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大鼠视网膜急性损伤后谷氨酰胺合成酶活性的变化

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．．潍坊医学院学报2008年第30卷第5期◆

大鼠视网膜急性损伤后谷氨酰胺合成酶活性的变化

徐学农。，张军富，李国锋，钟文，贾玉

燕

，郭春

红

(潍坊医学院附属潍坊市人民医院眼科，山东潍坊261041)

45

5

ChangeofGiutamineSynthetaseActivityinRatRetinaFollowingAcuteI

nj

ury

XUXue—nong，ZHANGJun—fu，LiGuo—feng，ZHONGWen，JIAYu—yan，GUOChun—hong

(DepartmentofOphtalmology，We扣ngPeople~HospitalAflZiatedtoWeifangM

edicalCollege，

耽扣ng261041，Ch

i

na

)

[ABSTRACT]ObjectiveToobservethechangeofglutaminesynthetaseactivityinratretinafollowingacuteinjury．MethodsA

—

cuteinjuryinratretinawasinducedbyincreasinganteriorchamberpressureto110mmHgfor60raininthelefteyesof30Wistarrats．Gluta—

minesynthetaseactivity，besidesthecontrolgroup，wasdetectedat4，12，24，36and72hoursafterremovalofpinhead．ResultsIneompari

sonwithcontrolgroup，GSactivitydecreasedby39％after4hours(P<0．01)，by25％after12hours(P<0．01)，increasedby19．9％after36hours(P<0．01)andreve~edtocontrolgrouplevelafter72hours(P>0．05)．ConcluswnGlutaminesynthetaseactivityinratretina

followingacuteinjurydecreasesatthebeginningandincreasesafterwar

d

s．

[KEYWORDS

]

Acutei

njury；Retina；Glutathionesynthetase

谷氨酸的兴奋性毒性作用可致脑及视网膜损伤，谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，GS)是谷氨酸一谷氨酰胺循环中的关键酶，可降低细胞外谷氨酸浓度，对视神经保护有着重要作用。目前多种疾病，如糖尿病性视网膜病变、癫痫、缺血性视神经疾病中均有谷氨酰胺合成酶表达或是活性下降的报道。临床上急性闭角型青光眼急性眼压升高后，对视网膜造成损伤，其后谷氨酰胺合成酶活性如何变化，未见文献报道。本文以大鼠视网膜急性损伤模型，观察了GS酶活性变化，为下一步药物干预实验打下基础。1材料和方法1．1实验动物分组及制作大鼠模型健康纯种Wistar大鼠30只，无眼疾，眼压正常，雌雄兼用，体重200～250g(潍坊医学院动物实验中心提供)。随机分为6组，每组5只，分别为对照组及4h，12h，24h，36h，72h组。以左眼为实验眼。以前房灌注加压做成视网膜急性损伤模型：10％水合氯醛0．8ml腹腔注射麻醉后，将连接生理盐水瓶输液管的5号头皮针刺人大鼠左眼前房，升高输液瓶至与动物垂直距离150cm，持续60min。于出针后4h，12h，24h，36h，72h时间点处死大鼠。GS试剂盒，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。1．2取材各时间点以过量水合氯醛麻醉大鼠，迅

速摘出眼

球，放于冰上，剪除角膜，去掉晶体玻璃体，以显微镊子仔细剥离取出视网膜放于10倍重量的冷匀浆液中，匀浆机匀浆

(800

r／

rain)上下10个来回。低温离心机3000r／min，10min，取上清液，

每一组织分成2管

。

1．3蛋白定量的测定采用考马斯亮兰蛋白测定法。其

原理

为蛋白分子具有一NH，基团，当棕红色的CBBG250显色剂加入

蛋白时其上的阴离子与蛋白NH，结合变为蓝色通过测吸光度可计算出蛋白含量。步聚为：先按表1配制试剂

。

表1蛋白定量的测定试剂配制方法(W

m

l)

以上各管试剂混匀静置

10min，于595nm处，1cm光径，空

+[作者简介]徐学农(1962年～)，男(汉族)，山东省高密市人，副主任

NN，学士学位。主要研究方向

：玻璃体视网膜病

。４５６　白凋零，测定各管吸光度。并根据下列公式计算：蛋白含量（　Ｌ）：标准管蛋白浓度（　Ｌ）×测定管吸光度／标准管吸光度　１．４谷氨酰胺合成酶活性检测　原理为谷氨酰胺和羟胺在谷　氨酰胺合成酶的作用下生成Ｔ一谷氨酰氧肟酸和氨，通过显色　反应可测定谷氨酰氧肟的含量来反应谷氨酰胺合成酶的酶活　性。谷氨酰胺合成酶活性检测试剂盒由试剂１～７及标准品组　成。其操作步骤为：先按表２配制３管试剂。　表２谷氨酰胺合成酶活性检测试剂配制方法（Ｖ／ＩＡ）　将３管试剂混匀后３７。Ｃ水浴１５ｍｉｎ，３管中分￣ｔｌ，ｈＨ入试剂　７（显色剂）２００１￣１，混匀后３５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，０．５光径蒸馏　水调零，５５０ｎｍ下测定各管吸光度（ＯＤ值）。根据以下计算公　式得出谷氨酰胺合成酶（Ｇｓ）活性：Ｇｓ活性（Ｕ／ｍｇｐｒｏｔ）＝（测定　管ＯＤ值一空白管ＯＤ值）／（标准管ＯＤ值一空白管ＯＤ值）×　标准管浓度（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）ｘ４／蛋白含量（ｍｇｐｒｏｔ／ｍ１）。　１．５统计学分析采用ＳＰＳＳ　１１．０统计软件包对数据进行处　理，用单因素方差分析对６个水平的总体均数进行分析，各实　验组与对照组的比较采用Ｄｕｎｎｅｔｔ—ｔ检验。检验水准ｏＬ＝０．０５。　２结果　大鼠视网膜急性损伤后ＧＳ活性的变化结果显示：ＧＳ酶活　性对照组为７５．３２±４．６６，４ｈ组４５．９０±５．０８，１２ｈ组５６．５６±４．　７４，２４ｈ组７５．９１±５．０９，３６ｈ组９０．３３±５．８５，７２ｈ组７６．１２±４．　９５。统计处理表明２４ｈ，２ｈ组与对照组之间比较，Ｐ＞０．０５；４ｈ，　１２ｈ，３６ｈ组与对照组比较，Ｐ＜０．０１。　ＧＳ酶活性各时间点较对照组变化的百分率表明：出针后　４ｈ，Ｇｓ酶活性下降了３９％（Ｐ＜０．０１），１２ｈ开始回升，但仍呈下　降了２５％的水平（Ｐ＜０．０１），２４ｈ升至与对照组差异无统计学　意义（Ｐ＞０．０５）３６ｈ，较对照组升高近２０％（Ｐ＜０．０１），７２ｈ恢复　正常水平。　３讨论　谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统及视网膜内一种主要的　兴奋性神经递质，通过激活多种离子型和代谢型谷氨酸受体，　参与神经元信号传导。正常情况下视网膜细胞外谷氨酸的摄　ｑＡｅｔａ　Ａｃａｄ　Ｍｅｄ　Ｗｅｉｆａｎｇ　Ｉ‘，　．３０　Ｎｏ．５　２００８　取主要是由Ｍａｉｌｅｒ细胞来完成，这是因为Ｍａｉｌｅｒ细胞表达ＧＳ，　而Ｇｓ对Ｍｉｉｌｌｅｒ细胞转运谷氨酸起到极其重要的作用　’　。Ｇｓ　蛋白水平受基因转录水平的调节，ＧＳ蛋白水平及酶活性下降均　会造成细胞外液谷氨酸浓度的升高，大量的研究表明谷氨酸水　平过高是青光眼视神经损害的重要机制　。以前的研究发　现大鼠视网膜急性损伤后ＧＳｍＲＮＡ的表达呈现一个明显的升　高过程，并分析认为这可能伴随了Ｇｓ表达上调，增进了谷氨酸　转化为谷氨酰胺，从而减轻ＲＧＣｓ的损伤　。本实验进一步观　察大鼠视网膜急性损伤后ＧＳ酶活性的变化特点。　本研究表明，出针后４ｈ，ＧＳ活性下降了３９％（Ｐ＜０．０１），　１２ｈ下降了２５％（Ｐ＜０．０１），２４ｈ升至与对照组差异无统计学意　义（Ｐ＞０．０５），３６ｈ较对照组升高近２０％（Ｐ＜０．０１），７２ｈ恢复　正常水平。呈现了先下降、后升高的过程，表明开始阶段ＧＳ酶　活性受到明显抑制，随着ＧＳｍＲＮＡ的表达高峰出现　。及微环境　的改善，ＧＳ酶活性才逐渐升高。　Ｇｓ功能完成主要由Ｇｓ酶活性体现　。因此，无论增强　ＧＳｍＲＮＡ，ＧＳ的表达还是改善ＧＳ存在的微环境，最终应该能提　高ＧＳ酶活性才能增强谷氨酸的代谢达到保护视神经的目标。　尤其在视网膜急性损伤后早期保证ＧＳ酶活性不下降或相对升　高才是代谢大量释放的谷氨酸保护视神经的关键。因此，下一　步积极寻求提高ＧＳ酶活性的药物或方法是视神经保护的一个　重要方向。　

［参考文献］　［１］石晶明，蒋幼芹．兴奋性氨基酸与青光眼［Ｊ］．国际眼科杂志，　２００４，４（４）：６６８～６７４．　［２］　苟琳，张作明，许汉鹏．视网膜ＭＵｌｌｅｒ细胞在视网膜病变中的作用　和研究现状［Ｊ］．眼科研究，２００３，２１（２）：２１７～２２０．　［３］　Ａｓａｉ　Ｓ，Ｋｏｈｎｏ　Ｔ，Ｋａｔａｙａｍａ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｏｘｙｇｅｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｍｏ—　ｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｏｆ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｉｐｈａｓｉｃ　ｇｌｕｔｍａｔｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｕｓｔｉｎ　ｄｉａｌｙｓｉｓ　ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　ｉｎ　ｒａｔ　ｓｔｆｉａｔｕｍ　ｄｕｒｉｎｇ　ａｎｏｘｉａ：ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｅｌｅｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｎｄ　ｒｅｖｅｒｓｅｄ　ｕｐｔａｋｅ［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，２０００，１７：１１０５～ｌｌ１５．　［４］　Ｓｉｃｋ　ＤＲ，Ｋｕｗａｂａｒａ　Ｔ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｎｅｒ　ｒｅｔｉｎａ　ｏｆ　ａｌｂｉｎｌ　ｒａｔｓ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　Ｌ—ｇｌｕｔａｍａｔｅ［Ｊ］．　Ｇｒａｅｆｅ＂ｓ　Ａｒｃｈ　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，１９８５，２２３：２５０～２４８．　［５］　Ｏｔｏｒｉ　Ｙ，Ｗｅｉ　ＪＹ，Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ　ＣＪ．Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｏｗ　ｄｏｓｅｓ　ｏｆ　ｇｌｕ—　ｔａｍａｔｅ　ｏｎ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｒａｔ　ｒｅｔｉｎａｌ　ｇａｎｇｌｉｎｏｎ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏ１　Ｓｃｉ，１９９８，３９：９７２～９８１．　［６］　张军富，王诤华，王大博．急性高眼压后大鼠视网膜谷氨酰胺合成　酶ｍＲＮＡ表达的变化［Ｊ］．眼科研究，２００７，２５（５）：３７３～３７５．　［７］　黄菊芳，童建斌，刘求理．急性高眼压后大鼠视网膜谷氨酰胺合成　酶的表达变化［Ｊ］．神经解剖学杂志，２００４，２０（６）：５４８～５５２．　［８］Ｌａｂｏｗ　ＢＩ，Ｓｏｕｂａ　ｗｗ，Ａｂｃｏｕｗｅｒ　ＳＦ．Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｍｕｓｃｌｅ　ｉｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｐｏｓｔｔｒａｎｓｅｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｍｅｃｈａ—　ｎｉｓｍｓ［Ｊ］．Ａｍ　ＪＰｈｙｓｉｏｌ，１９９９，２７６（６）：ｌｌ３６～１１４５．　

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某大学生物工程学院《普通生物化学》考试试卷(1396)

某大学生物工程学院《普通生物化学》考试试卷(1396)

某大学生物工程学院《普通生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（140分，每题5分）1. 蛋白质中的稀有氨基酸是翻译后修饰而成的。

（）[浙江大学2018研]答案：正确解析：硒代半胱氨酸不属于题目中说的稀有氨基酸，稀有氨基酸指的是羟脯氨酸和羟赖氨酸等氨基酸。

2. 别构酶的动力学曲线符合米氏方程。

（）[华中农业大学2016研]答案：错误解析：别构酶酶促反应的初速率与底物浓度的关系不服从米氏方程，而是呈现S形曲线。

3. DNA复制时，前导链只需1个引物，滞后链则需多个引物。

（）答案：正确解析：滞后链的复制是不连续的，由多个冈崎片段组成，每个冈崎片段的复制都需要引物。

4. 氨基甲酰磷酸既可以合成尿素也可以用来合成嘌呤核苷酸。

（）答案：错误解析：氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ位于线粒体中，参与尿素的生物合成；氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ位于细胞胶溶中，参与嘧啶的生物合成。

5. 自然界中的单糖绝大多数为D型糖，由于果糖是左旋的，因此它属于L型糖。

（）[厦门大学2014研]答案：错误解析：旋光性与DL构型并无关系，DL构型是根据甘油醛的构型判断的。

6. 细菌代谢酶的诱导和合成途径中酶的阻遏，调节蛋白都对操纵子起负调控作用。

（）[中国科学院2005研]答案：错误解析：根据操纵子对于能调节它们表达的小分子的应答反应的性质不同，可将操纵子分为可诱导的操纵子和可阻遏的操纵子。

可诱导的操纵子（如乳糖操纵子）的调控机制：有诱导物存在时，诱导物与调节蛋白（阻遏蛋白）结合使之变构，使调节蛋白无活性，不能与操纵基因结合，促使结构基因转录；无诱导物存在时，调节蛋白（阻遏蛋白）有活性，调节蛋白与操纵基因结合，阻止结构基因转录。

可阻遏的操纵子（如色氨酸操纵子）的调控机制：辅阻遏物存在时，与调节蛋白结合使之变构，使调节蛋白有活性，与操纵基因结合，阻止结构基因转录；辅阻遏物不存在时，调节蛋白无活性，不能与操纵基因结合，促使结构基因转录。

某大学生物工程学院《普通生物化学》考试试卷(6962)

某大学生物工程学院《普通生物化学》考试试卷(6962)

某大学生物工程学院《普通生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（140分，每题5分）1. 蛋白质合成的方向是从羧基端到氨基端。

（）答案：错误解析：2. L抗坏血酸有活性，D抗坏血酸没有活性。

（）答案：正确解析：维生素C又称抗坏血酸，有L及D型两种异构体。

其中只有L 型有生理功效，它的还原型和氧化型都有生物活性。

3. 嘧啶核苷酸从头合成途径不涉及天冬酰胺。

（）[浙江大学2018研]答案：正确解析：嘧啶核苷酸的从头合成途径中嘧啶环上的各个原子分别来自于CO2、谷氨酰胺和天冬氨酸。

4. 胰高血糖素的作用需要G蛋白，而胰岛素的作用不需要G蛋白。

（）答案：错误解析：都需要G蛋白，胰高血糖素需要GS，胰岛素需要Ras。

5. 反转录病毒基因组含有两条RNA链，属于双链RNA病毒。

（）答案：错误解析：反转录病毒基因组含有两个拷贝的正链RNA，与带有正负链RNA的双链RNA病毒不同。

6. 在熔解温度时，双链DNA分子会变为无序的单链分子。

（）[厦门大学2014研]答案：错误解析：DNA链的核苷酸序列已经固定，在变性时只是双链连接的氢键被破坏。

7. 核苷酸补救途径的特征是所有核苷酸都可以用现成的碱基合成核苷酸。

（）[复旦大学2009研]答案：错误解析：核苷酸补救合成途径并不是所有的核苷酸都可以用现成的碱基合成核苷酸，有的只能利用嘧啶核苷或者嘌呤核苷合成。

8. 脯氨酸不能参与α螺旋，它使α螺旋弯曲（bend），在肌红蛋白和血红蛋白的多肽链中，每一个弯曲处并不一定有脯氨酸，但是每个脯氨酸却产生一个弯曲。

（）答案：正确解析：9. 细胞膜类似于球蛋白，有亲水的表面和疏水的内部。

（）答案：正确解析：10. 膜脂沿膜平面的侧向扩散速度与从一侧到另一侧的旋转扩散速度大体相等。

神经营养因子

神经营养因子


神经生长抑制因子（NGI）
• 神经抗增殖蛋白 • 星形胶质细胞抑制素(Astrostatine) • 胶 质 生 长 抑 制 因 子 (Glial growth inhibitory factor ，GGIF)
神经生长因子（NGF）
• NGF的产生
–NGF最初是从鼠的颌下腺中分离到 –NGF可在下丘脑、松果体、胸腺、结缔组织及 附睾 中合成，也可由其它不同类型的细胞，包括血管平 滑肌细胞和成纤维细胞合成。 –在皮质及中枢神经系统中，特定的神经元细胞中的 NGF的表达受谷氨酰胺所促进，受GABA所抑制。 –NGF的表达可被血清、PMA、Vitamin D3所增强，被 糖皮质激素所抑制 –在星形胶质细胞中，IL1、TNF-alpha、PDGF和TGFbeta可促进NGF的表达，在斯旺细胞中TGF-beta可 抑制NGF的表达，而其它细胞因子则无影响。
BDNF的基因结构
• 人BDNF基因定位于11号染色体的11p15.5-p11.2， 位于FSHB 和HVBS1基因座位之间，跨度约4 Mb • 鼠BDNF基因定位于第2号染色体 • 大鼠BDNF基因5个外显子组成，5‘端的4个外显子 与相互分离的启动子相连，3’端的外显子则编码 BDNF蛋白
BDNF的受体
NGF的生物学功能
• NGF的主要功能是促进周围神经系统的感觉和突触神经 元的生存和分化，NGF本身并不是一个有丝分裂原，并 不能促进细胞的分裂增殖 • 在中枢神经系统的胆碱能神经元的发育和功能活性中 起重要的作用 • 持续NGF灌注大鼠时能够防止神经元的死亡，当用抗 NGF抗体处理新生大鼠时可引起全身性神经系统神经元 的完全变性并引起多种神经内分泌失调 • NGF可诱导感觉神经元中多种神经递质样多肽的合成， 包 括 P 物 质 (Substance P, SP) 、 Somatostatin 和 VIP(vasoactive intestinal peptide) • NGF在神经突触末端可抑制去甲肾上腺素的释放，作为 一种抑制性调节因子参与肾上腺素的加工过程，可能 是一种抑制儿茶酚胺刺激的NGF合成的负反馈机制
REM睡眠剥夺后大鼠脑组织氨基酸类神经递质含量的变化

REM睡眠剥夺后大鼠脑组织氨基酸类神经递质含量的变化

REM睡眠剥夺后大鼠脑组织氨基酸类神经递质含量的变化李求实;王升旭【期刊名称】《华南国防医学杂志》【年(卷),期】2002()3【摘要】目的:观察睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)对大鼠脑组织γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(GLU)含量的影响。

方法:用小平台水环境法(flower pot technique)对大鼠进行连续96h快速动眼相(rapid eye movement,REM)睡眠剥夺,以正常饲养组及大平台组为对照,高效液相色谱法测定睡眠剥夺后大鼠额叶皮质、脑干、下丘脑等脑区GABA、GLU含量的变化。

结果:睡眠剥夺后大鼠各脑区脑组织GABA含量。

GABA/GLU值均较对照组明显增高(P<0.01),而GLU含量在脑干、下丘脑两脑区亦较对照组明显增高(P<0.05)。

结论:睡眠剥夺导致大鼠脑组织氨基酸类神经递质含量及比例的改变,是睡眠剥夺过程的神经生物学机制之一。

【总页数】3页(P1-3)【关键词】睡眠剥夺;谷氨酸;y-氨基丁酸【作者】李求实;王升旭【作者单位】第一军医大学中医系针灸骨伤教研室【正文语种】中文【中图分类】Q42【相关文献】1.舒心安神膏对睡眠剥夺大鼠脑组织中单胺类神经递质含量的影响 [J], 徐福平;黄鹂;原嘉民;冯怡;杨志敏2.雄黄染毒后大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的变化 [J], 霍韬光;畅蓓;李维凯;杨卉蕾;张颖花;姜泓3.睡眠剥夺对大鼠脑组织氨基酸类神经递质含量的影响 [J], 王升旭;李求实4.荧光高效液相色谱法测定三种失眠模型大鼠脑组织氨基酸类神经递质的含量 [J], 涂星;郜红利;卢映;吴俊洪5.托吡酯对急性脑缺血后大鼠脑皮层氨基酸类神经递质含量的影响及神经保护作用[J], 刘姜冰;石静萍;赵薛旭;李作汉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。