大肠杆菌基因工程人胰岛素

人工胰岛素制备工艺的研究及其进展摘要:据WHO 统计，全世界糖尿病患者已接近1.2亿，而我国目前糖尿病患者的总数已达到3000万人，跃居世界第二位，其中数百万患者长期使用胰岛素治疗。

如今我国经济发展迅速，同时也带来了巨大生活的压力和健康问题，并且带有一定的遗传因素，数百万患者需要长期使用胰岛素治疗。

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。

而目前临床使用的胰岛素有三种来源：1、动物胰岛素（从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体）。

2、半合成胰岛素（将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素）。

3、重组人工胰岛素（利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同）。

可见第三种方法是目前最好的副作用最小，而且简单安全的方法。

所以针对重组人工胰岛素的制备做了以下研究。

关键词:重组人工胰岛素；大肠杆菌；(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原；在当今世界范围内，诺和诺德、辉瑞、万安特以及我们国内的通化东宝、深圳科兴等生物技术公司在胰岛素的生产技术上已经都是很先进的水平了，也就是重组人工胰岛素的制备方法。

这种方法是自从动物中提取胰岛素和人工合成胰岛素的方法以来，最简便而且是最有效最安全的制备胰岛素的方法。

它是发酵工程技术和基因工程技术结合的产物，也是造福人类的新一代药物生产方法。

不仅在治疗糖尿病方面的作用突出，同时对治疗癌症等严重影响人类健康的疾病的治疗开创了思路。

所以，作为本科生的生物技术专业制药方向的大学生来说，这种利用基因工程，发酵工程等方法工业制备胰岛素的原理和流程的工艺，和这种开拓创新的思维是我们必须要了解和学习得。

1重组人工胰岛素的生产原理通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。

基因工程技术在生物制药领域的应用基因工程技术的迅速发展为生物制药领域带来了巨大的改变，使得人类能够更有效地生产出大量的生物药物以满足市场需求。

本文将介绍基因工程技术在生物制药领域的应用，并探讨其对医药行业的意义。

一、基因工程技术在药物研发中的应用随着基因工程技术的不断成熟，生物制药领域的药物研发工作得以加速和优化。

通过基因工程技术，科学家们可以对目标蛋白质进行基因重组，将其引入适宜的宿主细胞中生产。

这种方法取代了传统的化学合成药物，能够制造出更安全、更有效的生物药物。

基因工程技术在药物研发中的应用已经造福了许多病患。

例如，通过基因工程技术，人类已经成功地制造出重组人胰岛素用于治疗糖尿病，使得糖尿病患者能够获得更好的治疗效果。

同样，基因工程技术也被用于生成重组人生长激素、重组人血液凝块溶解酶等药物，为生物制药领域带来了巨大的发展潜力。

二、基因工程技术在药物生产中的应用除了在药物研发中的应用外，基因工程技术还被广泛用于药物的生产过程中。

传统的药物生产通常使用化学合成的方法，速度慢且效果不稳定。

而通过基因工程技术，科学家们可以利用微生物、植物或动物细胞作为生产工厂，大规模合成目标药物。

基因工程技术在药物生产中的应用已经显著提高了药物的制造效率和质量。

以重组人胰岛素为例，科学家们通过基因工程技术将重组人胰岛素的基因导入大肠杆菌中，使其能够大量合成胰岛素。

这种方法不仅使得胰岛素的产量大幅增加，还提高了胰岛素的纯度和稳定性，确保药物质量的可控性。

三、基因工程技术的意义和前景基因工程技术在生物制药领域的应用对医药行业具有重要的意义。

它能够帮助我们更好地理解人类疾病的发生机制，并提供新的治疗方法。

基因工程技术为药物的研发和生产提供了新的思路和方法，提高了药物的效力和安全性。

未来，随着基因工程技术的不断发展和创新，生物制药领域的发展前景将更加广阔。

我们可以预见，基因工程技术将有助于发现更多的疾病治疗靶点，并加速相关药物的研发过程。

1．基因工程的操作过程与应用（1）基因工程的操作步骤（2）基因工程的应用：培育转基因植物和转基因动物，生产基因工程药物，进行基因治疗。

（3）目的基因导入不同受体细胞的过程生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞到受体细胞染色体的DNA上→表达精卵发育→获得具有新性状的动物混合→感受态细胞吸收DNA分子（4）基因治疗与基因诊断的不同点原理操作过程进展基因治疗基因表达利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)临床实验基因诊断碱基互补配对制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况临床应用2．蛋白质工程（1）流程图写出流程图中字母代表的含义：A．转录，B．翻译，C．分子设计，D．多肽链，E．预期功能。

（2）结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。

（3）应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。

学科&网考向一目的基因的获取及基因表达载体的构建1．利用基因工程技术可使大肠杆菌生产人的胰岛素，下列相关叙述正确的是A．人和大肠杆菌在合成胰岛素时，转录和翻译的场所都是相同的B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C．通过检测，大肠杆菌中没有胰岛素产生则可判断重组质粒未导入受体菌D．选用大肠杆菌作为受体细胞主要原因是繁殖快、易培养、产量高【参考答案】D【试题解析】人是真核生物，大肠杆菌是原核生物，真核细胞转录在细胞核内，原核细胞在拟核中，A 错误；不同的限制酶识别不同的核苷酸序列，B错误；通过检测，大肠杆菌中没有胰岛素产生则可判断重组质粒未导入受体菌或虽已导入受体，但没有表达，C错误；D.利用基因工程技术可使大肠杆菌生产人的胰岛素时，选用大肠杆菌作为受体细胞主要原因是繁殖快、易培养、产量高，D正确。

各类胰岛素的区别 各种胰岛素的区别有哪些?胰岛素是治疗糖尿病的有效药物，⽬前胰岛素常见的有六种，其优势与特点各有不同。

那么各种胰岛素有什么区别呢?下⾯由店铺为你分享各类胰岛素的区别的相关内容，希望对⼤家有所帮助。

各种胰岛素的区别有哪些 ⼀、六种常见的胰岛素： 1、普通胰岛素：由动物胰腺提取的胰岛素，可引起过敏反应、脂质营养不良及胰岛素耐药，不宜长期使⽤。

2、基因⼯程胰岛素：由⾮致病⼤肠杆菌加⼊⼈体胰岛素基因⽽转化⽣成，其结构、化学及⽣物特性与⼈体胰腺分泌的胰岛素完全相同。

与动物胰岛素相⽐，不易引起过敏反应和营养不良。

3、低精蛋⽩锌⼈胰岛素(诺和灵N、优泌林N)：通过基因重组技术，利⽤酵母菌产⽣的⽣物合成⼈胰岛素，为中效胰岛素制剂。

⽤于中、轻度糖尿病，治疗重度糖尿病患者可与正规胰岛素合⽤，使作⽤出现快⽽维持时间长。

4、中性可溶性⼈胰岛素(诺和灵R、优泌林R)：⼜称中性⼈短效胰岛素，结构与天然的⼈胰岛素相同，可减少过敏反应，避免脂肪萎缩及避免产⽣抗胰岛素作⽤。

⾎液中胰岛素的t1/2 仅⼏分钟，因此胰岛素制剂的时间作⽤曲线完全由其吸收特性决定。

5、双时相低精蛋⽩锌⼈胰岛素(预混⼈胰岛素，诺和灵30R，诺和灵50R，优泌林30R)：为可溶性胰岛素和低精蛋⽩锌胰岛素混悬液，以诺和灵30R为例，含30%可溶性胰岛素和70%低精蛋⽩锌胰岛素。

可⽤于各型糖尿病患者。

6、门冬胰岛素(诺和锐)：为⼀快速作⽤的胰岛素类似物，与⼈胰岛素相⽐，其氨基酸发⽣了改变，阻断了胰岛素之间的相互作⽤，使六聚体和⼆聚体能迅速地解离为单体⽽有效地吸收，迅速发挥降糖作⽤，不需在之前很久就注射，提⾼了治疗的灵活性。

⼆、猪胰岛素、⽜胰岛素、⼈胰岛素的区别： 胰岛素制剂按来源不同可分为3种：猪胰岛素、⽜胰岛素、⼈胰岛素。

前两种胰岛素是从猪、⽜的胰腺中提取出来的，⽽⼈胰岛素是通过基因⼯程改良法由细菌⽣产出来的。

这三种胰岛素都是由51个氨基酸组成的，但⽜胰岛素有3个氨基酸与⼈胰岛素不同，⽽猪胰岛素只有⼀个氨基酸与⼈胰岛素不同，所以从氨基酸组成上⽐较，猪胰岛素更接近⼈胰岛素，因⽽抗原性就⽐⽜胰岛素弱，故不易在注射后产⽣抗胰岛素抗体、副作⽤可能也⽐⽜胰岛素轻。

胰岛素转基因-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：胰岛素是一种重要的激素，在调节血糖水平方面发挥着关键作用。

胰岛素转基因技术是利用基因工程技术将胰岛素基因导入其他生物体中，以便在更大规模上生产胰岛素。

这一技术的应用不仅提高了胰岛素的生产效率，也为糖尿病患者提供了更好的治疗选择。

本文将探讨胰岛素的作用、转基因技术与胰岛素生产的关系，以及胰岛素转基因产品的应用，旨在全面了解胰岛素转基因技术的意义和影响。

1.2 文章结构文章的结构分为引言、正文和结论三部分。

在引言部分，我们将会介绍胰岛素和转基因技术的基本概念，以及本文的目的和意义。

在正文部分，我们将会探讨胰岛素的作用及其在人体内的功能，以及转基因技术如何被应用于胰岛素的生产过程中。

我们还将探讨胰岛素转基因产品的应用，以及与传统胰岛素相比的优势和局限性。

在结论部分，我们将总结胰岛素转基因的影响，探讨未来发展的展望以及对这一技术的评价和展望。

通过全面的讨论和分析，希望能够对胰岛素转基因技术有一个更深入的了解。

1.3 目的本文的目的主要在于探讨胰岛素转基因技术在生产和应用中的重要性和影响。

首先，我们将介绍胰岛素的作用以及为什么胰岛素对人类健康至关重要。

其次，我们将深入探讨转基因技术如何在胰岛素的生产过程中发挥作用，以及转基因胰岛素产品的优势。

最后，我们将讨论胰岛素转基因对医疗领域和人类健康的影响，展望未来胰岛素转基因技术的发展方向。

通过本文的阐述，希望读者能够更全面地了解胰岛素转基因技术的重要性和潜力，从而推动相关领域的发展和进步。

2.正文2.1 胰岛素的作用胰岛素是一种由胰腺分泌的激素，非常重要的作用是调控血糖水平。

当我们进食时，食物中的碳水化合物被消化吸收后，血糖水平会上升。

胰岛素的主要作用是促使体内细胞摄取血液中的葡萄糖，转化为能量供给身体各个器官和组织使用，从而使血糖水平维持在恰当的范围内。

此外，胰岛素还能促进体内脂肪和蛋白质的合成，并抑制葡萄糖的产生。

基因工程经典例题解析一、例题1（一）题目已知一种限制酶能识别DNA分子中的GAATTC序列，并在G和A之间进行切割。

现有一段DNA分子序列为：- 5’—GGATCCGAATTCCTTAAG—3’- 3’—CCTAGGCTTAAGGAATTC—5’若用该限制酶对其进行切割，会产生几个黏性末端？这些黏性末端的碱基序列是什么？（二）解析1. 识别切割位点：-该限制酶识别GAATTC序列，在DNA分子中有两处该序列，分别是5’—GGATCCGAATTCCTTAAG—3’中的GAATTC和3’—CCTAGGCTTAAGGAATTC—5’中的GAATTC（注意DNA两条链的反向平行关系）。

2. 切割产生黏性末端：-在G和A之间切割后，产生的黏性末端为：- 5’—G AATTC—3’- 3’—CTTAA G—5’- 5’—CTTAA G—3’- 3’—G AATTC—5’-共4个黏性末端，碱基序列分别是5’—G AATTC—3’和5’—CTTAA G—3’（另两条链的反向互补序列与之相同，只是方向相反）。

二、例题2（一）题目在基因工程中，将目的基因导入受体细胞是一个关键步骤。

现有以下几种受体细胞类型：植物细胞、动物细胞、大肠杆菌细胞。

若目的基因是一种编码胰岛素的基因，应选择哪种受体细胞最为合适？为什么？（二）解析1. 分析受体细胞特点：-植物细胞：可以通过农杆菌转化法、基因枪法等方法导入目的基因，但植物细胞中没有胰岛素加工的相关内质网、高尔基体等细胞器，不能对胰岛素进行正确的加工和分泌。

-动物细胞：具有内质网、高尔基体等细胞器，能够对胰岛素进行正确的加工和分泌，适合胰岛素基因的表达。

-大肠杆菌细胞：是原核细胞，没有内质网和高尔基体等细胞器，不能对胰岛素进行糖基化等加工，且胰岛素基因中可能含有大肠杆菌不能识别的密码子等，表达出的胰岛素可能没有活性。

2. 得出结论：-应选择动物细胞作为受体细胞最为合适，因为它能对胰岛素进行正确的加工和分泌，使胰岛素具有生物活性。

利用重组酵母菌生产人胰岛素摘要：利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。

其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建，根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子，采用基因半合成技术合成人胰岛素基因。

将合成的胰岛素基因克隆到pPIC9质粒，构建了毕赤(Pichia)酵母重组表达载体pPINS319，用BglII线性化后用电转化法导入毕赤酵母GSll5菌株，经过营养筛选和PCR 复筛，得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株。

后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产，通过补料-分批发酵获得发酵液，分离纯化后获得人胰岛素。

纯化后的重组人胰岛素产品经SDS-PAGE检测，氨基酸组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。

关键词：重组酵母；人胰岛素；发酵；纯化；鉴定Using recombinant yeast to produce human insulinHuSheng 1142043040Abstract：The proceedings of produce human insulin by recombinant yeast show as follow:get purpose gene→c onstruct the recombinant plasmid→construct the genetic engineering bacteria→fermentation of e ngineering bacterium→separation and purification of the product→identification of the product. The front three processes is building engineering bacteria of human insulin yeasts . Insulin gene was synthesized according to the amino acid sequence of human insulin and yeast preferential codons. The insulin gene was cloned in to pPIC9 vector and expression vector pPINS319 was constructed. The expression vector was digested with BgllI and then used to transform Pichia Pastoris GSll5 by electroporation. The expression analysis showed that the insulin gene w s able to expressed efficiently in Pichia Pastoris. The posterior three processes is large-scale production by fermentation.Through fed - batch fermentation getting fermentation liquor, separation and purification the fermentation liquor getting human insulin.The final products purified by supedrex 75showed one band by SDS-PAGE analysis and were identical with the native human insulin by all critetia employed.(SDS-PAGE analysis,amin acid composition analysis and bioidentity assay) Keywords：recombinant yeast;human insulin; fermentation;purification;identification 胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。

重组人类胰岛素制备工艺研究人类胰岛素是治疗糖尿病的重要药物，自20世纪初被发现以来就一直受到广泛的关注。

随着现代生物技术的发展，利用重组DNA技术生产人类胰岛素已成为最主要、最经济的方法。

本文将就重组人类胰岛素制备工艺进行探讨。

一、重组人类胰岛素是什么人类胰岛素是由胰岛细胞产生的多肽激素，主要调节葡萄糖在体内的代谢。

结构上，它包括两个多肽链，A链和B链，它们由21个和30个氨基酸组成，而这些氨基酸的顺序是非常特定的。

重组人类胰岛素是通过将人类胰岛素的DNA序列插入到细菌或酵母等生物的DNA中，利用这些生物基因表达和生产人类胰岛素的蛋白质，达到生产大量纯度极高的人类胰岛素的目的。

这是一种完全体外合成人类胰岛素方法。

二、生产重组人类胰岛素的主要工艺流程生产重组人类胰岛素的主要工艺流程包括基因克隆、重组体表达、糖链修饰、纯化和结构鉴定等步骤。

1. 基因克隆生产重组人类胰岛素的第一步是从人类胰岛素基因库中选取A、B链基因、基因交链片段、启动子、终止子和选择反抗性基因等。

然后，在体外进行重组，使这些片段组合在一起，形成完整的胰岛素基因。

接下来，将这个基因克隆到表达载体上，以便细胞可以识别和表达它。

2. 重组体表达一旦重组表达载体被构建，便可以将其转化到大肠杆菌等生物中。

接着，这些生物被培养在液体培养基或固体培养基中，以促进基因表达和胰岛素蛋白合成。

重组人类胰岛素的产生需要大量的细胞培养，通常使用发酵罐、生物反应器和其他相关设备。

3. 糖链修饰胰岛素的生物活性取决于胰岛素蛋白中的糖链修饰。

然而，大肠杆菌在自然生态中并不会进行糖基化修饰，获取的表达产品如此也是裸露的蛋白链体，无法发挥生物活性。

为了获得具有生物活性的重组人类胰岛素，需要对其进行糖链修饰。

这个过程需要进行歧化和酶法处理，以检查和修改粘附到胰岛素蛋白上的糖基。

糖链修饰的最终产品可以具有各种形式的糖基链。

4. 纯化重组人类胰岛素是在细胞内产生的，因此需要进行后期精细纯化。