免疫技术讲义

当代免疫技术与应用 实验讲义

赫杰 1

生物材料超薄切片的制备过程及方法 目的：初步了解并掌握超薄切片的制备过程及其方法。 实验内容： 一、缓冲液、固定液的配制： （一）原理与说明： 由于细胞本身的缓冲能力很小，在非缓冲的固定液中固定时，细胞会因逐渐酸化而产生损伤。为了防止这种损伤，一般都采用具有缓冲能力的固定液对组织进行固定。由于固定不同的组织对固定液所要求的PH值和渗透压不同，因此，根据不同组织的要求，可通过缓冲液调整固定液的PH值和渗透压。常用的缓冲液有磷酸缓冲液，醋酸－巴比妥缓冲液和二甲申酸钠缓冲液。本实验采用磷酸缓冲液。 （二）器材及药品： 分析天平、细口瓶、量筒、精密试纸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、25％戊二醛、锇酸和蒸馏水。 （三）步骤： １、0.2M磷酸缓冲液的配制： （1）甲液，0.2M磷酸氢二钠水溶液的配制： 称取 Na2 HPO4 .12H2 O 7.16g，加蒸馏水定容至100ml。 （2）乙液，0.2M磷酸二氢钠水溶液的配制： 称取 NaH2 PO4 .2H2 O 3.12g，加蒸馏水定容至100ml。 （3）0.2M磷酸缓冲液的配制： 0.2M磷酸氢二钠和0.2M磷酸二氢钠水溶液的比例不同，其PH值不同。

根据下表可配制不同PH值的0.2M磷酸缓冲液。

PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 甲液(ml) 13.5 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5

乙液(ml) 36.3 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5

２、磷酸缓冲戊二醛固定液的配制： 根据下表可配制不同浓度的0.1M磷酸缓冲戊二醛固定液。

戊二醛最终浓度(％) 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0 0.2M磷酸缓冲液(ml) 5 5 5 5 5 5 5 25％戊二醛溶液(ml) 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.6 1.8 加双蒸馏水定容至(ml) 10 10 10 10 10 10 10 注：戊二醛加入缓冲液后PH值稍有下降可用缓冲液进行调整。 2

3、磷酸缓冲锇酸固定液的配制： （1）2％的磷酸缓冲锇酸固定液原液的配制： 将装有1.0g锇酸的安瓶用洗液浸泡，洗去瓶上的标签和表面的各种有机质，然后用蒸馏水洗净擦干。将洗净的安瓶装入棕色磨口瓶中，盖上盖并用力振荡磨口瓶，使其内部的安瓶振破，加入所需量的水让锇酸缓慢溶解，放在冰箱中保存。 （2）0.1M磷酸缓冲的1％锇酸固定液的配制： 用适量的0.2M磷酸缓冲液（根据需要调节PH值）加入等量的2％锇酸原液即可（冰箱保存）。 二、生物材料的化学固定与脱水 （一）原理与说明： 用化学固定剂或冰冻、干燥及高温等物理方法迅速杀死细胞过程叫固定。电镜生物样品的化学固定是化学固定剂与细胞成分，即蛋白质和脂类形成交联来保存细胞结构，把可动的动态系统转变成不可动的、稳定的胶体，并且这种胶体要在所有方面近可能地接近生活有机体的状态，而不会由于一系列的后继处理发生移位或丢失内部的结构物质。本实验采用戊二醛－锇酸双重固定法对生物材料进行固定。 双重固定法使戊二醛与锇酸这两种固定剂相互取长补短，更好地发挥固定作用。 固定后的组织要经过包埋剂的包埋、聚合形成能够进行超薄切片的硬块。由于包埋剂不溶于水，只有将细胞中的游离水彻底清除之后，非水溶性的包埋剂才能渗入细胞。因此，固定后的样品必须进行彻底脱水。常用脱水剂有乙醇和丙酮。脱水剂的特点是即能和水相溶又能和包埋剂相溶。在脱水过程中，逐渐提高脱水剂的浓度可将细胞内的水分取代。 （二）器材、药品： 1、实验材料：动物组织（白鼠的肝、肾脏等）、植物组织（洋葱或小

麦的根尖等）。 ２、药品：0.1M磷酸缓冲2.5％戊二醛固定液，0.1M磷酸缓冲1％锇酸固定液，0.1M磷酸缓冲液， 脱水剂（乙醇、丙酮）。 ３、器具：解剖器具，刀片，注射器，青霉素瓶，滤纸，硫酸纸。 （三）步骤 １、取材：（1）动物取材：杀死动物，立即解剖并取下所需要的组织，用双面刀片切成1mm3 左右的小块；（2）植物取材：把洋葱或小麦发根至1.5－2cm时，用刀片切去根冠，在分生区处取0.5－2mm长的组织。

２、前固定：将取下的动物组织或植物根尖迅速放入装有2.5％戊二醛固定液的瓶中，固定2－24小时（根据材料的性质和固定的温度而定）。 3

３、漂洗：经戊二醛固定后的组织块用缓冲液漂洗1－8小时，将组织表面的戊二醛洗净，在此期间更换2－3次缓冲液（漂洗用的缓冲液的PH值和离子浓度与固定液的PH值和离子浓度相同）。 ４、后固定：将洗好的组织块放入1％锇酸固定液中固定1－2小时。 ５、漂洗：从锇酸固定液中取出的组织块用蒸馏水清洗5分钟，洗净样品表面的锇酸。 ６、脱水：洗净的样品用脱水剂脱水，其程序如下： 30％ 乙醇 15－20分钟 50％ 乙醇 15－20分钟 70％ 乙醇 15－20分钟 80％ 乙醇 15－20分钟 90％ 丙酮 20－30分钟 100％丙酮 20－30分钟 100％丙酮 20－30分钟 经过脱水后的样品立即进入包埋剂浸透、包埋。如果这一过程不能马上进行，样品可保存在70％的乙醇中，在进行包埋前再继续脱水。 三、浸透、包埋与聚合： （一）原理与说明：浸透是用包埋剂将组织内的脱水剂取代，包埋剂浸入细胞中，使细胞内外所有空间都被包埋剂充填。包埋剂为一种环氧树脂，其分子内有两种反应基团，即环氧基和羟基。环氧基位于分子末端，与一种叫催化剂的胺类化合物反应，环氧基打开，形成首尾相联的长链化合物。分子中的羟基与酸酐结合形成分子间的交联桥。因此，当树脂、胺类及酸酐三者混合并加温后，树脂分子发生三维聚合，使包埋剂由单体聚合成高分子，并使样品包埋其中，形成具有一定硬度和韧性的包埋块，保存了细胞内的精细结构，有利于超薄切片的操作。 （二）器材、药品： 脱水后的组织块，二号药用胶囊，包埋剂（Epon812，DDSA，MNA，DMP－30）玻璃棒，牙签，聚合器。

（三）步骤： １、包埋剂的配制： 准确称取： Epon812 16g DDSA 8g MNA 12g DMP－30 0.2ml 4

前三种成分先混合，充分搅拌（大约30分钟）后，加入DMP－30，再充分搅拌一小时左右。 ２、浸透：脱水后的样品经由丙酮和上述配制的包埋剂的混合液浸透，将组织内的脱水剂用包埋剂取代。其程序如下：

2/3丙酮+1/3包埋剂 浸透1小时 1/2丙酮+1/2包埋剂 浸透1小时 1/3丙酮+2/3包埋剂 浸透1小时 包埋剂 浸透1小时 包埋剂 浸透12－36小时

４、包埋： （1）将药用空心胶囊烘干。 （2）将胶囊放入模具架上，用玻璃棒将包埋剂加入胶囊中并注满。 （3）用牙签将样品挑入装有包埋剂的胶囊中，使其自然沉到胶囊底部，填号标签放入胶囊内。 （4）将装有样品的胶囊放入聚合器或恒温箱内加温聚合。聚合的温度和时间如下： 35℃ 24小时，45℃ 24小时， 60℃ 24小时依次逐渐进行。 包埋操作注意事项： （1）所有样品应注意防潮； （2）所用器皿应烘干，不能有任何水分； （3）配药时每加入一样药品都要搅拌均匀； （4）包埋时动作要轻巧，防止产生气泡； （5）及时清洗盛过包埋剂的容器； （6）制作好的包埋块应放在带盖的瓶中或纸袋内，保存在干燥器中。 四、切片、染色 （一）原理与说明： 电镜的透射电子穿透能力很弱，因此，大多数标本不能直接在电镜下观察。电镜的分辨能力不仅取决于显微镜本身，更主要是切片的厚度。要获得高质量的电镜照片，固定和包埋的样品必须用超薄切片机切成大约50－70nm厚的超薄切片。超薄切片要经过染色才能在电镜下显示清晰的结构。染色的目的是增强样品中各种结构之间的图象反差或选择性显示某些结构成分。生物样品超薄切片的染色为“电子染色”，即用重金属化合物与细胞结构物质结合，增加细胞结构物质的电子密度，以此增强对电子的散射能力，使图象呈现出明显的黑白对比。生物样品超薄切片的染色可分 5

为常规的细胞学染色和细胞化学染色。本实验采用常规细胞学染色，即醋酸双氧铀－柠檬酸铅双重染色法。醋酸双氧铀主要使细胞核及结缔组织染色，柠檬酸铅主要提高细胞质成分的反差。 （二）器材 样品包埋块，铜网（100目或200目），超薄切片机，染色液（醋酸双氧铀染色液和柠檬酸铅染色液） （三）步骤 1、修块：修去组织块周边的包埋剂，并使块的顶端修成金字塔形，顶

面修成梯形或长方形。 2、切片：将修好的包埋块固定在超薄切片机的样品臂上，按超薄切片

机操作规程将样品切成50－70nm厚的切片。 4、染色： （1）醋酸双氧铀染色：将捞有切片的铜网以适当的间距放置在蜡盘上（培养皿中浇一层熔化的石蜡冷却后即成蜡盘），用吸管吸取醋酸双氧铀溶液，逐滴滴在铜网上，盖好蜡盘染色30分钟。 （2）漂洗：取出铜网用蒸馏水洗涤三次，用滤纸吸出水分，自然干燥。 （3）柠檬酸铅染色：将上述水洗干燥后的铜网摆入另一只蜡盘中，同时放上几粒固体氢氧化钠以吸收蜡盘中的CO2 ，防止碳酸铅的生成。用吸

管吸取柠檬酸铅染色液，逐滴滴在铜网上，密闭蜡盘，染色30分钟后，取出铜网，水洗三次，滤纸吸干，自然干燥即可观察。