重组新城疫病毒表达绿色荧光蛋白基因

46 实验五 用IPTG诱导大肠杆菌表达重组绿色荧光蛋白

一、目的要求

1.学习和掌握重组蛋白在大肠杆菌中表达的原理和实验技术；

2.观察大肠杆菌在诱导过程中的形态。

二、原理

pET 系统是有史以来在E.coli 中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定 (详见I. F.部分)。如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和 pI 启动子控制的T7 RNA 聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG

来启动表达。尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。两种T7 启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。

三、试剂与器材

试剂：LB培养基、IPTG、氨苄青霉素、草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。

器材：摇床、显微镜等。

四、 操作步骤

A、 诱导

许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。

新城疫病毒反向遗传技术研究进展

赵长光;宋松林;赵继勋;张国中

【摘 要】新城疫( newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(newcastle disease

virus,NDV)引起禽类的一种急性、高度接触性传染病,也是目前严重危害我国养禽业的主要疫病之一.虽然NDV只有一个血清型,但不同毒株之间的毒力存在明显差异.有关NDV毒力及其相关决定因素的研究一直是世界范围内的研究热点,其中反向遗传学操作技术是进行NDV毒力相关基因研究的一种主要技术手段.本文简要综述了NDV反向遗传操作系统的构建过程以及利用该技术在NDV研究中取得的最新成果.

【期刊名称】《中国兽医杂志》

【年(卷),期】2011(047)010

【总页数】4页(P56-59)

【作 者】赵长光;宋松林;赵继勋;张国中

【作者单位】中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中牧实业股份有限公司,北京丰台100070;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193

【正文语种】中 文

【中图分类】S852.65+9.5

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）引起禽类的一种急性、高度接触性传染病，也是目前严重危害我国养禽业的主要疫病之一。虽然NDV只有一个血清型，但不同毒株之间的毒力存在明显差异。有关NDV毒力及其相关决定因素的研究一直是世界范围内的研究热点，其中反向遗传学操作技术是进行NDV毒力相关基因研究的一种主要技术手段。本文简要综述了NDV反向遗传操作系统的构建过程以及利用该技术在NDV研究中取得的最新成果。

1 反向遗传操作技术

反向遗传学（reverse genetics）是相对经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律，而反向遗传学则是直接从生物遗传物质入手，通过对遗传物质进行加工和修饰来研究基因突变后产生的生物体的特性，从而确定生物体基因组的结构与功能以及这些突变可能对生物体特性的影响。与之相关的各种研究技术统称为反向遗传学技术（reverse genetics

表达绿色荧光蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建

王芳;焦新安;潘志明;刘文博;高崧;张扬;张如宽;刘秀梵

【期刊名称】《江苏农业研究》

【年(卷),期】2001(22)3

【摘 要】应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。用EcoRⅠ和NcoⅠ将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下 ,克隆进表达载体质粒pYA3334的EcoRⅠ和NcoⅠ位点之间 ,构建成重组表达质粒pYAGFP ,然后转化大肠杆菌X6 2 12、中间宿主X3730、终末宿主X45 5 0。X45 5 0于LB培养基上呈绿色 ,在荧光显微镜下观察 ,整个菌体发绿色荧光。构建的表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌为减毒沙门氏菌活载体基因工程疫苗的研制提供一个良好模型。

【总页数】4页(P55-58)

【关键词】绿色荧光蛋白;减毒鼠伤寒沙门氏菌;重组技术;肠道疾病;动物病

【作 者】王芳;焦新安;潘志明;刘文博;高崧;张扬;张如宽;刘秀梵

【作者单位】扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室

【正文语种】中 文

【中图分类】S852.612

【相关文献】

1.表达PRRSV GP3蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的构建 [J], 赵红妮;许信刚;童德文;罗小毛 2.表达幽门螺杆菌hpaA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建和鉴定 [J], 朱森林;陈旻湖;廖文俊;陈洁;胡品津

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4.表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定 [J], 王芳;焦新安;刘文博;张如宽;刘秀梵

5.表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌感染动力学 [J], 王芳;焦新安;刘文博;孟书霞;张如宽;刘秀梵

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绿色荧光蛋白表达载体的改造和表达

潘求真;徐曙光;李佳;张宝路;田亮;李海;韩红兵;连正兴;杨宁

【期刊名称】《黑龙江畜牧兽医》

【年(卷),期】2007()1

【摘 要】为获得增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent

protein,EGFP)的真核表达载体pEG-FP-N1-MSC,并观察其在猪成纤维细胞中的表达情况,用NheⅠ和AgeⅠ消除pEGFP-N1质粒上的多克隆位点(MSC),然后补平连接,获得增强型绿色荧光蛋白编码基因的真核表达载体pEGFP-N1-MSC质粒,将pEGFP-N1-MSC质粒转化DH5α感受态细胞,于Kanr+LB平板上筛选阳性克隆。重组子经NheⅠ和AgeⅠ双酶切鉴定,将该载体转染猪成纤维细胞,24 h后观察EGFP表达情况,48 h后添加G418进行筛选。结果表明:改造的pEGFP-N1-MSC真核表达载体,成功转染猪成纤维细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光,获得可产生绿色荧光的pEGFP-N1-MSC载体,为构建猪双正选择同源重组载体奠定了基础。

【总页数】3页(P13-15)

【关键词】绿色荧光蛋白;表达载体;猪;改造

【作 者】潘求真;徐曙光;李佳;张宝路;田亮;李海;韩红兵;连正兴;杨宁

【作者单位】中国农业大学动物科技学院

【正文语种】中 文

【中图分类】S828.89

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