文件夹目 录，点击核酸比对选项，即 “ blast ，然”后点击 “ format ，”计算机自动开始搜索核苷酸数据 库中序列并进行序列比较， 根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属， 以及菌株相关信 息，从而初步判断 16S rDNA 鉴定结果。
(dendrogram)( 图 14-6) ，再结合主观上的判断 ( 如划分类似程度大于 85 ％者为同种， 大
于 65 ％者为同属等 ) ，排列出 — 个个分类群。
图 14-5 显示 6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图
图 14-6 根据相似矩阵图转换的相似关系树状谱
数值分类法的优越性在于它是以分析大量分类特征为基础，对于类群的划分比较客观
100% 。如果两条单链 DNA 的碱基序列只有部分
相同，则它们能生成的 “双链 ”仅含有局部单链，其杂合率小于 100% 。由此；杂合率越高，
表示两个 DNA 之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠
埃希氏菌的 DNA 杂合率可高达 100 ％，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的 DNA 杂合率较
分古菌。 霉菌酸的分析测定己成为诺卡氏菌形放线菌分类鉴定中的常规方法之一。
鞘氨醇单
胞菌和鞘氨醇杆菌等细胞膜都含有鞘氨醇， 因此鞘氨醇的有无可作为此类细菌的一个重要标
志。此外某些细菌原生质膜中的异戊间二烯醌，细胞色素，以及红外光谱等分析对于细菌、
放线菌中某些科、属、种的鉴定也都十分有价值。
（四）、遗传学分类法
表 14-4 细菌的化学组分分析及其在分类水平上的应用
细胞成份 细胞壁 膜
蛋白质
代谢产物 全细胞成分分析
分析内容 肽聚糖结构 多糖 胞壁酸 脂肪酸 极性类脂 霉菌酸 类异戊二烯苯醌 氨基酸序列分析 血清学比较 电泳图 酶谱 脂肪酸 热解 —气液色谱分析 热解 — 质谱分析
在分类水平上的作用 种和属 种和属
G+C mol ％来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。值得注意的是，亲缘关系 相近的菌，其 G+C mol ％含量相同或者近似，但 G+C mol ％相同或近似的细菌，其亲缘 关系并不一定相似，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的
DNA 的 GC mol% 在 37 ～ 51 之间， 企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然 是不现实的。要比较两种细菌的 DNA 碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，
生理生化特征：代谢产物种类、产量、显色反应等 分
酶：产酶种类和反应特征等
类
生态学特性：生长温度，对氧的需要，酸碱度要求，宿主种类，生态分布等
血清学反应
法
噬菌体的敏感性
其他
二、微生物鉴定的技术与方法
根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞 形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平；
18S rRNA ）中。
rRNA 参与生物蛋白质的合成过程， 其功能是任何生物都必不可少的， 而且在生物进化的漫
长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在
16S rRNA 分子中，既含有高
度保守的序列区域， 又有中度保守和高度变化的序列区域， 因而它适用于进化距离不同的各
类生物亲缘关系的研究。第三， 16S rRNA 的相对分子量大小适中，约 1 540 个核苷酸，
多者可达 100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理
生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，
并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵
( 图 14-5) 。为便于观察，
应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱
可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的
GC mol% 范围。 DNA 中 GC mol%
分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌
DNA 中 GC 含量的变化范围一般在 25 ％～
75 ％；而放线菌 DNA 中的 GC 比例范围非常窄 (37 ％～ 51%) 。一般认为任何两种微 生物在 GC 含量上的差别超过了 10 ％，这两种微生物就肯定不是同一个种。因此可利用
属和属以上单位
种和属 种和亚种
随着分子生物学的发展，细胞化学组分分析用于微生物分类日趋显示出重要性。细胞
壁的氨基酸种类和数量现己被接受为细菌属的水平的重要分类学标准。
在放线菌分类中， 细
胞壁成分和细胞特征性糖的分析作为分属的依据， 已被广泛应用。 脂质是区别细菌还是古菌
的标准之一，细菌具有酰基脂 ( 脂键 ) ，而古菌具有醚键脂，因此醚键脂的存在可用以区
生理生化特征进行分类， 并在分类中将表型特征分为主、 次。一般在科以上分类单位以形态
特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。 最后，采用双歧法整理实验结果，
排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图
百度文库
14-4 ）。
A. 能在 60 o C 以上生长
B. 细胞大，宽度 ~1.8mm ……………………………………… ( Thermomicrobium )
遗传距离矩阵与系统发育树构建， 可采用 DNAStar 软件包中的 MegAlign 程序计算样
本间的遗传距离。由 GenBank 中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起
热1. 微菌属
BB. 细胞小，宽度 ~0.8mm
C. 能以葡萄糖为碳源生长
D. 能在 生长 ……………………………………………
热2.酸菌属 ( Acidothermus )
DD. 不能在 生长 ………………………………………………… ( Thermus )
栖3.热菌属
CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源 属 Thermoleophilum )
在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称 为经典的分类鉴定法。 其他三种实验技术主要是 60 年代以后采用的， 称为化学分类和遗传 学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。
（一）、经典分类鉴定法
经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态
增和序列测定的一般步骤为： 16S rRNA 基因的 PCR 引物： 5'-AGAGT TTGAT CCTGG
CTCAG-3' ； 5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3' 。扩增反应体积 50 m L ，反应条件 为 95 ℃预变性 5min ， 94 ℃变性 1min ， 55 ℃退火 1min ， 72 ℃延伸 2min ，共
结果用 Tm(e) 和 RNA 结合数表示。 Tm(e) 值是 DNA 与 rRNA 杂交物解链一半时所需
要的温度。 RNA 结合数是 100 m gDNA 所结合的 rRNA 的 m g 数。根据这个参数可以
作出 RNA 相似性图。在 rRNA 相似性图上，关系较近的菌就集中到一起。关系较远的菌
低，约有 70 ％。 G+Cmol ％的测定和 DNA 杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新
的途径， 解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，
但对于许多属以上分类单元
间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。
3 、 DNA — rRNA 杂交
目前研究 RNA 碱基序列的方法有两种。一是 DNA 与 rRNA 杂交，二是 16S rRNA 寡核苷酸的序列分析。 DNA 与 rRNA 杂交的基本原理、实验方法同 DNA 杂交一样，不 同的是① 是 DNA 杂交中同位素标记的部分是 DNA ，而 DNA 与 rRNA 杂交中同位素 标记的部分是 rRNA 。② DNA 杂交结果用同源性百分数表示，而 DNA 与 rRNA 杂交
第三节 微生物的分类鉴定方法
一、微生物鉴定的依据
获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在
分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，
从平板菌落的
特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表
14-3 所示的经
典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的
分子遗传学分类法是以微生物的遗传型
( 基因型 ) 特征为依据， 判断微生物问的亲缘
关系，排列出一个个的分类群。目前较常使用的方法有：
1 、 DNA 中 G+C mol% 分析
每一个微生物种的 DNA 中 GC mol% 的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条
件等的变化而变化， 而且在同一个属不同种之间， DNA 中 GCmol% 的数值不会差异太大，
在图上占据不同的位置。用 rRNA 同性试验和 16SrRNA 寡核苷酸编目的相似性比较
rRNA 顺反子的实验数据可得到属以上细菌分类单元的较一致的系统发育概念， 细菌的建立。
并导致了古
4 、 16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析
首先， 16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是