锌指蛋白的设计及其应用

《生命的化学））２００３年２３卷４期　文章编号：１０００－１３３６（２００３）０４－０２６８－０２　ＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２００３，２３（４）　●Ｍｉｎｉ　Ｒｅｖｉｅｗ　

锌指蛋白的设计及其应用　刘　娟朱旭东黄培堂　（军事医学科学院生物工程所，北京１０００７１）　

摘要：人工设计的锌指蛋白一般包括两个结构域：ＤＮＡ结合结构域和效应结构域。ＤＮＡ结合结构域主要采用对　ＤＮＡ序列特异性识别结合的ｃ：Ｈ：型锌指结构域，而功能结构域常常采用某些转录激活结构域、转录抑制结构域或　某些酶的活性结构域。这样进行设计的锌指蛋白就可以在特定的核酸序列上行使相应的功能，这对于目的基因的　表达调控及蛋白质与核酸的相互作用研究提供了新的思路。　关键词：ｃ：Ｈ：型锌指蛋白；基因表达调控；蛋白质与核酸的相互作用　中图分类号：Ｑ７８　

锌指结构最早由Ｍｉｌｌｅｒ等在１９８５年发现的，他　们发现在非洲爪蟾转录因子ＴＦⅢＡ分子中含有７～　１１个锌原子和９个重复单位，每个重复单位约有３０　个氨基酸残基…。ＴＦⅢＡ锌指序列为Ｃｙｓ·（Ｘａａ）２－４＂　Ｃｙｓ·（Ｘａａ）３·Ｐｈｅ·（Ｘａａ）５·Ｌｅｕ·（Ｘａａ）２·Ｈｉｓ·（Ｘａａ）３－５＂　Ｈｉｓ（Ｘａａ代表非保守氨基酸），构成一个调节识别结　构域，此类锌指为ｃ：Ｈ：型，即锌原子与２个保守的　Ｃｙｓ和两个保守的Ｈｉｓ残基形成配位键，其中１个芳　香族氨基酸和１个Ｌｅｕ残基高度保守。此后，人们　发现多种蛋白质序列中也存在这种结合锌的结构，　并将此结构命名为锌指。　在１９８９年Ｌｅｅ等通过ＮＭＲ揭示锌指立体结构　具有保守性：每个锌指均是由１对反平行的Ｂ折叠　和一个仅螺旋组成，每一个锌指结构都形成独立的　包含锌原子的小结构域，它通过２个保守的Ｈｉｓ和２　个Ｃｙｓ螯合一个锌原子，从而使结构更加稳定　Ｊ。　另外，对鼠转录因子Ｚｉ￣２６８、人ＧＬ／癌基因编码的蛋　白质和果蝇转录因子等锌指蛋白与各自所结合的　ＤＮＡ复合物的ｘ一射线晶体结构的研究表明：锌指通　过其仅一螺旋插入特异的ＤＮＡ双螺旋大沟与ＤＮＡ相　结合，并与ＤＮＡ中相邻的三碱基接触产生相互作　用，其主要的识别模式是锌指仅一螺旋中的三个氨基　酸残基与ＤＮＡ三个相邻碱基的一对一的识别　Ｊ。　１．锌指的设计和筛选　锌指结构是一个相对独立的调节结构域。在锌　指结构中，只有仅一螺旋中的几个氨基酸残基对ＤＮＡ　的特异性识别有作用。因此通过构建锌指的噬菌体　收稿日期：２００２·１２－２０　作者简介：刘娟（１９７２一），女，硕士，助研。　展示库，从中可筛选出与特定ＤＮＡ序列有高特异性　与高亲和力的锌指。　在１９９４年，Ｒｅｂａｒ和Ｃｈｏｏ就分别建立了鼠转录　因子Ｚｉ￣２６８的第二个锌指结构中仅．螺旋残基的随　机肽展示库　．５　（图１　Ａ），除了保守的四个残基之　外，随机化的位点共有７个，分别用随机三联体碱基　对进行了三轮筛选，得到了与不同三联体碱基对相　结合的６４个锌指序列，结果发现：仅．螺旋的三个主　要位（一１、＋３、＋６位）和一个辅助位＋２位与ＤＮＡ　的识别密切相关。　后来，Ｇｒｅｉｓｍａｎ等又发展一种逐步筛选法　（图１　Ｂ）：三个锌指中前两个锌指作为锚定，构建末　端锌指库，筛出与特定ＤＮＡ相识别的锌指，然后去　掉第一个锚定锌指，在筛出的锌指的基础上再构建　末端锌指库，再进行筛选，依此类推。这种方法考虑　到了锌指与锌指之间的相互作用并通过这种方法可　以找到与特定的较长ＤＮＡ序列相结合的多个锌指。　用这种方法Ｇｒｅｉｓｍａｎ等筛选得到与ＴＡＴＡ盒、ｐ５３、　核受体元件（ＮＲＥ）等特异性结合的锌指。但是这　种方法的缺点是要构建多个库，步骤比较繁琐。　最近，Ｉｓａｌａｎ等又建立起一种非常快速和简便　的方法称之为两部分法　（图１　Ｃ）。该方法充分考　虑到第二个锌指的仅一螺旋的第２位氨基酸残基与　第一个锌指仅一螺旋的第６位对ＤＮＡ的识别有协同　作用。以Ｚｉ￣２６８的三个锌指为基本框架，把三个锌　指拆分成两部分，建立了两个噬菌体展示库。从两　个库中筛选出对ＨＩＶ一１的－８０位到＋６０位启动子序　列特异性识别的７个三锌指，并据此设计了７个三　锌指肽，研究表明，这７个锌指肽与对应的ＤＮＡ序　列有很好的亲和力与特异性。　

维普资讯 http://www.cqvip.com ●小综述　Ａ　ＣＯＯＨ－ｌ旦Ｈ■■●Ｈ！　．Ｎ　５’—Ｇ　Ｃ　Ｇ—Ａ　Ｂ　Ｃ—Ｇ　Ｃ　Ｇ一３。　ＣＯＯＨ－［亘］．｜＿■—＿｛二亘　５’一４３　Ｃ　Ｇ—Ｄ　Ｅ　Ｆ—Ｇ　Ｃ　Ｇ—３＇　ＣＯＯＨ－［亘］．｜ｌ■—＿｛＝亘］　５’—Ｇ　Ｃ　Ｇ—Ｇ　Ｈ　ｌ—Ｇ　Ｃ　Ｇ一３’　ＣＯＯＨ叫旦Ｈ■■ｌ　里！卜】　５’—Ｇ　Ｃ　Ｇ—Ｄ　Ｅ　Ｆ－—Ｇ　Ｈ　Ｉ－３　《生命的化学）２００３年２３卷４期　ＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２００３，２３（４）　Ｂ　２６９·　Ｃ　Ｆ１　５’一Ａ　Ｂ　Ｃ－－Ｄ　Ｅ　Ｆ——Ｇ　Ｈ　Ｉ－－Ｇ　Ｃ　Ｇ－·—ｏ　Ｃ　Ｇ～３’　５’一Ａ　Ｂ　Ｃ—Ｄ　Ｅ　Ｇ．—Ｇ　Ｈ　ｌ—３＇　

ＣＯＯＨ一匝　——｝［匝］ＨＮ　ｃｏｏＨ啊｛＝卫二二］岫ｌＩＩ　匦　ＮＨｚ　５’一Ａ　Ｂ　Ｃ．一Ｄ　Ｅ　Ｆ—　Ｈ　ｌ一—Ｇ　Ｃ　Ｇ～３’　５’一Ｇ　Ｃ　Ｇ…Ｇ　Ｅ　Ｂ—Ｇ　Ｈ　Ｉ－一３’　

ｃｏｏｎ￣叠■　ＣＯＯＨ．　画　匝　ＮＩ－Ｉ２　５’－Ａ　ＢＣ—－Ｄ　Ｅ　Ｆ＿Ｇ　Ｈ　Ｉ－３。　５·－Ａ　Ｂ　Ｃ—．Ｄ　Ｂ　Ｆ＿Ｇ　Ｈ　Ｉ－３·　

ＣＯＯＨ＿｛二卫二二］－Ｉ置一—圃－Ｎ　ＣＯＯＨ一口匠二］Ｈ一—圆一Ｎ　５．一Ａ　Ｂ　Ｃ—．ｎ　Ｅ　Ｆ—　Ｈ　Ｉ－３·　５·一Ａ　Ｂ　Ｃ—Ｄ　Ｅ　Ｆ—　Ｈ　Ｔ一　

图１靶向结合ＤＮＡ序列锌指筛选策略——Ａ平行法；Ｂ逐步法；Ｃ两部分法　Ｆｎ：第ｎ个锌指；ｌｉｂｒａｒｙ：一个锌指库；１／２ｌｉｂ：半个锌指库　２．多锌指之间连接区的设计　许多天然锌指蛋白相邻锌指之间的连接区多　为一ＴＧＥＫＰ一序列，这种连接区序列能够在锌指一ＤＮＡ　复合物结构中很好地排列，突变研究表明它们对　ＤＮＡ识别起重要作用　］，因此，要设计多于三个锌　指的蛋白质就要另外考虑连接区的设计。现已有两　种连接区设计策略：（１）采用具有柔韧性的连接区，　使锌指对所结合ＤＮＡ亲和力与特异性有所提高　］。　（２）把天然转录因子的二聚化区域作为连接区，如　利用ＧＡＬ４的二聚化区域连接两个三锌指，大大增　加了锌指蛋白对ＤＮＡ的亲和力与特异性　。又有　研究根据计算机进行基于结构的模拟结果，将亮氨　酸拉链的二聚化区域ＧＣＮ４连接在Ｚｉｆ２６８的锌指２　和锌指３的Ｃ一末端，并应用噬菌体展示库进行优　化，从而获得的四锌指与迄今为止报道的六锌指有　相当的特异性¨¨。总之设计多锌指蛋白时应考虑　到锌指之间的连接区，这对于锌指蛋白对所识别的　ＤＮＡ的特异性与亲和力是很重要的。　３．人工锌指蛋白的应用　理论上，只要给锌指连上不同的功能结构域，就　可以在特定的核酸序列上行使相应的功能，但是目　前的研究主要涉及：人工设计的转录抑制子¨　、转　录激活子¨引、靶向ＤＮＡ的某些酶，例如人工限制性　内切酶等¨　。　３．１人工设计的转录抑制子　理论上，人工设计　的锌指蛋白可以通过以下方式抑制基因的转录：　（１）特异性的锌指与转录抑制结构域相连形成的融　合蛋白。（２）设计靶向转录区域的锌指蛋白，抑制　转录的延伸；（３）设计靶向转录起始区的人工锌指　蛋白，阻断或抑制转录起始复合物的装配；（４）靶向　目的基因转录增强子结合的区域设计的锌指蛋白，　从而抑制基因的转录。Ｈｅｒｃｈｅｎｒｏｄｅ等的研究也表　明，真核的转录抑制子ＫＲＡＢ与特异性的靶向ＨＩＶ　启动子的锌指融合而成的人工锌指蛋白能够有效地　

抑制病毒复制¨　。　３．２人工转录激活子　人工转录激活子主要通　过以下两种方式实现：一是锌指与转录激活结构域　连接形成融合蛋白，通过促进转录复合物的装配激　活基因的转录。二是通过与转录抑制子对基因上游　结合区的竞争，从而激活基因的转录。　在染色体水平上调节基因的表达，在以前是非　常困难的，但现在已有研究表明含锌指的人工转录　因子对内源的ｅｒｂＢ一２、ｅｒｂＢ一３等癌基因和Ｅｐｏ、血管　内皮生长因子基因Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）、植物基因ＡＰ３等都　具有抑制或激活作用¨　。如对ｅｒｂＢ－２特异性结合　的锌指与ＶＰ６４的转录激活结构域融合而成的人工　转录调节子对ｅｒｂＢ－２基因的表达有上调作用。而　锌指与ＫＲＡＢ的转录抑制结构域融合而成的人工　转录因子则对ｅｒｂＢ－２基因的表达有下调作用。而　它们对ｅｒｂＢ－３基因没有任何作用。同样，针对ｅｒｂＢ一　３设计的人工转录因子也对ｅｒｂＢ－２基因没有作用。　两种锌指识别的ｌ８个ＤＮＡ碱基中只有３个不同，　这说明锌指的调节作用是非常特异的。　３．３人工限制性内切酶　把多个锌指与限制性　内切酶ＦｏｋＩ的切割结构域相连，可以设计人工限制　性内切酶，研究表明构建人工限制性酶用以切开特　定序列ＤＮＡ双链是可行的，Ｋｉｍ等构建了人工限　制性酶／ＸＱＮＫ—ＦＮ，获得了有活性的融合蛋白，并对　其底物特异性进行了测定¨　。　４．展望　Ｃ：Ｈ　型锌指为ＤＮＡ序列特异性锌指蛋白的设　计提供了一个很好的框架，通过噬菌体展示技术和　计算机结构模拟以及锌指连接区的设计，可筛选设　计出与任意ＤＮＡ序列特异性结合的锌指，若连上功　能结构域可作为基因的转录激活因子或转录抑制因　子或作用于ＤＮＡ的酶。目前锌指蛋白的应用研究　多处于细胞水平阶段，而Ｒｅｂａｒ等构建的特异性结　合ＶＥＧＦ—Ａ的锌指蛋白，在ＣＤ—ｌ小鼠模型中激活　

维普资讯 http://www.cqvip.com