肿瘤干细胞的鉴定与分离

肺癌细胞株A549的常见肿瘤干细胞抗原分析和细胞分选比较彭卓;党晓燕;张秋红;张瑞;杨拴盈【摘要】背景:多项研究表明癌症有可能是起源于肿瘤组织内一个细胞亚群即肿瘤干细胞,近期的研究发现肺癌内也存在肿瘤干细胞,但肺癌内存在的肿瘤干细胞的表型目前仍未取得一致.目的:对人类非小细胞肺癌细胞株A549通过目前最常见的肿瘤干细胞表面抗原进行全面系统分析.方法:A549肺癌细胞株在常规高糖培养环境下,培养1周后进行表面抗原的检测.使用流式细胞术分析A549细胞CD133,CD44,CD24以及ABC运转蛋白家族G2的表达情况,并且通过流式分选的方法分离出CD44+/CD24+和CD44+/CD24-两类亚群细胞,在低黏附、无血清并添加生长因子的环境下观察肿瘤干细胞肿瘤球形成的能力.结果与结论:①细胞表型变化:A549细胞中度表达肿瘤干细胞常见的抗原CD44(64.23％)和CD24(58.62％),而CD133和ABC运转蛋白家族G2的表达率很低,均约为0.9％,其中CD133/CD44双阳性的细胞数比例极低.表型为CD44+/CD24+和CD44+/CD24-的细胞群比例分别为54.64％和23.38％.两类亚群细胞在碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子存在的条件下,无血清培养均可形成肿瘤干细胞肿瘤球;②肿瘤球形成效率:CD44+/CD24+和CD44+/CD24-的细胞群其肿瘤干细胞肿瘤球形成效率与A549细胞相比差异无显著性意义;③结果说明:CD44和CD24也许并非肺癌肿瘤干细胞的特异性标志,对于肺癌内肿瘤干细胞的表型鉴别还需要更多的研究.%BACKGROUND: It has been widely reported that the most types of cancer are probably originated from cancer stem cells (CSCs) which are subpopulations of tumor cells. Recent studies also suggested that lung cancer could arise from CSCs. However, the phenotypiccharacteristics of CSCs in lung cancer have not been precisely described.OBJECTIVE: To systematically analyze the expression of the most common CSC markers in cell line A549.METHODS: A549 cells were cultured for 1 week under the condition of conventional high glucose. After that, flow cytometry was used to assess the expression of putative stem cell markers, including CD133, CD24, CD44 and ABCG2.Cells were then sorted according to the expression of CD44 and CD24 markers by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and characterized using their sphere-forming capacity in serum free medium supplemented with several growth factors.RESULTS AND CONCLUSION: A549 cells expressed the CSC markers CD44 and CD24 at 64.23％ and 58.62％,whereas the expression of both ABCG2 and CD133 was around 0.9％. Double-positive CD44/133 populations were rare.CD44+/CD24+ and CD44+/CD24- subpopulations respectively exhibited 54.64％ and 23.38％ expression. CD44+/CD24+ and CD44+/CD24- subsets were sorted by FACS. Both isolated subpopulations formed spheres in the serum free medium supplemented with basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor. However, there was no significant difference in the sphere formation efficiency amongCD44+/CD24+ and CD44+/CD24- subsets as well as A549 cells. Our findings suggest that CD44 and CD24 cannot be considered as potential markers for isolating lung CSCs in cell line A549, and further investigation using in vivo assays is required.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2017(021)025【总页数】6页(P3989-3994)【关键词】干细胞;肿瘤干细胞;肺癌;细胞株A549;CD133;CD44;CD24;ABCG2;肿瘤球;碱性成纤维细胞生长因子;表皮生长因子;国家自然科学基金【作者】彭卓;党晓燕;张秋红;张瑞;杨拴盈【作者单位】西安交通大学第二附属医院急诊科,陕西省西安市 710004;西安交通大学第二附属医院急诊科,陕西省西安市 710004;西安交通大学第二附属医院呼吸内科,陕西省西安市 710004;西安交通大学第二附属医院急诊科,陕西省西安市710004;西安交通大学第二附属医院呼吸内科,陕西省西安市 710004【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction非小细胞肺癌为目前世界上癌症致死的主要原因之一，其高患病率和高死亡率迫切需要找到更为有效的干预方法，因此对于肺癌肿瘤进展的发病机制还需要进行更深入的研究[1-2]。

细胞分离的名词解释细胞分离是一种实验室技术，用于将细胞从混合的细胞群落中分离出来，以便研究和分析特定类型的细胞。

这个过程是生物学、医学和生物工程领域中非常重要的一环，它使科研人员能够更好地理解和探索细胞的结构、功能和相互作用。

本文将对细胞分离的原理、方法、应用以及未来发展进行详细探讨。

一、细胞分离的原理细胞分离的原理基于不同细胞类型的特异性属性，例如细胞大小、形状、表面标记物、细胞壁特性以及生物化学特征的差异等。

这些特异性属性可以用于将目标细胞以某种方式与其他细胞区分开来。

二、细胞分离的方法1. 离心法（Centrifugation）离心法是最常见且最简单的细胞分离方法之一。

在离心过程中，细胞根据它们的浮力或密度差异通过旋转分离。

这种方法在细胞培养、血液学和分子生物学实验中广泛应用。

2. 流式细胞术（Flow Cytometry）流式细胞术通过细胞在悬浮液中注射或吸入时，根据细胞的大小、形状、表面标记物等特征，利用光散射和荧光信号来分辨不同细胞群。

这项技术可以快速、高效地分离出特定细胞类型。

3. 纯化培养法（Culture and Purification）纯化培养法是一种将细胞在培养基中进行分离和纯化的方法。

这种分离方法基于不同细胞类型对培养基成分、因子或化合物的特异性需求，从而使目标细胞在特定条件下生长并发育。

4. 磁性分离法（Magnetic Separation）磁性分离法利用特殊涂层的磁性颗粒与细胞表面标记物的亲和力，将目标细胞与其他细胞分离开来。

这项技术通过在磁场中对细胞进行处理，实现了高效、快速的分离。

三、细胞分离的应用1. 癌症研究细胞分离技术在癌症研究中发挥着重要作用。

通过将肿瘤细胞从正常细胞中分离出来，可以更好地理解癌细胞的生物学特性和致病机制，为肿瘤预防和治疗提供新的思路和方法。

2. 干细胞研究干细胞分离对于干细胞研究来说是至关重要的。

通过将干细胞与其他细胞类型分离开来，科研人员可以更好地理解干细胞的生长和分化规律，并开发出更好的干细胞治疗方法。

干细胞外泌体的分离与应用指南引言干细胞外泌体近年来引起了广泛的关注，并被认为是一种具有潜在临床应用价值的细胞外囊泡。

本文将介绍干细胞外泌体的分离方法以及其在生物医学领域中的应用指南，为相关研究提供参考。

一、干细胞外泌体的分离方法1. 超速离心法超速离心法是目前最常用的干细胞外泌体分离方法之一。

该方法主要包括以下步骤：首先，将干细胞培养基收集，并经过一系列离心步骤去除细胞碎片和大颗粒物质。

然后，通过使用不同离心速度和时间的离心管进行干细胞外泌体的分离。

最后，通过过滤和洗涤等步骤来净化外泌体。

2. 超滤法超滤法使用特定孔径的超滤膜来分离干细胞外泌体。

首先，将干细胞培养基经过低速离心去除细胞碎片，然后将上清液通过超滤膜的孔径进行过滤。

根据需要，可以使用不同的孔径大小的超滤膜来筛选不同大小的外泌体。

3. 大度纯化法大度纯化法是一种通过使用特定亲和性结合试剂来富集干细胞外泌体的方法。

根据干细胞外泌体上表达的特定膜标志物或受体，在干细胞培养基中加入与其结合的亲和性结合试剂。

通过一系列洗涤和离心步骤，可以将特定膜标志物或受体相关的外泌体富集到样品中。

二、干细胞外泌体的应用指南1. 作为疾病标志物的诊断应用干细胞外泌体中富含的蛋白质、核酸和微RNA等生物标记物，可以作为疾病的潜在标志物。

通过分析干细胞外泌体的组分和数量，可以为多种疾病的早期诊断提供参考，如肿瘤、心血管疾病和神经系统疾病等。

2. 治疗性应用的潜在价值干细胞外泌体具有促进组织修复和再生的潜在能力。

其中包含的生物活性分子，如细胞因子、生长因子和转录因子等，可以促进受损组织的修复和再生。

因此，干细胞外泌体可用于治疗各种疾病，如创伤、心肌梗死和神经退行性疾病等。

此外，干细胞外泌体具有较低的免疫原性和良好的稳定性，使其成为替代整个细胞治疗的一种可行选择。

3. 药物递送系统的应用干细胞外泌体作为一种天然的纳米颗粒，其小尺寸和稳定性使其成为一种理想的药物递送系统。

肿瘤干细胞标志物ALDH1的研究进展摘要：1978年美国召开的人类免疫与肿瘤免疫诊断会上首次提出了肿瘤标志物概念，之后随着研究深入，其在临床、辅助诊断、疗效评价等方面均发挥了重要的作用。

乙醛脱氢酶1（ALDH1）作为催化细胞中将乙醛氧化为乙酸的主要细胞溶脂酶，逐渐成为正常与肿瘤干细胞（CSC）主要标志物。

为了进一步探讨肿瘤肝细胞标志物ALDH1的研究进展，本文进行了综述。

关键词：肿瘤肝细胞；标志物；乙醛脱氢酶1；研究进展随着肿瘤标志物概念提出，以及对其研究逐渐深入，近几年大部分学者已经将乙醛脱氢酶1（ALDH1）作为最为主要的肿瘤干细胞标志物进行研究[1]。

ALDH1属于乙醛脱氢酶家族成员之一，主要作用在于催化细胞中的乙醛氧化为乙酸，是一类细胞溶脂酶，可参与各类组织的分化及基因表达，作用十分广泛。

本文就其在肿瘤干细胞标志物中的研究进展进行如下综述。

1 ALDH1概述人体ALDH1的基因表达场所为细胞质，其中基因克隆与定位主要发生在9q21染色体，构成碱基对有53×103个，基因启动区则含有ATA盒与CCAAT盒各一个，前者位于转录起始部位上游32bp处，而后者位于74bp处[2]。

经ProtParam进行分析可知，其蛋白质分子质量大约为54.86kDa，推测总原子数目达到7700多个，而半衰期可达到30小时。

此外，其不稳定系数不足30，可见其蛋白质有一定稳定性，而疏水性平均值约为-0.16，可见其蛋白质亲水性很强。

2 ALDH1作为肿瘤干细胞标志物的研究情况CSC的鉴定比较复杂，一般需经过实验证明，证明该群细胞有自我更新与多向分化潜能，而且是一类强致癌性细胞[3]。

随着研究深入，ALDH1被认定为乳腺癌、肺癌、胰腺癌等CSC通用标记物，成为研究热点，尤其是在乳腺癌干细胞标志物研究中最为突出，现总结如下。

2.1 乳腺癌干细胞标志物中ALDH1应用情况乳腺癌作为临床主要肿瘤疾病，研究十分广泛，从近几年实验报告中可知，ALDH1的高表达对乳腺癌发生、进展、转移及预后等均有极大影响。

干细胞、癌症和肿瘤干细胞干细胞生物学已经成熟。

证明造血系统中存在干细胞的研究已让位于对一些组织特异性干细胞和祖细胞的分离与研究、对它们的特征和基因表达程序的阐述，以及在再生医学中对它们应用的研究。

也许干细胞最重要和最有用的特征是它的自我更新能力。

通过这一特征能够发现干细胞和癌细胞之间有惊人的相似：肿瘤可能通常起源于正常干细胞的转化，相似的信号通路可能既调节干细胞也调节癌细胞的自我更新，且癌细胞中可能包含有“肿瘤干细胞”（cancer stem cells）----它们是一些极少的具有自我更新不定潜能的驱使肿瘤形成的细胞。

干细胞被定义为永存的细胞，能通过自我更新和在特异组织中分化产生成熟细胞。

在多数组织中特异性干细胞是极少的。

为了研究干细胞的特征，干细胞需经过仔细纯化和预期的鉴定。

尽管有理由认为每种组织来自于一种组织特异性干细胞，但对这些干细胞的严格的鉴定和分离仅在极少的组织中成功的完成。

例如已自小鼠和人体中分离出造血干细胞（HSCs），并已显示它们负责血细胞和免疫系统的形成（图1）。

来自于多种器官的干细胞可能被用于未来的治疗，而 HSCs -----是骨髓移植中重要的成分，已广泛地用于临床治疗图1 造血干细胞的发育最近的研究发现骨髓和造血干细胞（HSCs）可产生非造血组织，提示这些细胞可能具有较以前设想的更为广泛的分化潜能。

这一过程尚需进一步用实验来证实。

骨髓细胞是否可产生不同的非造血组织，这些非造血组织是否真是来自于HSCs或来自于其它细胞。

如果进一步的研究支持造血干细胞具有可塑性，这无疑将开创对HSCs的发展潜能的了解，并进一步为临床治疗开辟新的途径。

作为HSCs的特征，在较早的综述中已涵盖了关于它们的分化潜能和临床的应用，在此我们只讨论干细胞生物学中出现的能够提供对肿瘤生物学新认识的证据。

我们将特别聚焦于干细胞与癌细胞相关的三个方面进行讨论。

第一，干细胞与癌细胞在自我更新时有相似的调节机制；第二，瘤细胞有可能来源于正常干细胞的可能性；第三，肿瘤中可能含有“肿瘤干细胞”的观念。

循环肿瘤细胞的检测方法一、C TCs 的体外检测方法CTCs 的富集方法是基于物理或生物特性的。

前者取决于肿瘤细胞的尺寸、电性能等其他物理特性，而后者主要依赖于抗原抗体结合。

近年来，联合物理和生物特性检测的新型微流控芯片技术具有自动化、微型化、高通量、可集成下游分析等优点，在CTCs 检测分析中显示了巨大优势。

1. 基于物理特性的富集方法研究表明，CTCs 比造血细胞更大、更硬。

基于这些物理特性的差异，已经开发了许多技术来提高CTCs 富集率，其中膜过滤分离肿瘤细胞技术（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET）系统是最早基于尺寸过滤的CTCs 分离的技术之一。

在该系统中，血液被稀释，然后用8 μm 孔径过滤器过滤。

CTCs 由于体积较大而被过滤器保留，红细胞和白细胞由于体积小于孔径而可以通过随机分布的孔。

但由于CTCs 和白细胞的大小重叠，依赖大小的过滤系统捕获目标细胞的效率有限。

因此，Sun 等提出了一种增加细胞大小的策略，即在细胞过滤前利用修饰过的微珠来特异性结合CTCs，以提高捕获效率。

使用该微流体捕捉系统以1 ml/min 的流速可以从全血样本中分离出高达91%的靶细胞。

与ISET 系统类似，Screen Cell 系统通过使用微孔膜过滤器，通过筛孔大小分离CTCs。

该系统基于微过滤技术的过滤膜，可以使有核细胞通过，而CTCs 被拦截。

Screen Cell 系统具有高通量持续处理大量血液的潜力，并且具有相关的细胞和分子生物学技术，以及与CTCs 及其潜在基因异常的图形和鉴定相关的技术，可以方便地分析提取到过滤器上的肿瘤细胞。

此外，从血液中分离出来的细胞能最大程度地保存其活性和完整性，为CTCs 的体外培养奠定了基础。

流体辅助分离技术（fluid-assisted separation technique，FAST）是一种新型的离心微流控系统。

胰腺癌CSC的分离鉴定目的：采用流式细胞术SP细胞分选法分离并鉴定胰腺癌SP细胞符合胰腺癌干细胞特性。

方法：1）选用人胰腺癌细胞系BxPC-3、PANC-1、SW1990，采用流式细胞术SP分选法分离出SP细胞；2）采用平板克隆实验、细胞分化实验、裸鼠成瘤实验研究SP细胞亚群的基本生物学特性。

结果：1）人胰腺癌细胞系BxPC-3、PANC-1、SW1990均含有SP细胞亚群，比例（%）分别是0.58±0.02，8.74±0.33，3.92±0.16；2）胰腺癌细胞SP细胞亚群和non-SP细胞亚群克隆形成能力、增殖分化能力有差异（P＜0.05），SP细胞具有更强的克隆形成能力和增殖分化能力；SP细胞的裸鼠成瘤能力至少是非non-SP的100倍。

结论：胰腺癌SP细胞具有胰腺癌干细胞特性，流式细胞术SP分选法是分离胰腺癌干细胞的可靠方法。

标签：胰腺癌；CSC；SP细胞胰腺癌预后差，5年生存率不足5%，中位生存期仅6个月[1]，肿瘤干细胞（Cancer stem cells，CSC）学说认为恶性肿瘤中存在极少数具有成体干细胞特征的细胞亚群[2]，是恶性肿瘤恶性生物学行为的根源[3]。

本研究引入流式细胞术SP细胞分选法分离人胰腺癌细胞系SP细胞，初步探索胰腺癌SP细胞具有胰腺癌干细胞特性。

1材料与方法1.1细胞培养与观察人胰腺癌细胞系购自上海中科院细胞库，采用体外细胞培养对人胰腺癌细胞系BxPC-3、PANC-1、SW1990进行传代与培养，培养条件严格按照ATCC推荐条件执行。

1.2CSC的分离与鉴定采用流式细胞术SP分选法，分离并鉴定SP细胞亚群具有CSC特性。

2结果2.1人胰腺癌细胞系流式细胞术SP分选图1胰腺癌细胞SP细胞分选结果A.流式细胞术SP选法分析人胰腺癌细胞系BxPC-3中SP细胞占0.58%±0.02%；B.BxPC-3细胞经维拉帕米处理后SP细胞下降至0.05%±0.00%；C.PANC-1中SP细胞占8.74%±0.33%；D.PANC-1细胞经维拉帕米处理后SP细胞下降至0.91%±0.08%。

乳腺癌干细胞的培养及鉴定郑文博;潘凌霄;唐炜;高进;叶熹罡【摘要】Objective To isolate breast cancer stem cells from breast cancer patients and identify their biological characteristics. Methods Mammospheric cells were purified and enriched from the tumor tissues of breast cancer patients using mammosphere culture. Their expressions of CD44 and CD24 were analyzed by flow cytometry, and ALDH1, ESA and Oct4 expressions were determined by Western Blotting. The primary mammospheric and adherent cells, at the density of 2×104, 2×105 or2×106, were inoculated into NOD/SCID mice to observe their tumorigenic and metastatic activities. Results With mammosphere culture method, 62.36% of the mammospheric cells showed CD447 CD24-now phenotype. The expressions of ALDH1, ESA and Oct4 in the mammospheric cells were significantly higher than those in the adherent culture-derived breast cancer cells (P<0.05). Primary mammospheric cells were at least 100-fold more tumorigenic than the adherent cells; the mammospheric cells were associated with liver or lung metastases, but the adherent cells were not. Conclusions Mammosphere culture can be employed to obtain breast cancer stem cells from the tumor tissues of breast cancer patients.%目的从乳腺癌患者的肿瘤组织中获得乳腺癌干细胞,并确定其生物学特性.方法收集乳腺癌患者的肿瘤组织,利用乳腺球悬浮培养法获得乳腺球细胞.用流式细胞仪检测细胞CD44以及CD24的表达,用Western印迹法检测细胞ALDH1,ESA以及Oct4的表达.将2×104、2×105和2×106三种细胞数的原代乳腺球囊细胞及贴壁细胞分别接种到NOD/SCID鼠的脂肪垫,观察其成瘤能力和肝肺转移情况.结果利用乳腺球悬浮培养的原代乳腺癌细胞中有62.36％呈CD44+/CD24-/low表型,且肿瘤干细胞标记物ALDH1,ESA以及Oct4的表达高于贴壁培养的原代乳腺癌细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).与贴壁细胞相比,悬浮培养富集的原代球囊细胞均有更强的成瘤和肝肺转移能力.结论利用乳腺球悬浮培养法可以从人乳腺癌组织中获得乳腺癌干细胞.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2011(031)012【总页数】5页(P2021-2025)【关键词】乳腺癌;肿瘤干细胞;乳腺球悬浮培养【作者】郑文博;潘凌霄;唐炜;高进;叶熹罡【作者单位】广州医学院第一附属医院乳腺外科,广东广州510120;广州医学院第一附属医院乳腺外科,广东广州510120;广州医学院第一附属医院乳腺外科,广东广州510120;广州医学院第一附属医院乳腺外科,广东广州510120;广州医学院第一附属医院乳腺外科,广东广州510120【正文语种】中文【中图分类】R655.8;R737.9近年来研究发现［1］，肿瘤是一种干细胞疾病，是由具有成瘤能力的肿瘤干细胞增殖发育而成的异常组织，肿瘤干细胞在肿瘤的形成和生长过程中起了重要作用。

血清剥夺法分离U87细胞系中的胶质瘤干细胞刘于海;牛朝诗;李冬雪【摘要】背景:细胞周期分析已证实,90%以上的干细胞处于G0静止状态,因此采用不含任何生长因子和其他相关营养添加剂的血清剥夺培养基更适合筛选分离肿瘤干细胞.目的:应用血清剥夺法培养胶质瘤U87细胞,并筛选鉴定该细胞系中的胶质瘤干细胞.方法:将U87细胞培养在只含有DMEM和L-谷氨酰胺的培养基中培养6 d,筛选出胶质瘤干细胞,接着更换为神经干细胞培养基,观察细胞肿瘤球的形成过程;将肿瘤球接种于血清培养基,观察其在体外的分化特点;免疫荧光鉴定血清剥夺后尚存的细胞、增殖形成的肿瘤球细胞和分化细胞.结果与结论:应用血清剥夺的方法成功地筛选出了表达CD133的肿瘤干细胞,并能增殖形成肿瘤球;肿瘤球可多向分化,子代细胞表达胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶.说明U87细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的胶质瘤干细胞.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2010(014)001【总页数】5页(P6-10)【关键词】胶质瘤;血清剥夺;U87细胞系;癌干细胞;细胞鉴定【作者】刘于海;牛朝诗;李冬雪【作者单位】安徽医科大学附属省立医院神经外科,安徽省立体定向神经外科研究所,安徽省合肥市,230001;安徽医科大学附属省立医院神经外科,安徽省立体定向神经外科研究所,安徽省合肥市,230001;安徽医科大学附属省立医院神经外科,安徽省立体定向神经外科研究所,安徽省合肥市,230001【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言人类胶质母细胞瘤U87细胞系在研究中应用广泛。

然而，该胶质瘤细胞系中是否存在胶质瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)仍然存在争议。

Kang等[1]在U87细胞系中并没有发现胶质瘤干细胞，但是Hirschmann-Jax等[2]发现在U87细胞系中有0.05%～2.00%的亚群细胞拥有胶质瘤干细胞特性。

骨髓间质干细胞体内突变致瘤及其肿瘤干细胞分离与生物学特性研究的开题报告摘要：骨髓间质干细胞 (BM-MSCs) 是一种多能的成体干细胞，能够分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。

然而，越来越多的研究表明，BM-MSCs 也可以通过体内突变致瘤。

本文将针对 BM-MSCs 的体内突变致瘤现象以及相关的肿瘤干细胞分离和生物学特性进行研究。

我们将使用流式细胞仪和肿瘤干细胞特异性标记物 (CD24 和 CD44)来分离 BM-MSCs 中的肿瘤干细胞。

同时，我们将采用体外培养和肿瘤形成试验来评估这些肿瘤干细胞的生物学特性。

这项研究有助于更好地理解 BM-MSCs 的潜在致瘤风险，并对肿瘤治疗中的干细胞治疗提供新的思路和方法。

关键词：骨髓间质干细胞；体内突变致瘤；肿瘤干细胞；生物学特性；干细胞治疗Abstract：Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) are a multipotent adult stem cells that can differentiate into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. However, increasing evidence suggests that BM-MSCs can also undergo somatic mutations and give rise to tumors in vivo.This report aims to study the phenomenon of in vivo mutation-induced tumorigenesis in BM-MSCs and the related isolation and biological characteristics of tumor stem cells. We will use flow cytometry and tumor stem cell-specific markers (CD24 and CD44) to isolate the tumor stem cells in BM-MSCs. Meanwhile, we will evaluate the biological characteristics of these tumor stem cells using in vitro culture and tumor formation assays.This research will help to better understand the potential tumorigenic risks of BM-MSCs and provide new ideas and methods for stem cell therapy in cancer treatment.Keywords: bone marrow mesenchymal stem cells; in vivo mutation-induced tumorigenesis; tumor stem cells; biological characteristics; stem cell therapy.。