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红色毛癣菌基因型稳定性的研究

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红色毛癣菌基因型稳定性的研究于晓虹1,杨国玲2,金礼吉2,安利佳2

[摘　要]　目的　探讨红色毛癣菌基因型的稳定性。方法　采用随机引物PCR法和探针与DNA印迹杂交法。以

CTAB法提取DNA。随机引物为OPAA11[5′-ACCCGACCTG-3′],印迹法以NS5和ITS4(真菌的特异性引物)为引物,以红色毛癣菌的标准株为模板,扩增出rDNA的部分18S区、ITSⅠ区、5.8S区和ITSⅡ区为探针,并用随机引物法将探针用P32标记,与EcoRⅠ酶切的基因组DNA杂交。结果　①AP-PCR法:红色毛癣菌扩增的主要带型是2.2,1.7,1.3,0.9,0.7kb,所试红色毛癣菌传代前后扩增带型均无变化。②探针与DNA印迹杂交法:原代(1代)与传代后的(2,3,4代)杂交带型一致,11株红色毛癣菌均表现为3条带,分两型(分子量分别为2.4,3.9,5.9kb和2.4,4.4,6.5kb)。结论　红色毛癣菌基因型稳定。[关键词]　红色毛癣菌;基因型;稳定性[中图分类号]　R379.2 [文献标识码]　A [文章编号]　1001-7089(2006)07-0394-04

AStudyonStabilityofGenotypeofTrichophytonRubrumYUXiao-hong,YANGGuo-ling,JINLi-ji,etal(DepartmentofDermatology,theFirstAffiliatedHospital,DalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)Abstract:　Objective　ToexplorethestabilityofgenotypeinTrichophytonrubrum.Methods　DNAwasextractedwithCTABmethod.Aprobewhichconsistedofthe3′endofthe18SrDNA,adjacentITS1,5.8SrDNAandITS2regionswasamplifiedfromtemplateDNAoftheT.rubrumstandardstrainbyusingfungaluniversalprimersNS5andITS4,labelledbyP32andhybrid-izedwithEcoRI-digestedT.rubrumgenomicDNA.ArbitrarilyprimedPCR(AP-PCR)wasperformedusingrandomprimer[5′-ACCCGACCTG-3′].Results　①AP-PCRanalysisofelevenstrainsincludingtenT.rubrumisolatesandoneT.rubrumstandardstrainshowedsimilarDNApattern:2.2,1.7,1.3,0.9,0.7kb.NochangesinDNApatternwerefounduponsubculture.②Fromtheresultsofhybridization,threebandsandtwotypes(2.4,3.9,5.9kband2.4,4.4,6.5kb)amongtheelevenT.rubrumstrainswereobserved.Nochangesinbandpatternwasfoundwhenthestrainsweresubcultured.Conclusion　ThegenotypeofT.rubrumisrelativelystableonsubculture.Keywords:　Trichophytonrubrum;Genotype;Stability

真菌的生物特性可用表型(phenotype)和基因型(genotype)来描述。二者有着一定的相关性:基因型是表型的遗传基础,表型是基因型特定性状的表现。表型受环境因素等而发生的改变,称表型变异,基因型则相对稳定;若功能性基因发生改变,可致表型相应变化,且能稳定遗传至子代,又称基因型变异[1]。红色毛癣菌表型不稳定,在保存和传代过程中,易发生变异,如菌落形态、产色能力和生理、生化特征等,有些变异是不可逆的。这些表型变异的红色毛癣菌其遗传基因是否也发生变异尚无明确报道,本研究对经传代变异的红色毛癣菌进行基因型分析,从而探讨红色毛癣菌基因型的稳定性。　[基金项目]　大连市科委基金资助项目(2003B3NS217)　[作者单位]　1大连医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁大连　116011;2大连理工大学环境与生命学院,辽宁大连　116024　[作者简介]　于晓虹(1972-),女,辽宁省大连市人,医学硕士,主治医师,主要从事皮肤性病临床工作和真菌学研究。1　材料和方法1.1　材料1.1.1　菌株　1株标准株ATCC294(americantypeculturecollection)由北京大学第一临床医院惠赠;红色毛癣菌的近期临床分离菌株共10株(12,13,14,15,16,18,19,20,21,22),均来自本科真菌实验室。1.1.2　试剂　ExTaq酶(5u/μl)、TaKaRaTaqTM酶(5u/μl)、EcoRⅠ(50u/μl)、探针标记试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司,PCR纯化试剂盒购自北京鼎国生物公司,真菌的特异性引物和真菌的通用随机引物合成于大连宝生物工程有限公司,引物序列NS5为[5′-AACTTAAAGGAATTGACGGAAG-3′],ITS4为[5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′],此对引物由Jackson等[2]筛选,扩增出红色毛癣菌rDNA的部分18S区、ITSⅠ区、5.8S区和ITSⅡ区为探针(见图1)。随机引物OPAA11[5′-ACCCGACCTG-3′]由Liu等[3]筛选。

394 中国皮肤性病学杂志2006年7月第20卷第7期 ChinJDermVenereol,July.2006,Vo.l20,No.7图1　探针在红色毛癣菌rDNA的位置示意图1.1.3　主要仪器　真空转移器:PharmaciaBiotech公司;Hybond-N+膜:PharmaciaBiotech公司;TaKaRaPCRThermalcycler:大连宝生物工程有限公司;WD-9403C型紫外透射仪:北京市六一仪器厂;4℃离心机:Sokvallproducts.L.P;DYY-III2型稳压稳流电泳仪:北京市六厂;电热鼓风干燥箱DGF30/7-ⅠA:南京实验仪器厂;GBil240-29型GSY-Ⅱ号不锈钢电热恒温水浴锅:北京市医疗设备厂。1.2　方法1.2.1　菌株的传代　采用沙氏琼脂试管培养基,每隔4周传代1次,传至第4代。1.2.2　DNA的提取　采用溴化十六烷基三甲铵(cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)法。将菌株转种于SDA液体培养基27℃生长3～4周,无菌钩取出菌落,无菌蒸馏水洗涤2次。用液氮研至粉末状。加入1～2倍体积的DNA提取液,放入微量离心管中离心,取上清液。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1),充分混匀后离心,取上清液,加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠,-20℃静置20min,离心,弃上清液,70%乙醇冲洗2次,自然晾干,溶于灭菌双蒸水中。溶解后再加入RNA酶37℃温育30～60min。1.2.3　随机引物PCR[4](AP-PCR)　用随机引物

OPAA11对所有已纯化的基因组DNA进行PCR扩增,反应总体积为20μl。其中含10×buffer缓冲液(无Mg2+)2μl,dNTP1.6μl(2.5mmol/L),Mg2+2μl(25mmol/L),TaqDNA聚合酶1.5u(5u/μl),引物1μl(10pmol/L),模板DNA50ng。反应条件:预变性95℃2min;40个循环:94℃30s,36℃1min,72℃1min;延伸72℃5min。反应结束后,向每个PCR反应管中加3μl缓冲液,取出每管中所有样品点样于1.5%琼脂糖凝胶上,在100V电压下电泳,指示剂约超过2/3时取出凝胶在紫外灯下分析观察并照相。1.2.4　探针的制备与标记[5]　PCR反应总体积50μl

(ExTaq酶0.25μl,10×buffer5μl,2.5mmol/L的dNTP4μl,引物ITS4,NS5各1μl,标准株基因组DNA约10ng)。循环条件:95℃3min;30个循环:95℃40s,52℃1min,72℃2min;72℃7min。0.8%琼脂糖电泳,观察结果。探针经DNA快速纯化/回收试剂盒纯化后,采用随机引物法,用32P标记。1.2.5　酶切　总体积300μl(50u/μl的EcoRⅠ4μl,样品DNA10μg,10×buffer30μl,加双蒸水至300μl),37℃恒温水浴18h。在0.8%的凝胶上,20V电压,电泳约6～8h。1.2.6　DNA印迹杂交　凝胶经脱嘌呤液、变性液、中和液漂洗后,在真空转移器中转膜,然后固定,预杂交、杂交、洗膜液冲洗,最后曝光。2　结果2.1　11株红色毛癣菌传代过程中菌落形态或色素的变异情况　见表1。表1　11株红色毛癣菌传代后菌落形态和色素变异情况菌株1代形态色素2代形态色素3代形态色素4代形态色素12沟纹酒红沟纹黄沟纹暗红沟纹暗红13羊毛黄羊毛黄绒毛黄绒毛黄14羊毛黄羊毛黄羊毛黄羊毛黄15沟纹暗红沟纹暗红羊毛酒红羊毛酒红16沟纹黄沟纹暗红沟纹暗红沟纹黄18粉末酒红绒毛黄绒毛黄绒毛黄略带红19沟纹黄沟纹黄沟纹黄沟纹黄20绒毛黄绒毛黄羊毛黄羊毛黄21粉末黄绒毛黄绒毛黄绒毛黄22羊毛黄羊毛黄羊毛黄羊毛酒红ATCC绒毛暗红绒毛黄绒毛黄绒毛黄2.2　AP-PCR　11株红色毛癣菌扩增的主要带型是2.2,1.7,1.3,0.9,0.7kb,每株红色毛癣菌传代前后扩增的带型未发生变化,11株红色毛癣菌共有带型为1.7,1.3,0.9,0.7kb,但2.2kb在7株菌株中未出现(见图2～5)。图2　利用引物OPAA11对传代的(12,13,14,15号)红色毛癣菌PCR扩增结果图3　利用引物OPAA11对传代的(16,18,19号)红色毛癣菌PCR扩增结果2.3　探针与EcoRⅠ酶切的DNA印迹法杂交后形成清晰稳定的杂交带型　每株红色毛癣菌原代(1代)与传代后的(2,3,4代)杂交带型一致。11株红色毛癣菌均表现为3条带,可分为两种类型。其中8株(12,13,14,22,16,18,19,20,ATCC)3条带分子量为2.4,

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两种快速鉴定红色毛癣菌方法比较

两种快速鉴定红色毛癣菌方法比较

两种快速鉴定红色毛癣菌方法比较
樊建峰;李恒进;索继江;万喆
【期刊名称】《中华医院感染学杂志》
【年(卷),期】2006(16)5
【摘要】目的对比改良Kane/Fischer皮肤癣菌的鉴定系统和特异性引物鉴定红色毛癣菌。

方法利用改良Kane/Fischer皮肤癣菌的鉴定系统和特异性引物TR1F和TR1R,分别对32株皮肤癣菌进行培养和PCR扩增。

结果改良Kane/Fischer皮肤
癣菌的鉴定系统和特异性引物可以快速准确鉴定红色毛癣菌,但后者更快速、准确。

结论这两种方法可用来快速、准确、敏感地鉴定红色毛癣菌。

【总页数】3页(P592-594)
【关键词】Kane/Fischer系统;红色毛癣菌;PCR
【作者】樊建峰;李恒进;索继江;万喆
【作者单位】解放军总医院;北京大学第一医院
【正文语种】中文
【中图分类】R379.22
【相关文献】
1.基于砌体结构案例分析的中国GB50023-95《建筑抗震鉴定标准》与美国FEMA154/155标准对快速抗震鉴定方法规定的比较研究 [J], 张翼
2.两种快速细菌菌种鉴定方法的比较 [J], 姜艳彬;王海;侯东军;杨红菊;李颖;于雷
3.快速鉴定血培养中金黄色葡萄球菌的两种方法的比较 [J], 田娟;王沛;谢辉
4.快速鉴定血培养中金黄色葡萄球菌的两种方法的比较 [J], 田娟;王沛;谢辉
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常见致病真菌通用引物PCR检测技术研究

常见致病真菌通用引物PCR检测技术研究

环境与健康杂志2009年11月第26卷第11期J Environ Health,November 2009,Vol．26,No．11【论著】文章编号：1001-5914（2009）11-0969-03常见致病真菌通用引物PCR 检测技术研究金敏1，黄爱华2，陈照立1，谌志强1，邱志刚1，王新为1，王景峰1，李君文1摘要：目的建立常见致病真菌的通用引物PCR 检测技术，为研究致病真菌的基因芯片检测技术打下基础。

方法以真菌的5.8S rRAN 基因和28S rRAN 基因为靶基因，利用其保守序列设计用于常见致病真菌检测的PCR 通用引物，并观察检测方法的特异性及敏感性。

结果建立的常见致病真菌通用引物PCR 检测方法可有效检测白色念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉等20个种属的致病真菌，敏感性为15pg/ml DNA ，实际应用效果与标准菌株检测结果一致。

结论本研究建立的通用引物PCR 可以用于常见致病真菌的检测。

关键词：真菌；通用引物PCR ；检测中图分类号：R117文献标识码：ADetection of Common Fungal Pathogens by Genenral Primer PCR JIN Min,HUANG Ai -hua,CHEN Zhao -li,et al .Institute of Hygiene and Environmental Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Tianjin 300050,ChinaAbstract:Objective To develop the detection method of common fungal pathogens by general primer PCR.Methods The primers were designed from the target genes of 5.8S rDNA and 28S rDNA of fungi,and the specificity and sensitivity were observed.Results The general primer PCR can be used to detected C.albicans ,C.parapsilosis ,C.krusei ,C.glabrata ,C.tropicalis ,C.neoformans ,A.fumigatus ,A.flavus ,A.nidulans ,A.niger ,C.carrionii ,P.verrucosa ,S.schenckii ,F.pedrosoi ,T.rubrum ,T.mentagrophytes ,M.gypseum ,M.canis ,E.floccosum ,M.racemosus ,the sensitivity was 15pg/ml of DNA.Conclusion The general primer PCR can be used to detect common fungal pathogens.Key words:Fungi ；General primer PCR ；Detection 基金项目：天津市科技支撑项目(07ZCKFSH01200)作者单位：1.军事医学科学院卫生学环境医学研究所(天津300050)；2.武警医学院(天津300162)作者简介：金敏(1977-)，女，博士，副研究员，从事微生物检验研究。

红色毛癣菌致脓癣1例

红色毛癣菌致脓癣1例

红色毛癣菌致脓癣1例石庆;张丽;孙毅;陈启红;曾同祥【摘要】Objectives We reported a girl with kerion due to Trichophyton rubrum.By molecular diagnosis of affected hairs,the pathogenic isolate was identifiedso that direct treatment could be executed.Methods As well as direct microscopic examination and fungal culture of affected hairs,fungal DNA of them was extracted,and amplification of ITS andsequencing.Results The molecular identification of affected hairs revealed T.rubrum,which was in accordance with fungal culture from the affected hairs.The patient was diagnosed as kerion due to T.rubrum and treated with oral terbinafine 125 mg per day.The lesions subsided after 1 month.Conclusion PCR?based molecular diagnosis of DNA from hair could help to identify pathogenic fungus promptly and indicate proper antifungal treatment.%目的报告1例由红色毛癣菌引起的脓癣,通过病发分子鉴定明确病原菌,早期诊断并进行经验性治疗. 方法提取病发及脓液中的真菌DNA,进行ITS区扩增、测序和比对;同时,对病发和脓液进行真菌镜检及培养,对培养阳性菌落进行形态学、分子生物学鉴定以及体外药敏检测. 结果病发和脓液DNA提取及ITS区鉴定提示红色毛癣菌;真菌镜检阴性;真菌培养经形态学和分子生物学鉴定提示红色毛癣菌. 体外药物敏感性检测显示其对特比萘芬高度敏感. 诊断为红色毛癣菌所致头癣,予口服特比萘芬125 mg/d,治疗1个月后明显改善. 结论直接提取病变组织DNA进行早期分子诊断能够能尽早明确致病菌种并指导用药.【期刊名称】《中国真菌学杂志》【年(卷),期】2015(010)005【总页数】3页(P299-301)【关键词】红色毛癣菌;脓癣;非培养诊断【作者】石庆;张丽;孙毅;陈启红;曾同祥【作者单位】湖北省荆州市中心医院皮肤病与性病科,荆州 434100;湖北省荆州市中心医院皮肤病与性病科,荆州 434100;湖北省荆州市中心医院皮肤病与性病科,荆州 434100;湖北省荆州市中心医院皮肤病与性病科,荆州 434100;湖北省荆州市中心医院皮肤病与性病科,荆州 434100【正文语种】中文【中图分类】R756.1[Chin J Mycol，2015，10（5）：299⁃301]头癣系头皮和头发的皮肤癣菌感染，根据病原菌及临床表现的不同，可分为黄癣、白癣、黑癣和脓癣[1]。

高分辨率溶解曲线在4种皮肤癣菌快速鉴定中的初步应用

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高分辨率溶解曲线在4种皮肤癣菌快速鉴定中的初步应用刘红芳;吴宜泉;刘应辉;谢振谋;陈阳霞;黄进梅;曾维英【期刊名称】《皮肤性病诊疗学杂志》【年(卷),期】2018(025)003【摘要】目的:建立准确、快速鉴定红色毛癣菌、指(趾)间毛癣菌、犬小孢子菌、堇色毛癣菌等4种常见皮肤癣菌的高分辨率溶解曲线(HRM)的方法.方法:根据目的基因序列及参考文献合成基因扩增引物,应用4HRM方法鉴定4种常见皮肤癣菌,并利用rDNA ITS测序验证其准确性.结果:4种皮肤癣菌表现出不同的HRM曲线及Tm值,后续rDNA ITS测序证实了HRM溶解曲线鉴别不同种皮肤癣菌的准确性.结论:本研究采用PCR-HRM分析方法,获得4个常见皮肤癣菌的不同溶解曲线,可用于临床该类皮肤癣菌感染的初步鉴定.【总页数】5页(P123-127)【作者】刘红芳;吴宜泉;刘应辉;谢振谋;陈阳霞;黄进梅;曾维英【作者单位】南方医科大学皮肤病医院,广东广州510091;南方医科大学皮肤病医院,广东广州510091;南方医科大学皮肤病医院,广东广州510091;南方医科大学皮肤病医院,广东广州510091;南方医科大学皮肤病医院,广东广州510091;南方医科大学皮肤病医院,广东广州510091;南方医科大学皮肤病医院,广东广州510091【正文语种】中文【中图分类】R756【相关文献】1.聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线技术在常见沙门菌分型中的应用研究 [J], 盛翔宇;张智杰;薛文成;周连庆;梁雪妮;刘蒙蒙;孟冬娅2.应用荧光定量PCR-探针熔解曲线法快速鉴定分枝杆菌菌种方法的建立及初步评价 [J], 张俊仙;王杰;孙伟民;梁艳;阳幼荣;王兰;殷铭俊;吴雪琼3.基于高分辨率溶解曲线分析鉴别食品中的3种李斯特氏菌 [J], 岳苑;周梦诗;徐娟;李睿;何利华;赵飞;张建中;龚杰4.高分辨率熔解曲线分析技术检测 EGFR 基因突变方法的建立及其初步临床应用[J], 王卓;井昶雯;曹海霞;马蓉;吴建中5.高分辨率熔解曲线分析技术检测BRAF基因V600E突变方法的建立及初步临床应用 [J], 汤俊明;刘奇;王学才;乔国洪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。