重组RNA干扰表达载体的构建与鉴定

山地农业生物学报３４（３）：０４８～０５４，２０１５　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　

重组ＲＮＡ干扰表达载体的构建与鉴定　田　宇，杜娟，李尚伟　（贵州大学昆虫研究所，贵州山地农业病虫害重点实验室，贵州贵阳５５００２５）　摘要：干扰（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是指在进化过程中高度保守的、由双链ＲＮＡ诱发的、同源ｍＲＮＡ高效特异　性降解的现象。本研究以稻纵卷叶螟可溶型海藻糖酶基因（ＣｍＴｒｅ１）为靶标，设计ＲＮＡｉ靶位点并将其命名为　ＣｍＴｒｅｌ　，在其两端分别添加ＢａｍＨ　Ｉ与Ｓｐｅ　Ｉ酶切位点并进行人工合成，然后经双酶切后与ｐ１３０１植物表达载体　连接，构建重组表达栽体ｐ１３０１一ＣｍＴｒｅｌ　。ＰＣＲ、双酶切和测序鉴定结果证明重组表达载体ｐ１３０１一ＣｍＴｒｅｌ　构　建成功，并将其成功转入农杆菌ＬＢＡ４４０４，构建基因工程茵。用含有ｐ１３０１一ＣｍＴｒｅｌ　质粒的农杆茵ＬＢＡ４４０４浸　染中花１１号水稻的愈伤组织，经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生，获得２６株阳性转基因植株。用取食　非转基因水稻的稻纵卷叶螟作为对照，用实时荧光定量ＰＣＲ方法分株测定取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内　ＣｍＴｒｅｌ基因的ｍＲＮＡ表达水平，并检测其体内海藻糖酶活性变化。结果显示，相较于对照组，取食转基因水稻稻　纵卷叶螟体内ＣｍＴｒｅｌ基因表达量下降了４４．７９％，海藻糖酶活力平均下降了１４．９４％。研究结果表明转基因水稻　的ＲＮＡ干扰效应相当明显，能对取食其叶片的稻纵卷叶螟ＣｍＴｒｅｌ基因起到明显的沉默作用。　关键词：ＲＮＡ干扰；稻纵卷叶螟；海藻糖酶基因；表达载体构建　中图分类号：Ｑ７８４　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８—０４５７（２０１５）０３—００４８—０７　国际ＤＯＩ编码：１０．１５９５８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｓｄｎｙｓｗｘｂ．２０１５．０３．００９　

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡｉ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ＣｕｔＴｒｅ１　ｇｅｎｅ　ＴＩＡＮ　Ｙｕ，ＤＵ　Ｊｕａｎ，ＬＩ　Ｓｈａｎｇ—ｗｅｉ　（Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｅｓｔ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆＭｏｕｎ—　ｔａｉｎｏｕｓ　Ｒｅｇｉｏｎ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　５５００２５，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ｒｅ￣ｒｓ　ｔｏ　ａ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ　ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ＲＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｔｙｐｉｃａｌｌｙ　ｂｙ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｍＲＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＲＮＡｉ　ｉｓ　ａ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｄｏｕｂｌｅ——ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　ｉｓ　ａ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｏ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｔｒｅｈａｌａｓｅ　ｇｅｎｅ（ＣｍＴｒｅ１）ｆｒｏｍ　Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒ－　ｏｃｉｓ　ｍｅｄｉｎａｌｉｓ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ＢａｍＨ　Ｉ　ａｎｄ　Ｓｐｅ　Ｉ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃｕｔｔｉｎｇ　ｓｉｔｅｓ　ａｔ　ｂｏｔｈ　ｓｉｄｅｓ，ａｎｄ　ｗａｓ　ｎａｍｅｄ　ＣｍＴｒｅｌ　．Ａｆｔｅｒ　ｄｏｕｂｌｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｔｈｉｓ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐ１３０１　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐ１３０１一ＣｍＴｒｅｌ　．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＰＣＲ，ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｉｓ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐ１３０１一　ＣｍＴｒｅ１　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ．　Ｔｈｅ　ｃａｌｌｉ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　Ｚｈｏｎｇｈｕａ　１　１　ｗｅｒｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　ｔｈａｔ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ｐ１３０１一ＣｍＴｒｅｌ　．　Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃａｌｌｉ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｂｙ　ｈｉｇｒｏｍｙｅｉｎ．Ａｆｔｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｃａｌｌｉ　ａｎｄ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａ—　ｔｉｏｎ，２６　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．ＣｍＴｒｅｌ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　Ｃ．ｍｅｄｉｎａｌｉｓ　ｔｈａｔ　ｆｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅｓｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ（ＲＴ—ｑＰＣＲ）ａｎｄ　ｔｒｅｈａｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉ—　ｔｉｅｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｔｒｅｈａｌａｓｅ　Ｋｉｔ，ｕｓｉｎｇ　Ｃ．ｍｅｄｉｎａｌｉｓ　ｔｈａｔ　ｆｅｄ　ｏｎ　ｎｏｎ—ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ　ｒｉｃｅ　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ．　

收稿日期：２０１５—０３—１９；修回日期：２０１５—０６—２３　基金项目：国家自然科学基金项目（３１３６０４４３）；贵州大学研究生创新基金（研农２０１４００９）。　通讯作者：Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｗｌｉｉ＠１６３．ｃｏｉｎ。　第３期　田宇，等：重组ＲＮＡ干扰表达载体的构建与鉴定　４９　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＣｍＴｒｅｌ　ｉｎ　Ｃ．ｍｅｄｉｎａｌｉｓ　ｆｅｅｄｉｎｇ　ｏｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｄｅ－　ｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　４４．７９％ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｔｒｅｈａｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｆｅｌｌ　ｂｙ　１４．９４％，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ　ｆｉｎｄｉｎｇｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＣｍＴｒｅｌ　ｃｏｕｌｄ　ｓｔｒｏｎｇｌｙ　ｓｉｌｅｎｃｅ　ＣｍＴｒｅｌ　ｉｎ　Ｃ．ｍｅｄｉｎａｌｉｓ　ｔｈａｔ　ｆｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅｓｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ　ｍｅｄｉｎａｌｉｓ；ｔｒｅｈａｌａｓｅ　ｇｅｎｅ；ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　

稻纵卷叶螟（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ　ｍｅｄｉｎａｌｉｓ），俗称卷　叶虫，属于鳞翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）螟蛾科（Ｐｙｒａｌｉ－　ｄａｅ），是对水稻危害最为严重的主要害虫之一。几　丁质（ｃｈｉｔｉｎ）是自然界中储量仅次于纤维素的第二　大天然多糖，广泛存在于甲壳类动物、昆虫及真菌　中，但不存在于脊椎动物与植物中¨Ｊ。几丁质是昆　虫表皮的主要成分，也是中肠围食膜的重要成分，　其合成与降解对昆虫的生长发育至关重要。昆虫　几丁质的生物合成由一系列生化反应所组成，一般　认为海藻糖经８步反应合成几丁质　Ｉ３　Ｊ，其中有８　个酶参与反应，而几丁质合成通路中的第一个酶海　藻糖酶（ｔｒｅｈａｌａｓｅ）是其中的关键酶。Ｃｈｅｎ等　对　甜菜夜蛾（Ｓｐｏ＆ｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇ“０）的海藻糖酶基因　（Ｔｒｅ）研究表明，沉默Ｔｒｅ后，昆虫存活率明显降　低，并对几丁质合成通路下游的基因表达都有下调　作用，因此海藻糖酶可作为害虫控制的一个理想　靶标。　ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｉ＇ｅｎｅｅ，ＲＮＡｉ）的本质是　转录后的基因沉默（ＰＴＧＳ），发生沉默的基因的转　录仍正常进行，但转录的ｍＲＮＡ在细胞质里发生　了序列特异性降解，从而导致靶基因不能正常表达　为蛋白质。双链ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ，　ｄｓＲＮＡ）在细胞质内能被Ｄｉｃｅｒ核酸内切酶切割，形　成大小约２１—２５　ｎｔ的小分子干扰ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎ—　ｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）。其中一部分ｓｉＲＮＡ与　ＲＮＡ诱导的ＲＩＳＣ沉默复合物结合，在ＡＴＰ水解供　能的情况下，搜寻与ｓｉＲＮＡ序列互补的靶ｍＲＮＡ　进行切割，使ｍＲＮＡ降解，最终降低靶标基因的　ｍＲＮＡ表达水平；另一部分ｓｉＲＮＡ以ｍＲＮＡ为模　板，在其反义链的引导与依赖ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶　ＲｄＲＰ的作用下合成更多新的ｄｓＲＮＡ，再由Ｄｉｃｅｒ　核酸内切酶切割产生大量次级ｓｉＲＮＡ，从而使　ＲＮＡｉ作用进一步放大，最终将靶ｍＲＮＡ完全降　解，使靶基因得到有效沉默　，ｏ　Ｊ。本研究以稻纵卷　叶螟可溶型海藻糖酶基因（ＣｍＴｒｅ１）为靶标【　，设　计靶位点并将其命名为ＣｍＴｒｅｌ　，经双酶切后与　ｐ１３０１植物表达载体连接，构建ＲＮＡｉ重组表达载　体ｐ１３０１一ＣｍＴｒｅｌ　。通过ＰＣＲ、双酶切和测序鉴　定证明重组表达载体ｐ１３０１一ＣｍＴｒｅｌ　成功构建，　将其转入农杆菌ＬＢＡ４４０４，制备基因工程菌。通过　农杆菌介导法，将目的基因片段ＣｍＴｒｅｌ　转入粳稻　中花１１号中，经愈伤诱导、转化、筛选、植株再生等　最终获得了阳性转基因植株，并对其ＲＮＡ干扰效　应进行了鉴定，为稻纵卷叶螟的生物防治奠定　基础。　

１材料与方法　１．１材料　１．１．１质粒、菌株ｐ１３０１植物表达载体，大肠杆菌　ＤＨ５ａ，根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，中花１１号水稻种子　均由贵州大学昆虫研究所贵州山地农业病虫害重　点实验室提供；目的基因片段ＣｍＴｒｅｌ　由金斯瑞生　物科技（南京）有限公司合成并装载在ｐＵＣ５７质　粒上。　１．１．２酶、试剂盒及引物　限制性内切酶ＢａｍＨ　Ｉ、Ｓｐｅ　Ｉ购自上海生工生物工程有限公司，Ｔ４　ＤＮＡ　连接酶购于大连宝生物工程有限公司，高纯度质粒　小提试剂盒Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ购自康为世纪生　物科技有限公司，琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒和　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ等均购自天根生化科技（北京）有限公　司，海藻糖酶（Ｔｒｅｈａｌａｓｅ，ＴＨＬ）试剂盒购自苏州科　铭生物技术有限公司，ｉＴａｑ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ、　ｑＰＣＲ耗材均购自ＢＩＯ—ＲＡＤ公司，引物合成及基　因测序由上海生工生物工程有限公司完成。　１．２方法　１．２．１靶位点设计与合成根据ＣｍＴｒｅｌ基因的　全长ｃＤＮＡ序列，利用在线工具ｓｉＤｉｒｅｃｔ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０　设计４００　ｂｐ　ＲＮＡｉ靶位点序列，将靶位点序列和其　反向互补序列分别插入到水稻磷脂酶Ｄ基因　（ＰＬＤ）内含子的两侧，命名为ＣｍＴｒｅｌ　。在　ＣｍＴｒｅｌ　的５端和３端分别添加ＢａｍＨ　Ｉ和Ｂｅ　Ｉ酶　切位点，送金斯瑞生物科技（南京）有限公司合成　并克隆到ｐＵＣ５７载体上，得到ｐＵＣ５７一ＣｍＴｒｅｌ　重　组载体。　１．２．２摇茵与提取质粒参照第三版《分子克隆　实验指南》。。　配制ＬＢ液体培养基，将１０　的