土人参愈伤组织诱导及细胞悬浮培养研究

土人参愈伤组织诱导及细胞悬浮培养研究

赵俊,吴虹丽,马林*󰀁(西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳621010)

摘要󰀁[目的]建立土人参愈伤组织的诱导、增殖继代培养及其细胞悬浮培养的技术体系。[方法]研究不同植物激素组合对叶片、茎段愈伤组织诱导的影响;采用液体振荡培养法测定叶片愈伤组织细胞悬浮生长曲线。[结果]叶片最易诱导产生愈伤组织,最佳诱导、增殖培养基为MS+2,4󰀁D1.0mg/L+NAA0.5mg/L+6󰀁BA0.5mg/L(pH5.8)。由叶片愈伤组织建立的细胞系生长呈󰀂S 型曲线,最适继代周期为15d。[结论]以叶片为外植体经愈伤诱导、增殖培养可建立良好的细胞悬浮系。关键词󰀁土人参;愈伤组织;组织培养;细胞悬浮培养中图分类号󰀁Q813.1+1󰀁󰀁文献标识码󰀁A󰀁󰀁文章编号󰀁0517-6611(2010)18-09435-03

ResearchonCallusInductionandCellSuspensionCultureofT.paniculatumZHAOJunetal󰀁(CollegeofLifescienceandEngineering,SouthwestUniversityofScienceandTechnology,Mianyang,Sichuan621010)Abstract󰀁[Objective]Theamiwastoestablishthetechnicalsystemsofcallusinduction,multiplicationsubcultureandthecellsuspensioncultureofT.paniculatum.[Method]EffectsofdifferentplantgrowthregulatorsoncallusinductionfromleafandstemsegmentwerestudiedThecellsuspensionculturewasestablishedfromleafcallusesandthegrowthcurvewastestedbyliquidshakeculturemethed.[Result]Leafwastheoptmialexplantforcallusinduction.Theoptmialmediumofmultiplicationsubcultureforleafcalluseswas2,4󰀁D1.0mg/L+NAA0.5mg/L+6󰀁BA0.5mg/L(pH5.8).ThecellgrowthofT.paniculatumwith󰀂S typecurvewasobservedandoptmialsubculturecycleofsuspensioncellwas15days.[Conclusion]ThecallusinducedfromleafexplantwasexcellentforestablishingcellsuspensionofT.panicula󰀁tum.Keywords󰀁T.paniculatum;Callus;Tissueculture;Cellsuspensionculture

作者简介󰀁赵俊(1985-),男,四川巴中人,在读硕士,研究方向:药用植物生物技术及天然产物。*通讯作者。收稿日期󰀁2010󰀁03󰀁15󰀁󰀁土人参[Talinumpaniculatum(Jaeq)Gaertn]为马齿苋科土人参属植物,我国南方各地均有栽培或野生。以根入药,具有健脾润肺、止咳、调经等功效[1]。土人参水提取物可诱导PC12细胞的分化,冉靓等[2]分离纯化得到活性多糖;沈笑媛等[3]从根中分离出胡萝卜苷、齐墩果酸、󰀁󰀁谷甾醇等活性成分。土人参的组织培养已有原生质体培养再生植株[4]、单细胞培养再生植株[5]、快速繁殖[6-7]等报道,但对以种子为起始材料,进而建立细胞悬浮培养系尚未见报道。笔者以土人参种子材料,无菌萌发后进行愈伤组织诱导、继代增殖培养及细胞悬浮培养,为研究土人参细胞悬浮培养次生代谢产物奠定了基础。1󰀁材料与方法1.1󰀁材料󰀁野生土人参采自四川省甘孜州康定县,由绵阳师范学院罗明华教授鉴定为T.paniculatum。材料移栽于花盆并按常规进行水肥管理。采集成熟种子作为外植体接种。1.2󰀁方法1.2.1󰀁愈伤组织的诱导。将土人参种子装于10ml无菌离心管中,用70%乙醇浸泡1min,无菌水冲洗2次后加入0.1%HgCl2处理10min,无菌水冲洗5~6次,无菌接种至MS基本培养基中。待土人参苗培养1个月后,进行愈伤组织诱导试验,将实生苗的叶片剪成0.5cm见方的小块,茎段剪成0.5~0.8cm的小段接种至相应单因素及组合试验培养基中,观察愈伤组织诱导及生长情况。1.2.2󰀁细胞悬浮系的建立。选取继代培养后质地松散、生长良好的愈伤组织约10g,转接于MS液体培养基中,500ml三角瓶装量150ml。15d继代培养1次,继代时用100目尼龙网过滤除去大块愈伤组织,培养液按照与新鲜培养液1!3的比例进行混合再培养。筛选分散度好、较均匀、生长快的细胞作为种子,传代5~6次后得到性能良好的悬浮细胞系。生长曲线的测定参照江曙等[8]稍作修改,测定细胞鲜重,用250ml三角瓶培养,培养液体积为100ml。1.2.3󰀁培养条件。MS为基本培养基,附加不同浓度的6󰀁BA、NAA和2,4󰀁D,加入0.8%琼脂和3%的蔗糖,调pH值为5.8,121∀、1.05#105Pa灭菌20min。培养温度(25∃2)∀,光照强度:种子萌发及细胞悬浮培养为暗培养,种子萌发后、愈伤诱导与增殖过程1000~1500lx,光照时间:12h/d。2󰀁结果与分析2.1󰀁土人参实生苗无菌生长情况󰀁土人参种子无菌接种至MS无激素培养基中,暗培养3d可见种子开始萌发,首先种子膨大,后种皮逐渐破裂,露出白色胚根。种子萌发后转到光照强度1000~1500lx进行培养,7d可见真叶出现,叶片呈鲜绿色。培养1个月左右可见小苗长高至5~8cm,叶片呈绿色、且肥厚,茎段粗壮。剪取叶片和茎段用于愈伤组织的诱导试验。2.2󰀁不同激素对外植体愈伤组织诱导的影响2.2.1󰀁2,4󰀁D的诱导效应。由表1、2可知,2,4󰀁D对土人参叶片、茎段愈伤组织诱导效果显著,随着激素浓度的增加愈伤组织诱导率上升。当2,4󰀁D浓度为1.5~2mg/L时,茎段愈伤组织诱导率可达100%;随着培养时间的延长,茎段愈伤组织出现褐化、生长势差。2,4󰀁D诱导产生的叶片愈伤组织为黄白色、生长势好,随着培养时间延长,愈伤组织量不断增大。2.2.2󰀁6󰀁BA的诱导效应。由表1、2可知,6󰀁BA对土人参叶片及茎段愈伤组织诱导效果均不明显,当6󰀁BA浓度为2.0mg/L时,诱导率最高,分别为50%、54.2%。叶片愈伤组织为白色、茎段愈伤组织为浅黄色,随着培养时间的延长,茎段愈伤组织轻微褐化。2.2.3󰀁NAA的诱导效应。由表1、2可知,NAA对土人参叶片及茎段愈伤组织诱导效果较好。叶片愈伤组织为浅黄绿色、茎段愈伤组织为浅黄色。当NAA浓度为1.5mg/L时,其对叶片及茎段诱导效果均佳,诱导率可达87.5%、74.1%。安徽农业科学,JournalofAnhuiAgr.iSc.i2010,38(18):9435-9437责任编辑󰀁马树梅󰀁责任校对󰀁卢瑶表1󰀁2,4󰀁D、6󰀁BA、NAA对土人参叶片愈伤组织诱导的影响Table1󰀁Theeffectsof2,4󰀁D,6󰀁BA,NAAonthecallusinductionofT.paniculatum

浓度%mg/LConcentration2,4󰀁D诱导率%%Inductionrate生长势Growthvigor6󰀁BA诱导率%%Inductionrate生长势GrowthvigorNAA诱导率%%Inductionrate生长势Growthvi

gor0.571.9+++31.3+65.6++1.093.8++++43.7++84.4+++1.593.8++++46.9++87.5+++2.096.9++50.0++75.0++󰀁注:-死亡,+差,++一般,+++较好,++++旺盛。下表同。󰀁Note:-standsfordeath;+standsforbadgrowth;++standsforcommongrowth;+++standsforbettergrowth;++++standsforvigorousgrowth.Thesameasbelow.表2󰀁2,4󰀁D、6󰀁BA、NAA对土人参茎段愈伤组织诱导的影响Table2󰀁Theeffectsof2,4󰀁D,6󰀁BA,NAAonthecallusinductionofT.paniculatumstem

浓度%mg/LConcentration2,4󰀁D诱导率%%Inductionrate生长势Growthvigor6󰀁BA诱导率%%Inductionrate生长势GrowthvigorNAA诱导率%%Inductionrate生长势Growthvi

gor0.570.4++40.7++63.0++1.085.2++44.4++70.4+++1.5100.0++54.2++74.1+++2.0100.0+54.2+74.1++

2.3󰀁不同激素组合对土人参叶片愈伤组织的诱导效应󰀁茎段愈伤组织在单因素试验过程中,均表现出不同程度的褐化现象。以单因素为基础、土人参叶片为材料,研究了NAA+6󰀁BA、2,4󰀁D+6󰀁BA及NAA+2,4󰀁D+6󰀁BA3种激素组合对愈伤组织诱导及生长的影响。由表3可知,3种激素组合均可诱导出愈伤组织,且愈伤诱导率较高。NAA1.0mg/L+6󰀁BA1.0mg/L、2,4󰀁D1.0mg/L+6󰀁BA0.5mg/L及NAA0.5mg/L+2,4󰀁D1.0mg/L+6󰀁BA0.5mg/L对土人参叶片愈伤组织诱导率最高,均达到100%,但产生的愈伤组织颜色、质地有差异。NAA+6󰀁BA组合中,愈伤组织的颜色为浅黄绿色,结构较为紧密,培养后期愈伤组织出现绿色瘤状凸起,并出现芽的分化,此愈伤组织适合于植株再生及快速繁殖。2,4󰀁D+6󰀁BA组合中,愈伤组织为乳白色,疏松、生长势好,但含水量大。NAA0.5mg/L+2,4󰀁D1.0mg/L+6󰀁BA0.5mg/L组合产生的愈伤组织诱导为浅黄色,部分为浅黄绿色,比较其他组合较疏松、易碎,且生长势较好,可大量增殖。此愈伤组织可增殖继代培养后用于细胞悬浮培养。表3󰀁不同激素组合对土人参叶片愈伤组织诱导效应Table3󰀁TheeffectsofdifferentcombinationsofhormoneonthecallusinductionofT.paniculatumleaves

组合%mg/LCombinations诱导率Inductionrate%%6󰀁BA0.5mg/L6󰀁BA1.0mg/L6󰀁BA2.0mg